生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)：4-分光光度法

1、分光光度法內(nèi)容3分光光度法的原理1如何求被測(cè)組分的含量2分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)分光光度計(jì)的使用與注意事項(xiàng)43分光光度法概念：是利用物質(zhì)所特有的吸收光譜來(lái)鑒別物質(zhì)或測(cè)定其含量的一項(xiàng)技術(shù)。特點(diǎn)：靈敏度高、精確度高、操作簡(jiǎn)便、快速。對(duì)于復(fù)雜的組分系統(tǒng)，無(wú)須分離即可檢測(cè)出其中所含的微量組分的特點(diǎn)。分光光度法分類紫外分光光度法（200400nm）可見(jiàn)分光光度法（400760nm）紅外分光光度法（76010000nm）分光光度法的原理-1Lambert-Beer定律即：I0=IA+IR+IT（所用比色皿同質(zhì)料同規(guī)格，反射光強(qiáng)度為一定值） 故：I0 =IA+ ITI0IT入射光強(qiáng)度透過(guò)光強(qiáng)度LC液層厚度溶液濃

2、度IA反射光強(qiáng)度IR吸收光強(qiáng)度分光光度法的原理-2由式中可知：當(dāng)入射光強(qiáng)度I0為一定時(shí)，被吸收光強(qiáng)度IA愈大，則透過(guò)光強(qiáng)度IT愈小。即透過(guò)光強(qiáng)度減弱僅與有色溶液對(duì)光線的吸收有關(guān)。實(shí)驗(yàn)證明：溶液質(zhì)量濃度C愈大，深層厚度L愈厚，則溶液對(duì)光線吸收得愈多。分光光度法的原理-3它們之間的關(guān)系是：分光光度法的原理-4分光光度法的原理-5如何求被測(cè)組分的含量1.利用標(biāo)準(zhǔn)管計(jì)算測(cè)定物的含量2.利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測(cè)定物含量3.利用標(biāo)準(zhǔn)系數(shù)法求出待測(cè)溶液的濃度4.利用消光系數(shù)法求出待測(cè)溶液的濃度利用標(biāo)準(zhǔn)管計(jì)算測(cè)定物的含量 在相同條件下測(cè)定同種已知濃度（CS）標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度（AS），同時(shí)也測(cè)定末知濃度（CU）的吸光度

3、（AU），利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測(cè)定物含量 先配制一系列濃度由小到大的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別測(cè)出它們的吸光度。然后以各管吸光度（A）為縱坐標(biāo)，各管的濃度（C）為橫坐標(biāo)，在方格坐標(biāo)紙上作圖。 若被測(cè)物質(zhì)對(duì)光的吸收符合光的吸收定律，則必然得到一條通過(guò)原點(diǎn)的直線，即標(biāo)準(zhǔn)曲線，亦稱工作曲線。以后對(duì)末知濃度物質(zhì)測(cè)定時(shí)，無(wú)需再作標(biāo)準(zhǔn)管，據(jù)測(cè)定管吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可求得測(cè)定物的濃度。 標(biāo)準(zhǔn)曲線(濃度-吸光度曲線）0.20.80.40.6A 0 1 2 3 4 5根據(jù)測(cè)定管吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可求得測(cè)定物的濃度。 C分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)光源單色光器吸收池檢測(cè)器顯示鎢絲燈可見(jiàn)光源3501000nm氫燈氘燈紫外光源 2003

4、60nm棱鏡衍射光柵玻璃比色杯石英比色杯硒光電池光電管光電倍增管玻璃能吸收UV光，僅適用于可見(jiàn)光區(qū)。石英不吸收紫外光，適于紫外和可見(jiàn)光區(qū)。將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)的裝置。記錄裝置：訊號(hào)處理和顯示系統(tǒng)。V-1100型可見(jiàn)光分光光度計(jì) 0.000ATCFMODEPRINT0%T100%TA：吸光度T：透射比C：濃 度F：斜 率MODEATCF切換鍵PRINT確認(rèn)鍵0%T100%T校零、下降鍵校100、上升鍵V-1100分光光度計(jì)鍵盤控制的使用說(shuō)明 V-1100分光光度計(jì)操作步驟開(kāi)機(jī)，預(yù)熱30分鐘。轉(zhuǎn)動(dòng)波長(zhǎng)旋鈕，調(diào)所需波長(zhǎng)。按 鍵切換到T檔。將黑體放入光路中，合上蓋，按 鍵校零,T=000.0。開(kāi)蓋，將

5、參比液按空白液、標(biāo)準(zhǔn)液、待測(cè)液順序放入比色杯架上，拉動(dòng)比色架拉桿，將空白液放入光路中，合上蓋，按 鍵校T=100.0合上蓋，按 鍵切換到A檔 拉動(dòng)拉桿，將標(biāo)準(zhǔn)、待測(cè)液依次放入光路中 ，即可讀取其吸光度A值。重復(fù)3次，記錄3組數(shù)據(jù)。讀數(shù)后，將黑體放入光路中，開(kāi)蓋取出比色杯。將參比液倒回原試管中，清洗比色杯并倒扣在濾紙上晾干關(guān)機(jī)，蓋上防塵蓋，登記儀器使用登記本。MODE 0%MODE 100%V-1100分光光度計(jì) 使用注意事項(xiàng)注意防震、防潮、防光和防腐蝕。每臺(tái)儀器所配套的比色皿不能與其他儀器的比色皿單個(gè)調(diào)換。不可用手指或毛刷摩擦比色杯的透光面。盛裝參比液時(shí)，達(dá)到比色杯的3/4即可，不宜過(guò)多，以防溶液溢出。比色杯外壁如有液體，只能用濾紙沾去水份，再用擦鏡紙拭凈。注意比色杯的清潔，用后應(yīng)先用自來(lái)水沖洗，再用蒸餾水清洗。測(cè)試結(jié)束要及時(shí)登記，儀器有問(wèn)題及時(shí)報(bào)告。操作練習(xí)實(shí)驗(yàn)材料試劑： CuSO4標(biāo)準(zhǔn)液 （8mg/ml） 待測(cè)CuSO4溶液 蒸餾水器材：加樣槍、刻度吸管、試管、試管架 V-1100型可見(jiàn)光分光光度計(jì)操作練習(xí)步驟加入物 B S U蒸餾水 3ml CuSO4標(biāo)準(zhǔn)液 3ml CuSO4待測(cè)液 3ml分別取3支試管，做好標(biāo)記，按下表操作： 以空白管B調(diào)零，在690nm處，讀取標(biāo)準(zhǔn)管S和待測(cè)管U吸光度A值，記錄3組數(shù)據(jù)，取平均A值，代入公式計(jì)算。數(shù)