體液蛋白質(zhì)檢驗-天然藥物化學精品課程

1、體液蛋白質(zhì)檢驗-天然藥物化學精品課程一、血漿蛋白質(zhì)的組成、功能及分類 一血漿蛋白質(zhì)的組成 血漿蛋白質(zhì)是血漿固體成份中含量最多、組成復雜、功能廣泛的一類化合物。占血漿固體成份90左右，目前已經(jīng)研究的血漿蛋白質(zhì)有500多種，別離出的純品物200來種，除免疫球蛋白外，主要由肝細胞合成。第一節(jié) 概 述 二血漿蛋白質(zhì)的功能 1. 維持血漿膠體滲透壓 清蛋白。 2. 作為某些物質(zhì)的載體 如清蛋白能與多種物質(zhì)結(jié)合FA、膽紅素，而某些球蛋白具特異地運輸某些物質(zhì)的功能，運鐵蛋白、運皮質(zhì)醇蛋白。 3. 維持體液pH恒定 血漿蛋白PI一般都小于7.4是弱酸，一局部的弱酸鹽形式存在，構(gòu)成緩沖對。 4.免疫功能 血漿中

2、汗多具有免疫功能的球蛋白，主要由漿細胞合成，電泳時位于r區(qū)帶，如IgG、IgA、IgM、IgD、IgE，此外，還有具有免疫作用的非特異球蛋白，如補體。 5.凝血與纖溶作用 凝血與纖溶是一對矛盾的統(tǒng)一、凝血因子與纖溶因子絕大局部是血漿蛋白質(zhì)，它們促進血液凝固，防止血液流失和溶解血栓，防止重要臟器的動脈栓塞。 6.營養(yǎng)作用 血漿蛋白質(zhì)可分成AA，用于合成組織蛋白或氧化供能。 7.催化作用 血漿中有汗多酶類，其中局部在血漿中發(fā)揮作用，稱血漿功能性酶，如凝血酶原、纖溶酶原、銅藍蛋白、LPL、LCAT、腎素等。二、個別血漿蛋白質(zhì) 一前血蛋白pueallumun PA分子量5.4萬，由肝細胞合成，電脈時移

3、速較白蛋白快，位于其前方面得名，半壽期短12h，PA是一類運載蛋白，一種能與甲狀腺素結(jié)合，稱為甲狀腺結(jié)合蛋白，一種能與VitA結(jié)合，稱為VitA結(jié)合蛋白，常用測定方法是免疫化學方法， 【參考范圍】0.20.4g/L, 【臨床意義】急性炎癥，惡性腫瘤，肝硬化或腎炎時下降。 二白蛋白allumim, ALb分子量66458，由肝實質(zhì)細胞合成，半壽期1519天，是血漿中含量最多的蛋白質(zhì)，占4060，主要功能，維持血漿膠體滲透性，緩沖作用，運輸作用，營養(yǎng)作用，調(diào)節(jié)某些激素或藥物活性。 白蛋白可微量地通過腎小球，約0.04，但大局部被血小管重吸收。白蛋白的測定方法目前主要是溴甲酚綠BCG法。 【參考范圍

4、】3555g/L 【臨床意義】血漿白蛋白增高臨床少見，主要見于嚴重失水引起血液濃縮。血漿白蛋白降低臨床常見。合成障礙急、慢性肝炎。喪失過多，腎病綜合癥、慢性腎小球、腎炎、糖尿病、系統(tǒng)性斑狼瘡等。分解過多，營養(yǎng)不良，慢性胃腸道疾病。 三1-抗胰蛋白酶1AT或AAT，分子量5.5萬，pI4.8，含糖1012，電泳時位于1區(qū)帶，占90左右，由肝細胞合成，能抑制多種酶活性，尤其是蛋白酶，占血清中抑制蛋白酶活力的90左右，抑制作用有明顯的pH依賴性，在中性和弱堿性中活力最大。 AAT也是一種急性時相反響蛋白，主要功能是對抗多形核蛋白細胞吞噬作用時釋放的溶酶體蛋白水解酶。 AAT測定方法 目前主要采用免疫

5、化學法。 【參考范圍】成人0.832.0g/L， 【臨床意義】AAT下降見于胎兒呼吸窘迫癥，AAT缺陷所致的肺氣腫、肝硬化等。AAT上升見于急性炎癥、外科手術后，長期服用可的松藥物，妊娠及服用避孕藥物。 四1-酸性糖蛋白-AG或AAG分子量約4萬，含糖約45，pI2.73.5，主要由肝細胞合成，某些腫瘤組織也可合成。AAG是主要的急性相反響蛋白，急性炎癥時上升，與免疫防御功能有關。 AAG測定方法 使用AAG抗體，進行免疫散法或免疫比濁法檢測， 【參考范圍】0.252.0g/L 【臨床意義】主要作為急必時相反響的指標，風濕病、惡性腫瘤、心肌堵塞患者上升，營養(yǎng)不良、嚴重肝病下降。 五甲胎蛋白AF

6、P分子量6.57萬，pI4.75，含糖量4，主要在胎兒肝合成，妊娠1315周血清AFP含量最高，以后逐漸下降，出生時僅為頂峰期的1，周歲時接近成人水平，僅1030g/L，功能不詳。 AFP測定方法 火箭電泳放射自顯影；放射免疫法RIA；酶聯(lián)免疫吸附法ELISA靈敏度接近放免，且操作簡便，無放射污染，便于推廣。 【參考范圍】1030g/L 【臨床意義】AFP作為腫瘤標志物，對原發(fā)性肝癌的診斷很有價值，80以上原發(fā)性肝癌患者血清AFP上升，但無特異性，肺癌、胰腺癌，肝硬化患者血清AFP亦升高，此外，羊水AFP含量測定可用于胎兒產(chǎn)前監(jiān)測，AFP增高，提示胎兒畸形神經(jīng)管缺損、脊柱裂、無腦兒死胎。 六結(jié)

7、合球蛋白 Hp又名觸珠蛋白，是一種糖蛋白，主要由肝合成，電泳時位于2區(qū)帶，是一種急性時相反響蛋白，為兩對肽鏈組成的四聚體22。鏈有1和2兩種，其中1有兩種遺傳變異體。 Hp的主要功能與血漿中游離血紅蛋白結(jié)合，不可逆結(jié)合，并送至肝細胞內(nèi)降解，因此Hp在溶血后含量急劇下降。 血漿Hp測定方法 測定Hp-Hb復合物中過氧化物酶活性。在血漿中參加過量Hb，生成Hp-Hb復合物，凝膠層折法收復合物別離，測定結(jié)合的Hb。電泳法。免疫化學法。 【參考范圍】0.52.2g/L 【臨床意義】急性時相反響中血漿Hp上升，燒傷、腎病綜合征引起Alb喪失時Hp上升，血管內(nèi)溶血Hp下降。 七2-巨球蛋白2MG或AMG是

8、血漿中分子量最大的蛋白質(zhì)，分子量為62.580萬，含糖量8。 AMG由肝細胞與單核吞噬細胞系統(tǒng)合成，半壽期5天。 AMG最突出的特性能與多種分子和離子結(jié)合，特別是它能與不少蛋白水解酶結(jié)合而影響這些酶的活性，有選擇地保護某些蛋白酶活性的作用。 AMG測定方法 免疫化學法， 【參考范圍】1.254.10g/L 【臨床意義】在低蛋白血癥，AMG上升，妊娠、服用避孕藥時AMG上升。 八銅藍蛋白CER含銅的糖蛋白，分子量約1216萬，含糖量約10，因含銅而呈藍色，故名銅藍蛋白。主要由肝臟合成。 CER具有氧化酶活性，使血液中Fe2+氧化成Fe3+，故又稱亞鐵氧化酶。CER還起著抗氧化劑的作用。防止組織中

9、脂質(zhì)過氧化物和自由基的生成。 CER測定方法 免疫化學法或酶活性測定。 【參考范圍】0.20.5g/L。 【臨床意義】CER屬于急性時相反響蛋白。在感染、創(chuàng)傷和腫瘤時上升，Wilson病肝豆狀核變性CER下降。 九轉(zhuǎn)鐵蛋白TRF 血漿中主要含鐵蛋白質(zhì)，分子量7.7萬，含糖約6，由肝及網(wǎng)狀皮系統(tǒng)合成，半壽期7天。 主要運載由消化道吸收的鐵和RBC降解釋放的鐵，此外還可逆地結(jié)合多價金屬離子，如Ca、Zn、Cu等。 TRF測定方法 放免法、散射比濁法。 【參考范圍】2.54.3g/L。 【臨床意義】TRF在急性時反響中下降，如炎癥、惡性病變時、TRF、Alb、PA同時下降，慢性肝現(xiàn)營養(yǎng)不良亦下降，妊

10、娠、口服避孕藥，注射雌激素TRF上升。 十2-微球蛋白BMG 由淋巴細胞合成，分子量11800，pI5.7，存在于所有有核細胞的外表，特別是淋巴細胞和腫瘤細胞并由此釋放入血，半壽期107min。 BMG測定方法 常用放免法，ELISA法。 【參考范圍】1.02.5mg/L。 【臨床意義】主要用于監(jiān)測腎小管功能，特別是腎移植后，如有排異反響，BMG在尿中排出量上升，腎功能衰竭，炎癥、腫瘤血漿BMG上升。 十一C-反響蛋白CRP 是一種能結(jié)合肺炎雙球菌細胞壁C-多糖的蛋白質(zhì)，分子量11.514萬，五條肽鏈組成，肝細胞合成。CRP能激活補體，促進粒細胞、巨噬細胞的運動和吞噬，具有調(diào)理素樣作用。 CR

11、P測定方法 免疫擴散法，火箭免疫電泳法，ELISA法，放免法， 【參考范圍】8.0mg/L。 【臨床意義】作為急性時相反響的一個極靈敏指標 ，急性心肌梗死，創(chuàng)傷、感染、炎癥、外科手術、腫瘤浸潤迅速上升。 上述蛋白質(zhì)除PA、Alb、BMG外都屬于糖蛋白，含糖量最高的是AAG、45，除BMG外都主要由肝細胞合成。 三、疾病時的血漿蛋白質(zhì) 一炎癥、創(chuàng)傷 在炎癥、創(chuàng)傷、感染、心肌堵塞、腫瘤等情況下其血漿濃度會發(fā)生明顯改變的蛋白質(zhì)稱為急性時相反響蛋白acute phase reactants APR。主要包括AAG、AAT、Hp、CER、C3、C4、纖維蛋白原、CRP；PA、Alb、TRF。 二肝臟疾病

12、 血漿蛋白質(zhì)大多數(shù)由肝臟合成，因此肝臟疾病可導致多種血漿蛋白質(zhì)發(fā)生變化。 如乙肝活動期AAT，Hp、PA、Alb，特別是血漿PA的含量是肝功能損傷的敏感指標。 肝硬化時AAT、IgA、AMG，CER、CRP，而AAG、Hp、C3，PA、Alb、TRF。 三腎臟疾病 腎臟疾病可出現(xiàn)蛋白尿而導致血漿蛋白質(zhì)喪失，喪失的蛋白質(zhì)與其分子量有關。小分子量蛋白質(zhì)喪失最明顯，而大分子量的蛋白質(zhì)因肝細胞代償性地合成增加，絕對含量升高。所以血漿Alb、PA、AAG、AAT、TRF，而AMG、-LP、Hp，這稱為選擇性蛋白質(zhì)喪失。 當嚴重腎病是腎小球失去分子篩作用，可導致非選擇性蛋白質(zhì)喪失，表現(xiàn)為廣泛地低血漿蛋白質(zhì)

13、血癥。 生化檢驗中測定蛋白質(zhì)的方法很多，主要利用蛋白質(zhì)的分子組成，結(jié)構(gòu)或性質(zhì)進行。一、蛋白質(zhì)測定方法及評價 一測定蛋白質(zhì)特征元素氮 如凱氏定氮法，是測定蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法，1883年Kjeldahl首創(chuàng)，精密度準確度高，但操作復雜、費時、技術性強，不適合臨床常規(guī)檢測，一般用于標準血清的標定和校正。第二節(jié) 體液蛋白質(zhì)測定 二利用重復的肽鏈結(jié)構(gòu) 如雙縮脲法，1914年首創(chuàng)，操作簡便，重復性好，各種蛋白產(chǎn)生的顏色反響相近，但靈敏度較低，是目前臨床上測定總蛋白的常規(guī)方法。 三利用酪氨酸、色氨酸殘基與試劑的反響或紫外吸收特性 1. 酚試劑法 1921年，F(xiàn)olin首創(chuàng)，1951年改進成廣泛使用的Lowry

14、法，靈敏度高較雙縮脲法高100倍，主要用于微量蛋白質(zhì)檢測，但各種蛋白質(zhì)中酪氨酸含量不一，故準確性較差，試劑配制復雜且不穩(wěn)定，化學干擾大，目前臨床上僅用于粘蛋白測定。 2. 紫外吸收法 在280nm處有一吸收峰，快速、簡單，不需加任何試劑，保存蛋白質(zhì)活性，化學干擾大。 四利用與染料的結(jié)合能力 1. 考馬斯亮藍G-250結(jié)合蛋白法CBB法1976年Bradford應用于蛋白質(zhì)測定，操作簡便、快速、重復性好，靈敏度高，干擾因素少，但特異性不高，大分子肽分子量300以上，也參與反響，線性范圍窄，臨床上主要用于尿、腦脊液蛋白質(zhì)測定。 2. 溴甲酚綠結(jié)合清蛋白法BCG法 靈敏度高，血清用量少，操作簡便，但

15、特異性不高，局部球蛋白也能與之結(jié)合1-球蛋白、運鐵蛋白、觸珠蛋白等，是目前臨床上測定清蛋白的常規(guī)方法。 五利用沉淀后借濁度或光折射測定 如比濁法、折光測定法，方法簡便，試劑易得，但濁度的強弱受反響的條件影響大加試劑的方法、溫度等，結(jié)果準確性差，一般用于尿、腦脊液蛋白測定。 六電泳法 CAE、PAGE目前臨床上常用電泳技術，但只能測定各種蛋白質(zhì)的百分含量。 七利用免疫學特性 免疫化學法，特異性、靈敏度高，只能用于某種特異蛋白的測定。二、血清總蛋白的測定雙縮脲法 【原理】蛋白質(zhì)分子中的肽鏈在堿性條件下能與二價銅離子作用生成紫紅色的絡合物，產(chǎn)生的顏色強度在一定范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)的含量成正比，但雙縮脲反響

16、并非蛋白質(zhì)特有的顏色反響，分子中含二個以上肽鍵者均有此反響。 【試劑】雙縮脲試劑 未失結(jié)晶水的硫酸銅CuSO45H2O3.0g溶于500ml新鮮制備的蒸餾水或剛煮沸冷卻的去離子水中，加酒石酸鉀鈉NaKC4O4H64H2O9.0g，碘化鉀5.0g，待完全溶解后參加6mol/L NaOH溶液100ml，最后加蒸餾水至1L，置聚乙烯瓶內(nèi)蓋緊保存。 酒石酸鉀鈉的作用是絡合銅離子，維持銅離子在堿性溶液中的溶解度，碘化鉀防止兩價銅離子復原。 【參考范圍】6080g/L 【臨床意義】 一血清總蛋白增高 1. 血液濃縮 嚴重腹瀉 、嘔吐、高燒 2. 合成增加 主要見于球蛋白合成增加，多發(fā)性骨髓瘤。 二血清總蛋

17、白降低 1.血液稀釋 靜脈滴注過多低滲溶液，各種原因所引起的水鈉潴留。 2. 攝入缺乏和消耗增加 營養(yǎng)不良，慢性胃腸道疾病引起的消化吸收不良，消耗性疾病，結(jié)核病、甲亢、惡性腫瘤。 3. 合成障礙 主要見于肝臟疾患。 4. 蛋白質(zhì)喪失 嚴重燒傷，大量血漿滲出，腎病綜合癥。 三、血清清蛋白測定溴甲酚綠法 【原理】溴甲酚綠BCG在pH4.2的環(huán)境中，在有非離子去垢劑Brij-35存在時，可與清蛋白結(jié)合形成藍綠色復合物，顏色的深淺在一不定范圍內(nèi)與清蛋白含量成正比。 BCG與清蛋白結(jié)合的特異性較低，它不僅與Alb結(jié)合呈色，還可與其他蛋白質(zhì)呈色，其中1-球蛋白，TRF、Hp最明顯，但反響速度不同，Alb可

18、立即反響快反響，其他蛋白質(zhì)反響慢慢反響。 【試劑】 1. 10mmol/L BCG貯存液 BCG1.75g，溶于5ml 1 mol/L NaoH溶液中，加蒸餾水至250ml。 2. 0.5mol/L琥珀酸緩沖貯存液pH 4.0NaoH10g，琥珀酸56g，溶解于800ml蒸餾水中，用1mol/L NaoH溶液調(diào)pH至4.100.05加蒸餾水至1L。 3. 疊氮鈉貯存液 疊氮鈉40g溶于1000ml蒸餾水中。 4. Brij-35溶液 Brij-35 29g，加蒸餾水80ml，置80ml左右水溶使其溶解，然后加水至100ml。 5. BCG試劑 于IL容量瓶內(nèi)加蒸餾水400ml，琥珀酸緩沖貯存液100ml，BCG貯存液8ml，疊氮鈉貯存液2.5ml，Brij-35溶液2.5ml，加蒸餾水至刻度，配好的BCG試劑的pH應為4.150.05。 Brij-35可提高蛋白質(zhì)與染料的結(jié)合力及溶解度，提高呈色穩(wěn)定性，如無Brij-35可用吐溫-20代替，疊氮鈉有防腐作用?！緟⒖挤秶?555g/L?！九R床意義】四、血漿纖維蛋白原測定 血漿纖維蛋白原Fib是一種參與血液凝固的糖蛋白，又稱凝血因子，分子量34萬，在肝臟合成，電泳時位于球蛋白區(qū)帶。血漿纖維蛋白原測定對于出血性疾病和肝臟損傷的