一種新型海洋來(lái)源的蒽環(huán)類化合物D19抗腫瘤活性及機(jī)制研究

1、一種新型海洋泉源的蒽環(huán)類化合物D19抗腫瘤活性及機(jī)制研究袁潔,何振健,吳玨珩,朱勛【摘要】目的探究新型海洋源性蒽環(huán)類化合物d19的抗腫瘤作用及分子機(jī)制。要領(lǐng)接納四甲基二氮唑藍(lán)(tt)比色法、脫氧核糖核酸末了轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末了標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟法(tunel)、免疫印跡法(esternbltting)檢測(cè)d19對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系f-7和da-b-435生長(zhǎng)的影響及相干信號(hào)通路卵白的變革。結(jié)果d19對(duì)f-7、da-b-435的半數(shù)按捺濃度(i50)別離為4.01l/l和7.32l/l;d19具有有用誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用;esternbltting結(jié)果表現(xiàn)d19作用后細(xì)胞中的凋亡卵白如aspase9

2、以及卑劣的效應(yīng)卵白parp都產(chǎn)生裂解。結(jié)論從細(xì)胞水安然平靜分子程度證實(shí)新型海洋源性蒽環(huán)類化合物d19具有很強(qiáng)的抗乳腺癌活性，有大概生長(zhǎng)成為治療乳腺癌等其他實(shí)體腫瘤的先導(dǎo)化合物?！娟P(guān)鍵詞】海洋共生微生物;抗腫瘤;蒽環(huán)類化合物;人乳腺癌細(xì)胞;凋亡keyrds:arineensalirrganis;antineplasti;anthrayline;huanbreastanerells;apptsis恒久以來(lái)，惡性腫瘤不停嚴(yán)峻威脅著人類康健與生命。據(jù)天下衛(wèi)生構(gòu)造統(tǒng)計(jì)，全天下每年約有600萬(wàn)人被癌癥奪去生命，預(yù)計(jì)到2022年將升至1000萬(wàn)人1。此中乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，并且是實(shí)體瘤中應(yīng)用化

3、療最有用的腫瘤之一。因此探求有用的抗腫瘤化合物對(duì)付乳腺癌的治療具有緊張的意義。蒽環(huán)類化療藥物是如今臨床應(yīng)用普及的抗腫瘤一線化療藥物，尤其是乳腺癌化療中最常用的藥物，但是此類藥物仍存在骨髓按捺性、心臟毒性題目，以及腫瘤患者恒久利用出現(xiàn)的多耐藥征象，大大限定了其劑量進(jìn)步和臨床治療結(jié)果2-4。因此，有需要探求更好的同類化療交換藥物5。本文從分子水安然平靜細(xì)胞程度對(duì)海洋微生物泉源的蒽環(huán)類化合物d19抗人乳腺癌作用舉行了研究，為該化合物終極成為抗腫瘤藥物提供理論根據(jù)，并為進(jìn)一步開(kāi)拓高效低毒的抗腫瘤新型候選藥物奠基基矗1質(zhì)料與藥物人乳腺癌細(xì)胞系da-b-435、f-7為本實(shí)行室保存，并已在本實(shí)行室已頒發(fā)的

4、其他研究工程中利用6。d19由中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院林永成傳授提供7。種種化合物由二甲基亞砜(ds)(siga公司)制備保存母液。2要領(lǐng)2.1細(xì)胞造就人乳腺癌細(xì)胞系f-7、da-b-435造就于含5%()胎牛血清(hylne公司)、2l/ll-谷氨酰胺、0.1l/l非必須氨基酸、10l/lhepes(緩沖液)、100iu/l青霉素和100g/l鏈霉素的de完全造就基中(以上細(xì)胞造就相干試劑均為invitrgen/gib公司產(chǎn)物，購(gòu)自invitrgen公司)，置于375%()2孵箱中孵育造就。傳代時(shí)用含0.02%edta的0.05%()胰酶消化，以de完全造就基停頓消化。2.2四甲基偶氮唑藍(lán)

5、(tt)比色實(shí)行將f-7和da-b-435細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，按每孔1.0104個(gè)細(xì)胞別離接種至96孔細(xì)胞造就板中，置于375%2孵箱中孵育造就。24h后調(diào)換為含濃度依次為0、0.001、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4l/ld19的造就基，每個(gè)濃度均設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔，繼承造就48h后，顯微鏡下不雅察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)的變革。隨后每孔參加質(zhì)量濃度為5g/ltt(genvie公司，用1磷酸鹽緩沖液溶解，終質(zhì)量濃度5g/l，過(guò)濾除菌，分裝后-20避光保存)溶液20l，37作用4h，離心后棄上清液，參加ds150l，振蕩器振蕩10in充實(shí)溶解結(jié)晶，置酶標(biāo)儀上測(cè)定波長(zhǎng)為490n下的吸光度a值，按以下公式

6、盤(pán)算按捺率。細(xì)胞生長(zhǎng)按捺率(%)=(比較組均勻a值-實(shí)行組均勻a值)/比較組均勻a值100%。比較組即d19濃度為0的造就孔。利用半數(shù)按捺濃度(i50)盤(pán)算軟件blissssftare盤(pán)算i50，應(yīng)用spss軟件行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)闡發(fā)。2.3脫氧核糖核酸末了轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末了標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟法(tunel)染色將f-7細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，按每孔1.0105個(gè)細(xì)胞別離接種至已鋪有蓋玻片的24孔細(xì)胞造就板中，24h后用0.1l/ld19處置懲罰細(xì)胞。將50lterinaldexynuletidyltransferase(tdt)反響緩沖液加至細(xì)胞上，將造就板置于濕盒中于37避光反響60in。吸棄反響液，參加2s

7、s室溫作用15in，用pbs洗滌3次，每次5in。參加1g/lpi避光作用15in，再用pbs洗滌3次，每次5in。末了將蓋玻片上的細(xì)胞避光枯燥留宿，越日加anti-fade封片。在熒光顯微鏡下舉行不雅察并照相保存圖片，tunel染色陽(yáng)性熒光信號(hào)呈綠色，pi熒光信號(hào)呈赤色。tunel細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒為prega公司產(chǎn)物。2.4esternbltting檢測(cè)相干卵白網(wǎng)絡(luò)得到差異濃度梯度處置懲罰的細(xì)胞裂解液，按ba法舉行卵白定量(美國(guó)piere公司)。電泳后，轉(zhuǎn)膜到pvdf膜上，結(jié)實(shí)后常溫孵育3h或4留宿，鼠抗人aspase-9(美國(guó)bdbisienes公司);兔抗人parp(美國(guó)ellsign

8、alingtehnlgy公司);-tubulin(美國(guó)siga公司)，再孵育相應(yīng)二抗(美國(guó)piere公司)，末了在暗房用el顯色液(美國(guó)piere公司)顯色發(fā)光。3結(jié)果3.1d19對(duì)乳腺癌細(xì)胞的按捺作用d19對(duì)人乳腺癌細(xì)胞f-7和da-b-435的生長(zhǎng)按捺作用出現(xiàn)顯著的劑量依靠性，對(duì)低分化、高侵襲性的乳腺癌細(xì)胞da-b-435按捺率最高，對(duì)低致瘤性、對(duì)低轉(zhuǎn)移的人乳腺癌f-7按捺率其次(見(jiàn)圖1)。其作用48h的半數(shù)生長(zhǎng)按捺濃度(i50)別離為4.01l/l和7.32l/l。psa6691;s*2圖1d19對(duì)人乳腺癌細(xì)f-7和da-b-435作用48h的劑量-按捺結(jié)果figure1thedse-d

9、ependantprliferatininhibitineffetfd19inhuanbreastanerelllines,f-7andda-b-435eretreatediththeindiatednentratinsfr48hd19處置懲罰48h后，f-7、da-b-435細(xì)胞密度較比較組顯著低落，隨著藥物濃度的增長(zhǎng)，細(xì)胞密度進(jìn)一步明顯低落。在光學(xué)顯微鏡下放大200倍可不雅察細(xì)胞出現(xiàn)典范的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變革，貼壁細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)體積變孝變形、皺縮、變圓、脫落(見(jiàn)圖2、3)。psa6692;s*2圖2人乳腺癌f-7細(xì)胞經(jīng)差異濃度的d19作用48h后的形態(tài)學(xué)變革(200)figure2rphlgi

10、alhangesff-7huanbreastanerellstreatedithindiatednentratinsfd19after48h(200)3.2d19抗腫瘤活性的機(jī)制為進(jìn)一步明白d19導(dǎo)致人乳腺癌細(xì)胞f-7凋亡的分子機(jī)制，本文以時(shí)間梯度收f(shuō)-7的總卵白做esternbltting。隨著處置懲罰時(shí)間漸漸增長(zhǎng)，aspase-9和parp的前體漸漸淘汰，切割體漸漸增長(zhǎng)(見(jiàn)圖6)。-tubulin作為內(nèi)參。結(jié)果表現(xiàn)，d19作用后的f-7細(xì)胞通過(guò)激活aspase誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。psa6696;s*2圖6d19作用后人乳腺癌細(xì)胞f-7中aspase9和parp的表達(dá)程度變革figure6tie-

11、dependenteffetfd19naspase9andparpinf-74討論腫瘤的化療、放療及生物學(xué)療法是治療腫瘤的緊張本領(lǐng)，這些本領(lǐng)的重要機(jī)制在于利用化學(xué)藥物、放射線或免疫制劑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。比年來(lái)研究一些抗腫瘤藥物的作用機(jī)制時(shí)，除了研究其對(duì)dna等大分子化合物合成及其布局的影響外8，還研究其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，創(chuàng)造抗代謝藥物中的甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、tp-i酶按捺劑喜樹(shù)堿、tp-ii酶按捺劑鬼臼乙叉甙、阿霉素，以及順鉑、三尖杉酯堿、紫外線及-射線等，均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此以為細(xì)胞凋亡對(duì)腫瘤產(chǎn)生生長(zhǎng)起著緊張作用。假設(shè)對(duì)凋亡與抗腫瘤藥物之間的干系舉行深化研究，有大概改進(jìn)如

12、今腫瘤臨床藥物治療的結(jié)果。海洋作為一種特別的生長(zhǎng)情況(高鹽、高壓、缺氧、缺少陽(yáng)光等)，使海洋生物可以或許產(chǎn)生并積聚大量化學(xué)布局、生理活性與成效均非常特別的物質(zhì)，為此提供了一個(gè)富厚的新奇布局的化合物庫(kù)9-12。蒽環(huán)類化合物以阿霉素、表阿霉素為代表，具有抗腫瘤的生物活性13-14。本研究結(jié)果表白，從南海海洋共生微生物的次生代謝產(chǎn)物中挑選到的d19，具有蒽環(huán)類化合物的根本骨架。在體外實(shí)行中對(duì)人乳腺癌細(xì)胞表示出顯著的抗腫瘤活性。值得留意的是，其對(duì)低分化、高侵襲性的乳腺癌細(xì)胞da-b-435按捺率最高(i50=4.01l/l)，對(duì)低致瘤率、低轉(zhuǎn)移的人乳腺癌f-7按捺率稍低(i50=7.32l/l)。提示

13、d19按捺腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的分子機(jī)制中大概存在對(duì)惡性腫瘤特異性的靶點(diǎn)。如今以為，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡重要有aspase依靠途徑和非aspase依靠途徑，而以aspase依靠途徑為主，aspase激活有外源性和內(nèi)源性兩條途徑15-18。為了探究d19的抗腫瘤作用分子機(jī)制，用tunel染色法闡發(fā)了d19引起的細(xì)胞變革，創(chuàng)造該化合物能有用誘導(dǎo)人乳腺癌f-7細(xì)胞凋亡。同時(shí)esternbltting結(jié)果表現(xiàn)d19作用后，乳腺癌細(xì)胞中的凋亡卵白如aspase9及卑劣的效應(yīng)卵白parp都產(chǎn)生裂解，說(shuō)明d19可以或許誘導(dǎo)細(xì)胞通過(guò)aspase依靠的細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤的活性。這一結(jié)果為深化研究d19抗腫瘤活性的分子機(jī)制提供

14、了線索?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1天下衛(wèi)生構(gòu)造秘書(shū)處陳訴.防范和操縱癌癥r.第五十八屆天下衛(wèi)生大會(huì)，2022.2aadrl,jienj,paz-aresl,etal.prgressinthedevelpentandaquisitinfantianeragentsfrarinesuresj.annnl,2022,14(11):1607-1615.5孫燕,谷銑之.腫瘤綜合治療的原那么和理論j,中國(guó)腫瘤,1999,8:21-23.6lijun,zhangnu,sngli-bing,etal.astryteelevatedgene-1isanvelprgnstiarkerfrbreastanerprgressin

15、andverallpatientsurvivalj.linanerres,2022,14(11):3319-3326.8skladanskia,erstranddnarsslinkinginduedbyanthraylinesintuurellsj.bihepharal,1994,47(12):2269-2278.10sheuerpj.searineelgialphenena:heialbasisandbiedialptentialj.siene,1990,248(4952):173-177.11胡艷紅,張慶林,王正平.海洋微生物生物活性代謝物研究希望及技能題目j.科學(xué)技能與

16、工程,2022,4(2):160-163.12管華詩(shī),耿美玉,王長(zhǎng)云.21世紀(jì)中國(guó)海洋藥物j.中國(guó)海洋藥物,2000,76(4):44-47.13perhellete,agillj,huangx,etal.1,4-anthraquinne:anantianerdrugthatblksnulesidetransprt,inhibitsarleulesynthesis,induesdnafragentatin,anddereasesthegrthandviabilityfl1210leukeiellsinthesaenanlarrangeasdaunrubiininvitrj.antianerdr

17、ugs,2000,11(5):339-352.14kisg,sung,kangk,etal.da-125,anvelanthraylinederivativeshinghigh-affinitydnabindingandtpiseraseinhibitryativities,exertsyttxiityvia-junn-terinalkinasepathayj.anerhetherphara,2001,47(6):511-518.15iajh,sugiurah,shias.rphlgialhangesntributetappttielldeathandareaffetedbyaspase-3andaspase-6inhibitrsduringredseabreairidvirusperissiverepliatinj.virlgy,2022,322(2):220-230.16zhangy,bhavnanibr.glutaate-induedapptsisinneurnalellsisediatedviaaspase-dependentandindependentehanissinvlvingalpainandaspase-3prteasesasellasapptsisinduingfatr(aif)andthispress