微生物學(xué)：第五章微生物培養(yǎng)與生長(zhǎng)第三節(jié)

1、第三節(jié) 微生物生長(zhǎng)規(guī)律 微生物的生長(zhǎng)表現(xiàn)在微生物的個(gè)體生長(zhǎng)與群體生長(zhǎng)兩個(gè)水平上。 微生物個(gè)體生長(zhǎng)表現(xiàn)為個(gè)體質(zhì)量和體積的增加。 微生物群體生長(zhǎng)是以微生物細(xì)胞的數(shù)量或微生物群體細(xì)胞物質(zhì)量的增加作為生長(zhǎng)的指標(biāo)。 因而要了解微生物的生長(zhǎng)規(guī)律，就要了解微生物的個(gè)體生長(zhǎng)和群體生長(zhǎng)兩個(gè)方面。單細(xì)胞微生物個(gè)體生長(zhǎng)表現(xiàn)為細(xì)胞體積的增加 和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)含量的增加兩個(gè)方面, 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到一定時(shí)期，就分裂成為兩個(gè)子細(xì)胞。多細(xì)胞微生物個(gè)體生長(zhǎng)則反映在構(gòu)成個(gè)體的細(xì)胞數(shù)目增加和每個(gè)細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)兩個(gè)方面。一、微生物的個(gè)體生長(zhǎng) （一）微生物個(gè)體生長(zhǎng)的測(cè)定方法 細(xì)菌個(gè)體細(xì)胞一般太小，通常采用電子顯微鏡觀測(cè)，但無(wú)法觀測(cè)到整個(gè)生長(zhǎng)的動(dòng)

2、態(tài)過(guò)程。 真菌細(xì)胞相對(duì)體積較大，可采用顯微鏡觀測(cè)和記錄活細(xì)胞的整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程，如使用微分干涉相差顯微鏡、相差顯微鏡和熒光顯微鏡等進(jìn)行。 （二）細(xì)菌細(xì)胞的生長(zhǎng) 1、細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)的兩種類型： 根據(jù)細(xì)胞是否在分裂發(fā)生之前就啟動(dòng)新一輪DNA復(fù)制而將細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)分為快速生長(zhǎng)和慢速生長(zhǎng)兩種類型。 復(fù)制區(qū)圖 4-1 細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)分裂蛋白和 橫隔前體成分橫隔形成細(xì)胞分裂間隙期G染色體復(fù)制期C分裂期D2、細(xì)菌細(xì)胞分裂周期過(guò)程：間隙期G（gap phase）、染色體復(fù)制期C（chromosome replication phase）、分裂期D （division phase）3、細(xì)胞周期各期啟動(dòng)機(jī)制（以大腸桿菌為例

3、）： DNA復(fù)制啟動(dòng)：細(xì)胞必須達(dá)到某一閾值體積或起始物質(zhì)量。細(xì)胞分裂期D啟動(dòng)：只有當(dāng)細(xì)胞達(dá)到某一閾值長(zhǎng)度后才能進(jìn)行染色體分離，分裂成為兩個(gè)細(xì)胞。 DNA復(fù)制啟動(dòng)達(dá)到生物量閾值DNA復(fù)制與分離 達(dá)到長(zhǎng)度閾值分開的DNA拷貝細(xì)胞分裂過(guò)程啟動(dòng)時(shí)間（min）4、細(xì)胞壁的合成方式“背靠背合成” 方式：如鏈球菌和某些G+球菌 “分散合成”方式：大腸桿菌等G-桿菌 橫隔形成區(qū)圖4-2 細(xì)菌細(xì)胞壁的合成方式（三）酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)1、細(xì)胞二分裂生長(zhǎng)圖 4-3 粟酒裂殖酵母的二分裂生長(zhǎng)2、細(xì)胞出芽生長(zhǎng)圖 4-4 釀酒酵母的出芽生長(zhǎng)（四）絲狀真菌細(xì)胞的頂端生長(zhǎng)圖 4-6 絲狀真菌菌絲細(xì)胞頂端生長(zhǎng)模型圖4-5 Sapr

4、olegnia ferax 菌絲的頂端生長(zhǎng)0:001:00為什么要研究微生物群體生長(zhǎng)? 因?yàn)榻^大多數(shù)微生物個(gè)體微小，個(gè)體質(zhì)量和體積的變化不易觀察，所以常是以微生物的群體作為研究對(duì)象，以微生物群體細(xì)胞的數(shù)量或群體細(xì)胞物質(zhì)量的增加作為生長(zhǎng)的指標(biāo)。二微生物的群體生長(zhǎng)（一）微生物群體生長(zhǎng)的測(cè)定方法測(cè)定群體微生物細(xì)胞數(shù)目的增加測(cè)定群體微生物細(xì)胞物質(zhì)量的增加（1）總細(xì)胞計(jì)數(shù)法1、微生物細(xì)胞數(shù)目 的檢測(cè)方法 血球計(jì)數(shù)板法薄膜過(guò)濾丫叮橙染色熒光鏡檢法平皿菌落計(jì)數(shù)法（2）活細(xì)胞計(jì)數(shù)法薄膜過(guò)濾平皿計(jì)數(shù)法2、微生物生物量的測(cè)定方法（1）濕重法 收集微生物菌體，或?qū)⑽⑸锱囵B(yǎng)液離心，收集細(xì)胞沉淀物，然后稱重。（2）干

5、重法 將微生物菌體或離心得到的細(xì)胞沉淀物置100105的烘箱中干燥至水份去除，然后再稱重。（3）細(xì)胞成分含量法 如蛋白質(zhì)、還原糖、總糖、核酸等含量的測(cè)定。因?yàn)槊總€(gè)細(xì)胞成分的含量是一定的，單位體積培養(yǎng)液中微生物群體細(xì)胞數(shù)目越多，總的細(xì)胞成分的含量就越多。3、比濁法微生物生長(zhǎng)測(cè)定方法比較測(cè)定細(xì)胞數(shù)目方法特點(diǎn)與應(yīng)用總細(xì)胞數(shù)血球計(jì)數(shù)板法 較快速簡(jiǎn)便，但較費(fèi)時(shí)薄膜過(guò)濾染色法 快速簡(jiǎn)便，適于含菌數(shù)很低的空氣、水等中的總菌計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù) 平皿菌落計(jì)數(shù)法 簡(jiǎn)易價(jià)廉，但花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，不能立刻知道結(jié)果薄膜過(guò)濾平皿法 靈敏度高, 不用于高密度培養(yǎng)物，不能立刻知道結(jié)果測(cè)定物質(zhì)量比濁法 快速簡(jiǎn)便，敏感度低，適于不發(fā)酵液或

6、液體中的快速 總細(xì)胞數(shù)估計(jì)，但需事先標(biāo)定細(xì)胞濕重法 較為簡(jiǎn)便，但含水量不定，準(zhǔn)確度差細(xì)胞成分含量法 如測(cè)定蛋白質(zhì)、核酸、還原糖的含量等細(xì)胞干重法 較為費(fèi)時(shí)，易受顆粒雜質(zhì)干擾，敏感度低（二）無(wú)分支單細(xì)胞微生物的群體生長(zhǎng) 無(wú)分支單細(xì)胞微生物主要包括原核生物的細(xì)菌和真核生物的酵母菌，它們的群體生長(zhǎng)是以群體中微生物細(xì)胞數(shù)量的增加來(lái)表示的，因而其生長(zhǎng)速率就是指單位時(shí)間內(nèi)細(xì)胞數(shù)目或細(xì)胞生物量的增加。 細(xì)胞呈指數(shù)增長(zhǎng)示例特征:每經(jīng)歷一個(gè)代時(shí)，細(xì)胞的數(shù)目就增加1倍，呈指數(shù)增加，因而被稱為指數(shù)生長(zhǎng)，這就是無(wú)分支單細(xì)胞微生物的群體生長(zhǎng)特征。 1. 無(wú)分支單細(xì)胞微生物群體生長(zhǎng)的特征 細(xì)胞數(shù)目的對(duì)數(shù)與生長(zhǎng)時(shí)間呈正比直

7、線關(guān)系指數(shù)生長(zhǎng)公式：Nt= N02n lgNt=lgN0+nlg2 n = lgNt-lgN0 = lgNt-lgN0 lg2 0.301式中N0為起始細(xì)胞數(shù)目，Nt為指數(shù)生長(zhǎng)某個(gè)時(shí)刻t時(shí)的細(xì)胞數(shù)目，n為世代數(shù)。N0、Nt和t可由實(shí)驗(yàn)獲得，n可通過(guò)上式計(jì)算得出。 世代：由1個(gè)細(xì)胞分裂成為2個(gè)細(xì)胞的間隔被稱為世代。代時(shí)：就是一個(gè)世代所需的時(shí)間，因而也就是群體細(xì)胞數(shù)目擴(kuò)大1倍所需的時(shí)間，有時(shí)也被稱為倍增時(shí)間。 2、微生物生長(zhǎng)曲線1）延滯期延滯期特點(diǎn) 生長(zhǎng)速率等于零細(xì)胞合成新的成分 補(bǔ)充消耗的材料 適應(yīng)新的培養(yǎng)基或別的培養(yǎng)條件 細(xì)胞形態(tài)變大或變長(zhǎng) 對(duì)外界不良環(huán)境敏感影響延滯期長(zhǎng)短的因素與實(shí)踐意義 接

8、種齡: 對(duì)數(shù)期“種子”，延滯期較短； 延滯期或衰亡期“種子”,延滯期 較長(zhǎng)； 接種量： 接種量大，延滯期較短； 接種量小，延滯期較長(zhǎng)； 培養(yǎng)基成分:培養(yǎng)基成分豐富的， 延滯期較 短； 培養(yǎng)基成分與種子培養(yǎng)基一致, 延滯期較短；2）指數(shù)期特點(diǎn) 生長(zhǎng)速率最快，細(xì)胞呈指數(shù)增長(zhǎng) 生長(zhǎng)速率恒定 代謝旺盛，細(xì)胞成分平衡發(fā)展 群體的生理特性較一致影響指數(shù)期的因素 菌種： 不同菌種的代時(shí)差異極大 營(yíng)養(yǎng)成分：營(yíng)養(yǎng)越豐富，代時(shí)越短 營(yíng)養(yǎng)物濃度：影響微生物的生長(zhǎng)速率和總生長(zhǎng)量 培養(yǎng)溫度：影響微生物的生長(zhǎng)速率指數(shù)期的實(shí)踐意義 是代謝、生理研究的良好材料 是增殖噬菌體的最適宿主菌齡 是發(fā)酵生產(chǎn)中用作“種子”的最佳種齡

9、G+染色鑒定時(shí)采用此期微生物3）穩(wěn)定期特點(diǎn)： 活細(xì)胞總數(shù)維持不變，即新繁殖的細(xì)胞數(shù)與衰亡的細(xì)胞數(shù)相等，菌體總數(shù)達(dá)到最高點(diǎn)。細(xì)胞生長(zhǎng)速率為零細(xì)胞生理上處于衰老，代謝活力鈍化，細(xì)胞成分合成緩慢， G+染色發(fā)生變化。為什么細(xì)胞總數(shù)不再增加？ 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消耗不能滿足生長(zhǎng)需要 代謝廢物或有害物質(zhì)積累到抑制生長(zhǎng)水平 pH、氧化還原勢(shì)等物化條件越來(lái)越不適應(yīng)穩(wěn)定期的實(shí)踐意義 是發(fā)酵生產(chǎn)中以菌體為終產(chǎn)品的最佳收獲期； 某些代謝產(chǎn)物特別是次生代謝產(chǎn)物發(fā)生在此階段，某些細(xì)菌的芽孢也發(fā)生在此階段，故又稱作代謝產(chǎn)物合成期； 導(dǎo)致了連續(xù)培養(yǎng)原理的提出和工藝技術(shù)的改進(jìn)。4）衰亡期特點(diǎn)： 細(xì)胞以指數(shù)速率死亡， 有時(shí)細(xì)胞死亡速

10、率降低是由于抗性細(xì)胞的積累； 細(xì)胞變形退化，有的發(fā)生自溶，G+染色發(fā)生變化。影響衰亡期的因素及實(shí)踐意義與菌種的遺傳特性有關(guān): 有些細(xì)菌的培養(yǎng)經(jīng)歷所有的各個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期，幾天以后死亡, 有些細(xì)菌培養(yǎng)幾個(gè)月乃至幾年以后仍然有一些活的細(xì)胞；與是否產(chǎn)芽孢有關(guān)：產(chǎn)芽孢的細(xì)菌更易于幸存下來(lái)；與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和有毒物質(zhì)有關(guān)：補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)和能源，以及中和環(huán)境毒性，可以減緩死亡期細(xì)胞的死亡速率，延長(zhǎng)細(xì)菌培養(yǎng)物的存活時(shí)間。Fig.1. A time course of induced cultivation of Comamonas testosteroni JA1. The cultivation was conducted

11、 in a 250-mL flask containing 50mL of medium I with 1 % (w/v) of nicotinic acid(煙酸）). (), cell growth (OD610nm); (),6-hydroxynicotinic acid; and (), nicotinic acid were assayed with time.（三）絲狀微生物的群體生長(zhǎng) 絲狀微生物包括具分支的原核生物放線菌和真核生物絲狀真菌。 1. 絲狀微生物群體生長(zhǎng)的特征這類微生物在液體培養(yǎng)基中雖然也可以幾乎均勻分布的菌絲懸浮液的方式生長(zhǎng)（絲狀生長(zhǎng)）。但大多數(shù)情況下是以分散的沉淀

12、物方式在發(fā)酵液中出現(xiàn)（沉淀生長(zhǎng)），沉淀物形態(tài)從松散的絮狀沉淀到堆集緊密的菌絲球不等。 起始培養(yǎng)時(shí)菌絲體培養(yǎng)18小時(shí)后的菌絲體圖示絲狀真菌的沉淀生長(zhǎng)影響因素：接種體積的大小、接種物是否凝集、以及菌絲體是否易于斷裂等因素的綜合作用決定著絲狀微生物是絲狀生長(zhǎng)還是沉淀生長(zhǎng)。工業(yè)發(fā)酵意義：絲狀微生物在液體培養(yǎng)中的生長(zhǎng)方式在工業(yè)生產(chǎn)中很重要，因?yàn)樗绊懓l(fā)酵過(guò)程的通氣性、生長(zhǎng)速率、攪拌能耗及菌絲體與發(fā)酵液的分離難易等。2. 絲狀微生物群體生長(zhǎng)曲線絲狀微生物的群體生長(zhǎng)有著與單細(xì)胞微生物類似的規(guī)律。三、 連續(xù)培養(yǎng)（一）分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)分批培養(yǎng)，就是指將微生物置于一定容積的培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)生長(zhǎng)，最后一次收獲的

13、培養(yǎng)方式。連續(xù)培養(yǎng)，基本上說(shuō)來(lái)就是在一個(gè)恒定容積的流動(dòng)系統(tǒng)中培養(yǎng)微生物，一方面以一定速率不斷地加入新的培養(yǎng)基，另一方面又以相同的速率流出培養(yǎng)物（菌體和代謝產(chǎn)物），以使培養(yǎng)系統(tǒng)中的細(xì)胞數(shù)量和營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)保持恒定，即處于穩(wěn)態(tài)。 （二）連續(xù)培養(yǎng)類型 恒化培養(yǎng)裝置恒濁培養(yǎng)裝置四、微生物的同步生長(zhǎng)與同步培養(yǎng) 在微生物生長(zhǎng)研究中，常常需要了解單個(gè)細(xì)胞在生長(zhǎng)的不同階段（主要是指細(xì)胞分裂周期）所發(fā)生的生理生化變化，以便搞清微生物個(gè)體生長(zhǎng)的規(guī)律。這就需要使被研究的微生物群體處于相同的生長(zhǎng)階段，以便所得到的結(jié)果能反映出單個(gè)細(xì)胞在不同生長(zhǎng)階段的生理特征。同步生長(zhǎng)：就是指在培養(yǎng)物中所有微生物細(xì)胞都處于同一生長(zhǎng)階段，并都能同時(shí)分裂的生長(zhǎng)方式。同步培養(yǎng)法：就是能使培養(yǎng)物中所有微生物細(xì)胞都處于相同的生長(zhǎng)階段的培養(yǎng)方法。(一) 誘導(dǎo)法誘導(dǎo)法：是采用物理、化學(xué)因子使微生物細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)行到某個(gè)階段而停下來(lái)，使先期到達(dá)該階段的微生物細(xì)胞不能進(jìn)入下一生長(zhǎng)階段，待全部群體細(xì)胞都到達(dá)該生長(zhǎng)階段后，再除去該因子，使全部群體細(xì)胞同時(shí)進(jìn)入下一個(gè)生長(zhǎng)階段，以達(dá)到誘導(dǎo)微生物細(xì)胞同步生長(zhǎng)的目的。 例，