第八章 酶催化

1、第八章 酶催化章節(jié)分配一、酶的結(jié)構(gòu)和分類二、酶的分離與純化三、酶活力測定四、酶作用動(dòng)力學(xué)五、酶的抑制作用六、pH值和溫度對(duì)酶作用的影響七、酶的作用機(jī)制八、應(yīng)用酶學(xué)九、酶法制備L-氨基酸十、生物催化反應(yīng)器十一、生物有機(jī)化學(xué)與生物催化 生物催化的定義：是利用生物催化劑(主要是酶或微生物)來改變(通常是加快)化學(xué)反應(yīng)速度的作用。生物催化轉(zhuǎn)化的分類：(1)發(fā)酵：用活細(xì)胞將原材料(如糖、淀粉或甲醇)轉(zhuǎn)化成更復(fù)雜的目標(biāo)產(chǎn)物。(2)前體發(fā)酵：發(fā)酵過程中添加前體物質(zhì)，并由活細(xì)胞將其轉(zhuǎn)化成目標(biāo)產(chǎn)物。(3)生物轉(zhuǎn)化：用酶或靜息細(xì)胞經(jīng)過一系列步驟，將前體轉(zhuǎn)化成目標(biāo)產(chǎn)物。(4)酶催化：提取粗酶或部分純化的酶

2、，將底物轉(zhuǎn)化成目標(biāo)產(chǎn)物。生物催化的產(chǎn)生與發(fā)展：遠(yuǎn)古時(shí)代酒的釀造：酵母發(fā)酵的產(chǎn)物，是細(xì)胞內(nèi)酶作用的結(jié)果；飴糖的制作：用麥曲含有的淀粉酶將淀粉講解為麥芽糖；豆類做醬：在霉菌蛋白酶作用下，豆類蛋白質(zhì)水解得豆醬和豆鼓，壓榨后制得醬油。1878年，Kuhne第一次提出“酶”(Enzyme)的概念,意為“在酵母中”(in yeast)；1894年，Emil Fischer發(fā)現(xiàn)了酶對(duì)底物(酶作用的物質(zhì))的專一性現(xiàn)象,提出了“鎖和鑰匙”模型；酶晶體的獲得，才認(rèn)識(shí)到酶是蛋白質(zhì)，是由酰胺鍵連接的氨基酸組成；1926年，Sumner從刀豆中得到脲酶結(jié)晶，催化尿素水解,產(chǎn)生CO2和NH3；1967年，絲氨酸蛋白酶的發(fā)

3、現(xiàn)，它專門用于洗滌劑；1992年，用于生產(chǎn)酶的克隆技術(shù)的誕生；最近發(fā)現(xiàn)除了“經(jīng)典”酶以外，某些生物分子也具有催化活性。1982年Cech小組發(fā)現(xiàn)，四膜蟲的rRNA(核糖體核糖核酸)前體能在完全沒有蛋白質(zhì)的情況下進(jìn)行自我加工，催化得到成熟的rRNA產(chǎn)物。這就是說，RNA本身就是生物催化劑。20世紀(jì)80年代以來，基因工程技術(shù)用于酶學(xué)研究得到高度重視。應(yīng)用DNA重組技術(shù)可以生產(chǎn)出高效能、高質(zhì)量的酶產(chǎn)品，用定點(diǎn)突變法在指定位點(diǎn)突變，可以改變酶的催化活性與專一性。生物催化研究的重要意義：(1)生物催化與生物轉(zhuǎn)化是與生命活動(dòng)及人類發(fā)展關(guān)系最為密切的自然規(guī)律之一；(2)基于生物催化與生物轉(zhuǎn)化的物質(zhì)加工新模式

4、是人類發(fā)展的必然趨勢；(3)生物催化的獨(dú)特優(yōu)勢可以促進(jìn)傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的升級(jí)改造；(4)生物催化對(duì)于我國的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和安全具有戰(zhàn)略意義。生物催化的主要方式：生物催化幾乎能應(yīng)用于所有化學(xué)反應(yīng)，例如氧化反應(yīng)、羥基化反應(yīng)、脫氫反應(yīng)、還原反應(yīng)、水解反應(yīng)、?；磻?yīng)等。生物催化材料有酶、微生物菌體、動(dòng)植物的組織及細(xì)胞。在手性合成中應(yīng)用較多的是水解酶、氧化-還原酶以及面包酵母等微生物。生物催化的方式有添加前體發(fā)酵法、游離酶法、靜息細(xì)胞法、固定化酶法、固定化細(xì)胞法。可在水相、有機(jī)相和水-有機(jī)溶劑雙相等系統(tǒng)中進(jìn)行。生物催化反應(yīng)的特點(diǎn)：(1)高催化效率(2)高專一性(3)酶活性受一些化合物調(diào)控  酶催

5、化能力舉例底物催化劑溫度(K)速度常數(shù)*脲(水解)H+脲酶3352947.4×10-75.0×1052H2O2" 2H2O+O2Fe2+過氧化氫酶295295563.5×107*單位：(mol·L-1)-1·s-1NH3的合成：在植物中通常是25和中性pH下由固氮酶催化完成，酶是由兩個(gè)解離的蛋白質(zhì)組分組成的一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，其中一個(gè)含金屬鐵，另一個(gè)含鐵和鉬，反應(yīng)需消耗一些ATP(三磷酸腺苷)分子；工業(yè)上由氮和氫合成氨時(shí)，需在700-900K、10-90MPa下，還要有鐵及其他微量金屬氧化物作催化劑才能完全反應(yīng)。酶催化的最適條件幾乎都為溫

6、和的溫度和非極端pH值。專一性：有些酶專一性很低(鍵專一性),如肽酶、磷酸(酯)酶、酯酶,可以作用很多底物, 只要求化學(xué)鍵相同,例如它們可分別作用肽、磷酸酯、羧酸酯;具有中等程度專一性的為基團(tuán)專一性,如己糖激酶可以催化很多己醛糖的磷酸化;大多數(shù)酶呈絕對(duì)或幾乎絕對(duì)的專一性，它們只催化一種底物進(jìn)行快速反應(yīng)。調(diào)節(jié)性：酸濃度的調(diào)節(jié):誘導(dǎo)或抑制酶的合成,調(diào)節(jié)酶的降解;抑制劑的調(diào)節(jié):酶的活性受到大分子抑制劑或小分子抑制劑抑制,從而影響活力;金屬離子的調(diào)節(jié):有些酶需要K+活化,但Na+不能活化這些酶,有時(shí)還有抑制作用。生物催化研究的新進(jìn)展：1.生物催化一進(jìn)入傳統(tǒng)的化工領(lǐng)域，就給原料來源、能源消耗、經(jīng)濟(jì)效益、

7、環(huán)境保護(hù)等方面帶來了根本性的變化。2.作為生物技術(shù)第三次浪潮標(biāo)志的生物催化技術(shù)已成為發(fā)達(dá)國家的重要科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略，以生物催化技術(shù)為核心的生物制造產(chǎn)業(yè)正以指數(shù)規(guī)律加速發(fā)展。3.目前，美國在酶催化劑及手性化合物合成方面已處于領(lǐng)先地位，其生物催化制造的化學(xué)品產(chǎn)值已超過生物醫(yī)藥的產(chǎn)值。 所以，新的生物催化劑是21世紀(jì)可持續(xù)發(fā)展的化學(xué)加工業(yè)的必需工具。到2020年通過生物催化技術(shù)，化學(xué)加工業(yè)的原料、水資源及能量消耗將各降低30，減少污染物排放和污染擴(kuò)散30。生物催化技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域： 工業(yè)部門應(yīng)用領(lǐng)域成熟程度及應(yīng)用情況石油煉制生物脫硫工業(yè)示范大宗化學(xué)品乙醇/甘油已成熟/工業(yè)示范高分子聚合物可

8、生物降解聚合物工業(yè)應(yīng)用特殊有機(jī)中間體手性中間體工業(yè)應(yīng)用醫(yī)藥醫(yī)用蛋白/手性藥物工業(yè)應(yīng)用農(nóng)用化學(xué)品生物殺蟲劑工業(yè)應(yīng)用日用化學(xué)品乳酸/檸檬酸接近成熟/工業(yè)應(yīng)用環(huán)境保護(hù)廢物處理技術(shù)開發(fā)中 現(xiàn)狀：1996年生物催化劑已占世界催化劑90億美元市場的11%；美國EBC成功開發(fā)了一種生物脫硫的新工藝；我國：生物催化丙烯腈制丙烯酰胺、有機(jī)廢水發(fā)酵法制氫技術(shù)、生物發(fā)酵法制造甘油已建成投產(chǎn)或通過中試驗(yàn)證。 §1 酶的結(jié)構(gòu)和分類蛋白質(zhì)是構(gòu)成人體的基礎(chǔ)物質(zhì)、酶是蛋白質(zhì)、酶由長鏈氨基酸組成、酶結(jié)構(gòu)的4個(gè)層次：       

9、    溶菌酶(lysozyme)的一級(jí)結(jié)構(gòu)圖：             酶的二級(jí)結(jié)構(gòu):-螺旋和-褶片              蛋白溶菌酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)圖：           &#

10、160;  溶菌酶部分四級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖：            氨基酸的排序決定酶的功能：            酶的分類(編號(hào)的第一個(gè)數(shù)字)：表示這個(gè)酶屬于哪一大類氧化還原酶：用于將電子從一個(gè)分子轉(zhuǎn)移到另一個(gè)分子;轉(zhuǎn)移酶：催化原子基團(tuán)從一個(gè)分子轉(zhuǎn)移到另一個(gè)分子;水解酶：催化底物與水之間的反應(yīng),以及將水結(jié)合到某些分子上;裂解酶：從底物上移去

11、一個(gè)基團(tuán);異構(gòu)酶：催化原子基團(tuán)從一個(gè)位置轉(zhuǎn)移到另一個(gè)位置;連接酶：利用共價(jià)鍵將分子連接到一起.編號(hào)的第二個(gè)數(shù)字：表示在類以下的大組氧化還原酶：表示氧化反應(yīng)供體基團(tuán)的類型；轉(zhuǎn)移酶：表示被轉(zhuǎn)移基團(tuán)的性質(zhì)；水解酶：表示被水解鍵的類型；裂解酶：表示被裂解鍵的類型；異構(gòu)酶：表示異構(gòu)作用的類型；連接酶：表示生成鍵的類型.編號(hào)的第三和第四個(gè)數(shù)字：編號(hào)的第三個(gè)數(shù)字：表示大組下面的小組，各個(gè)數(shù)字在不同類別，不同大組中都有不同的含義；編號(hào)的第四個(gè)數(shù)字：是小組中各種酶的流水編號(hào).例如：氧化還原酶的第二個(gè)數(shù)字E.C.1.（氫或電子供體）醇(RRCHOH) 1；醛或酮(RRC=O) 2； RRCHCHRR 3；伯胺RC

12、HNH2 4；仲胺RRCHNH 5；NADH或NADPH 6。氧化還原酶的第三個(gè)數(shù)字E.C.1.16.（氫或電子受體）NAD+或NADP+ 1； Fe3+(如細(xì)胞色素) 2；O2 3； 其他未分類的受體 99。NAD+(NADP+)：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (磷酸)轉(zhuǎn)移酶的第二個(gè)數(shù)字E.C.2.（轉(zhuǎn)移的基團(tuán)）含一個(gè)碳原子的基團(tuán) 1；醛基或酮基 2；?；?3；糖基 4；含磷基團(tuán) 7。轉(zhuǎn)移酶的第三個(gè)數(shù)字，例如：E.C.2.1.1 轉(zhuǎn)移甲基的酶類E.C.2.1.2 轉(zhuǎn)移羥甲基的酶類E.C.2.1.3 轉(zhuǎn)移羧基的酶類E.C.2.4.1 轉(zhuǎn)移己糖基的酶類E.C.2.1.4 轉(zhuǎn)移戊糖基的酶類水解酶的第二個(gè)數(shù)

13、字E.C.3.（水解的鍵）酯 鍵 1；糖苷鍵 2；肽 鍵 4；肽鍵以外的C-N鍵 5。水解酶的第三個(gè)數(shù)字，例如：E.C.3.1.1 水解羧酸酯的酶類E.C.3.1.2 水解硫代酯的酶類E.C.3.1.3 水解磷酸單酯的酶類E.C.3.1.4 水解磷酸二酯的酶類裂解酶的第二個(gè)數(shù)字E.C.4.（裂解的鍵）CC 1； CO 2； CN 3； CS 4。裂解酶的第三個(gè)數(shù)字（以CC裂解酶為例，移去基團(tuán)為）E.C.4.1.1 羧基(即CO2)E.C.4.1.2 醛基(CH=O)E.C.4.1.3 酮羧基(-OOC-C=O)異構(gòu)酶的第二個(gè)數(shù)字E.C.5.（反應(yīng)類型）消旋和差向異構(gòu) 1； 順式-反式異構(gòu) 2；

14、分子內(nèi)氧化還原酶類 3； 分子內(nèi)的轉(zhuǎn)移反應(yīng) 4。異構(gòu)酶的第三個(gè)數(shù)字，例如：底物E.C.5.1.1 氨基羧E.C.5.1.2 羥基羧酸E.C.5.1.3 糖類連接酶的第二個(gè)數(shù)字（合成的鍵）CO 1； CS 2； CN 3； CC 4連接酶的第三個(gè)數(shù)字，例如：進(jìn)一步說明合成的鍵E.C.6.3.1 羧酸-氨(胺)連接酶類酰胺合成酶類E.C.6.3.2 羧酸-氨基酸連接酶類肽合成酶類 §2 酶的分離與純化酶的純化獨(dú)有的特點(diǎn)：特定的一種酶在細(xì)胞中的含量很少，給純化帶來了困難；酶可以通過測定活力的方法加以跟蹤，能迅速找出純化過程的關(guān)鍵所在。酶的純化過程包括下列步驟：  

15、60;       建立一個(gè)適當(dāng)?shù)臏y活方法測定酶活力方法要求高靈敏性、高準(zhǔn)確性、是否經(jīng)濟(jì)、方法簡單。          酶源選材要以含酶豐富、取材方便、經(jīng)濟(jì)為原則例如，在分離純化動(dòng)物Cu、Zn-SOD（超氧化物歧化酶）時(shí)，一般以動(dòng)物血球?yàn)樵?；Mn-SOD主要存在于線粒體中，所以肝、腎臟適宜作原材料；利用動(dòng)植物細(xì)胞體外大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，可獲得極為珍貴的原材料（如人參細(xì)胞、某些昆蟲細(xì)胞等），用于酶的分離純化；利用基因工程重組DNA技術(shù)，使某些在細(xì)胞中含量極微的

16、酶的純化成為可能。          酶的提取除在體液中提取酶或胞外酶外，一般是將含目的酶的生物組織破碎，促使酶增溶溶解，最大程度的提高抽提液中酶的濃度。生物組織的破碎方法有：機(jī)械法、超聲波法、凍融法、滲透壓法、酶消化法。超聲波法：細(xì)菌和酵母細(xì)胞能得到很好的破碎；問題：超聲空穴局部過熱引起酶活性喪失，所以時(shí)間應(yīng)盡可能短，容器周圍以冰浴處理。凍融法：生物組織經(jīng)冰凍后，細(xì)胞胞液結(jié)成冰晶，使細(xì)胞壁脹破；簡單易行，但效率不高，需反復(fù)幾次才能達(dá)到破壁效果；若凍融時(shí)間過長，還應(yīng)注意胞內(nèi)蛋白酶作用引起的后果，一般需在凍融液中加入

17、絡(luò)合劑EDTA等蛋白酶抑制劑以防破壞目的酶。滲透壓法：是破碎細(xì)胞最溫和的方法之一，細(xì)胞在低滲溶液中溶脹破碎；此法對(duì)具有堅(jiān)韌的多糖細(xì)胞壁的細(xì)胞，如植物、細(xì)菌和霉菌不太適用。酶消化法：利用溶菌酶、蛋白水解酶、糖苷酶對(duì)細(xì)胞膜或細(xì)胞壁的酶解作用，使細(xì)胞崩解破碎；酶消化法常與其他破碎方法聯(lián)合使用，如在大腸桿菌凍融液中加入溶菌酶就可大大提高破碎效果。破碎生物組織一般在適當(dāng)?shù)木彌_溶液中進(jìn)行。典型的抽提液由以下幾部分組成：抽提液=離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)劑+pH緩沖劑+溫度效應(yīng)劑蛋白酶抑制劑防氧化劑重金屬絡(luò)合劑增溶劑          酶的提

18、純：常用的提純方法如下。 性 質(zhì)方 法溶解度改變離子強(qiáng)度、改變pH、溫度、改變介電常數(shù)電荷極性離子交換層析、色譜聚焦、電泳、等電聚焦大小或重量離心分離、透析超濾、凝膠過濾親和部位親和層析、免疫吸附層析、共價(jià)層析           酶的純度檢驗(yàn)酶純化的目標(biāo)是使酶制劑具有最大的催化活性和最高純度，以下幾種方法用于檢驗(yàn)這些指標(biāo)：1. 酶純度的檢驗(yàn)2. 酶催化活性的檢驗(yàn)3. 酶活性部位滴定§3 酶活力測定在酶作用下化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行的速度，就代表酶的活力；酶活力的測定，實(shí)質(zhì)上就是一個(gè)測定為酶所催化

19、的反應(yīng)速度問題。在實(shí)際測定過程中，為了保證測得的是初速度，往往使底物濃度足夠大，把酶完全飽和，這樣整個(gè)酶反應(yīng)對(duì)于底物來說是零級(jí)反應(yīng)，而對(duì)于酶來說是一級(jí)反應(yīng)，這樣測得的初速度可以比較可靠地反映酶的含量。酶活力的測定方法：中止法：是在恒溫反應(yīng)系統(tǒng)中進(jìn)行酶促反應(yīng)，間隔一定的時(shí)間，分幾次取出一定容積的反應(yīng)液，使酶即刻停止作用，然后分析產(chǎn)物的生成量或底物的消耗量；連續(xù)法：不需取樣中止反應(yīng)，而是基于反應(yīng)過程中光譜吸收、氣體體積、酸堿度、溫度、粘度等的變化用儀器跟蹤監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)行的過程，算出酶活性。一般的連續(xù)法包括：光譜吸收法：主要是指分光光度法和熒光法。     &#

20、160;        分光光度法是利用反應(yīng)物和產(chǎn)物在紫外和可見光部分的光吸收不同，選擇一適當(dāng)?shù)臐舛?，連續(xù)測定出反應(yīng)過程中光吸收的變化。該法適用于反應(yīng)速度較快的酶；              熒光法是具有熒光性的化合物吸收了某一波長的光后發(fā)射出更長波長的光。只要酶反應(yīng)的底物或產(chǎn)物之一具有熒光，測定熒光的變化就可表示出酶反應(yīng)的速度。電化學(xué)法：溶液的電勢取決于被測物質(zhì)的濃度和性質(zhì)，采用這一原理制成的離子選擇性電

21、極，如pH電極可測定酶反應(yīng)過程中反應(yīng)液pH的變化，從而得知參與反應(yīng)的酶的活力；實(shí)際上，H+變化的酶促反應(yīng)需要不斷加入酸或堿來恒定溶液的pH值，才能使酶活力不發(fā)生變化。量氣法：在酶反應(yīng)底物或產(chǎn)物之一為氣體時(shí)，可通過測量反應(yīng)系統(tǒng)中氣相的體積或壓力的改變，計(jì)算出氣體釋放或吸收的量；根據(jù)氣體變化和時(shí)間的關(guān)系，即可求得酶反應(yīng)速度，準(zhǔn)確程度較光譜吸收法低。量熱法：由于在反應(yīng)過程中有反應(yīng)熱的變化，用非常靈敏的量熱計(jì)可以測定酶反應(yīng)速度；量熱法靈敏、無干擾，且很通用。旋光法：在某些酶催化反應(yīng)中，底物和產(chǎn)物的旋光有所不同，這時(shí)就可以根據(jù)旋光的變化來跟蹤酶反應(yīng)過程；在某些情況下，可通過形成絡(luò)合物來提高旋光度。酶活力

22、的定義與表示方法：國際酶學(xué)委員會(huì)曾規(guī)定：一分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化一個(gè)微摩爾底物所需的酶量為一個(gè)國際單位IU；規(guī)定反應(yīng)必須在25，在具有最適底物濃度、最適緩沖液離子強(qiáng)度和pH的系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行；EC推薦一個(gè)新的酶活力國際單位kat:一個(gè)kat單位定義為:每秒鐘能使一個(gè)摩爾底物轉(zhuǎn)化的酶量,則1kat=6×107IU。酶反應(yīng)的分析：              總反應(yīng)           &#

23、160;  部分反應(yīng)一個(gè)由特定的酶所催化的化學(xué)反應(yīng)，當(dāng)寫作計(jì)量化學(xué)方程式時(shí)，就稱為總反應(yīng)（Overall reaction）；從底物A與B生成產(chǎn)物P與Q的總反應(yīng)，可寫作：E + A + B = E + P + Q在適當(dāng)條件下（如缺少一種底物），那么總反應(yīng)的一部分就能被觀察到，這就稱作部分反應(yīng)；舉例： Eox + S Ered + P Ered + O2 Eox + H2O2編號(hào)E.C.1.1.3.4的葡萄糖氧化酶催化的總反應(yīng)為：-D-葡萄糖 + O2 " D-葡萄糖酸-內(nèi)酯 + H2O2§4 酶作用動(dòng)力學(xué)一、單底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)· 以底物S、生成產(chǎn)物P的

24、酶催化反應(yīng)為例，以E表示酶，其反應(yīng)歷程如下： E + S D ES " P + E· 第一步：酶和底物形成中間配合物ES； · 第二步：ES配合物釋放能量，生成產(chǎn)物P和酶。 單底物酶催化反應(yīng)與非酶催化反應(yīng)的進(jìn)程曲線圖如下：          對(duì)典型的單底物酶催化反應(yīng)：酶的總濃度：(CE)t = CE + CES假定S、E和ES很快達(dá)到平衡，ES的分解是控速步驟，則在平衡時(shí)E + S D ES " P + E    &

25、#160;其中：kM是酶的特性常數(shù)，表明酶和底物間親和力的大小，kM愈小的酶，其催化活性愈高。酶催化反應(yīng)的速率：r = k2CES，代進(jìn)上式，得 即Michaelis-Menten(米氏)動(dòng)力學(xué)方程。k2也稱為kcat，代表酶催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化數(shù)(turnover number)。在極限情況下：1. 若底物濃度很大，使催化活性中心飽和，Cs>kM，此時(shí)上式簡化為Kcat為一級(jí)速率常數(shù)，反應(yīng)速率取決于酶量。若反應(yīng)速率以每個(gè)酶分子來表示，而不是以單位體積來表示，則應(yīng)為零級(jí)反應(yīng)。2. 如果底物對(duì)活性中心覆蓋度很低， CSkM，動(dòng)力學(xué)方程簡化為：  Kcat/kM為二級(jí)

26、反應(yīng)速率常數(shù)，若反應(yīng)速率以每個(gè)活性中心表示，則為表觀一級(jí)反應(yīng)。· 從動(dòng)力學(xué)方程可見，酶的濃度、底物濃度、產(chǎn)物濃度都影響酶催化反應(yīng)速率。此外溫度、酸堿度、離子強(qiáng)度和抑制劑也會(huì)影響酶催化反應(yīng)。 · 酶催化反應(yīng)速率與溫度的關(guān)系服從Arrhenius方程，溫度升高時(shí)，反應(yīng)速率呈指數(shù)上升，與化學(xué)催化的規(guī)律相同；但酶蛋白質(zhì)溫度過高，則易于變性，導(dǎo)致酶的催化活性下降，甚至失活；一般蛋白質(zhì)在45-50便開始變性，到55變性已相當(dāng)嚴(yán)重。 酶促反應(yīng)按底物數(shù)分類： 底物數(shù)酶分類催化反應(yīng)酶種類占總酶1. 單底物異構(gòu)酶A DB5%2. 單向單底物裂解酶A DB+C12%3. 假單底物水解酶

27、A-B+H2ODA-OH+BH26%4. 雙底物氧化還原酶基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶AH2+BDA+BH2A+BXDAX+B27%5. 三底物連接酶A+B+ATPDAB+ADP+P130% 二、酶作用于多底物時(shí)的動(dòng)力學(xué)雙底物、雙產(chǎn)物反應(yīng)通式為：E + A + B = E + P + Q 考慮酶與底物是否形成三元絡(luò)合物，將酶分為兩大類。1. 反應(yīng)過程中形成三元絡(luò)合物 2. 反應(yīng)過程中不形成三元絡(luò)合物 E + A + B " EAB " EPQ " E + P + Q 形成了三元絡(luò)合物。A + E " EA " FP " F " FB

28、 " EQ " E + Q酶首先與一個(gè)底物結(jié)合，釋放一個(gè)產(chǎn)物，再與另一個(gè)底物結(jié)合，再釋放出產(chǎn)物，即底物和產(chǎn)物交替地與酶結(jié)合或從酶釋放。好像打乒乓一樣一來一去。反應(yīng)過程中無三元絡(luò)合物形成。雙底物反應(yīng)恒態(tài)動(dòng)力學(xué)：Alberty推導(dǎo)的一般速度方程為：    Vmax A、B都飽和時(shí)的最大初速度；KmA B飽和時(shí)v0=1/2Vmax的A的濃度；KmB A飽和時(shí)v0=1/2Vmax的B的濃度；KsA E+ADEA的解離常數(shù)。 雙底物動(dòng)力學(xué)方程的簡化： （1）在B0很高時(shí)，方程簡化為：  （2）在A0很高時(shí)

29、，方程簡化為： §5 酶的抑制作用許多物質(zhì)與酶結(jié)合以后，影響了酶與底物的結(jié)合及酶的轉(zhuǎn)化數(shù)，從而改變了酶的活力。這些降低酶催化反應(yīng)速度的物質(zhì)稱抑制劑。很多抑制劑結(jié)構(gòu)類似底物，但不被酶所催化或與底物相比反應(yīng)速度極慢。 · 可逆抑制劑：以可逆方式與酶結(jié)合，可通過透析、直接稀釋、凝膠過濾等物理手段使酶活性恢復(fù)； · 不可逆抑制劑：不能用上述物理手段除去。 酶的抑制作用：a. 可逆抑制作用· 競爭性抑制 原理：競爭性抑制劑結(jié)構(gòu)往往與正常底物非常相似，因而與底物競爭酶分子上的同一結(jié)合部位，與酶結(jié)合的抑制劑缺乏具有反應(yīng)活性的基團(tuán)或處于不恰當(dāng)?shù)牟课唬?/p>

30、使酶無法發(fā)揮催化功能，底物不能轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，上述任一情形下都會(huì)形成死端復(fù)合物(dead-end complex)。舉例：丙二酸(CO2-CH2CO2-)是琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制劑：   丙二酸與琥珀酸結(jié)構(gòu)非常相似，都具有兩個(gè)羧基，因而可以占據(jù)酶分子上底物的結(jié)合位點(diǎn). 但由于丙二酸在兩個(gè)羧基之間只有一個(gè)碳原子，不會(huì)形成雙鍵，因而不會(huì)發(fā)生后續(xù)反應(yīng)。競爭性抑制劑與底物結(jié)合部位相同：          競爭性抑制劑與底物結(jié)合部位不同：   &#

31、160;        · 反競爭性抑制 原理：反競爭性抑制劑(I)只與酶-底物復(fù)合物結(jié)合而不與自由酶結(jié)合。E + S D ES (DESI) " E + P反競爭性抑制示意圖：          ESI · 非競爭性抑制 原理：不論底物分子是否與酶結(jié)合，非競爭性抑制劑都能與酶分子結(jié)合，產(chǎn)生死端復(fù)合物。E (DEI) + S D ES (ESI) " E + PEI D ESI

32、非競爭性抑制示意圖：         · 混合型抑制 原理：若底物和抑制劑與酶的結(jié)合完全獨(dú)立，這種現(xiàn)象就稱為混合型抑制。E (DEI) + S D ES (DESI) " E + P· 部分抑制 原理：以上討論的都是形成死端絡(luò)合物的抑制，而這些復(fù)合物不會(huì)釋放產(chǎn)物。部分抑制就是指混合型抑制中ESI復(fù)合物也能釋放產(chǎn)物。ESI " E + P + I· 底物抑制 原理：在給定的酶濃度下，酶催化反應(yīng)的速度隨底物濃度的增加而加快，至極限Vmax；有時(shí)，在極高的底物濃

33、度下，初速度仍低于最大值，有時(shí)認(rèn)為測定系統(tǒng)與過量底物之間有相互作用，但在有些情況下的確發(fā)現(xiàn)高濃度的底物會(huì)抑制自身轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。· 產(chǎn)物抑制 產(chǎn)物對(duì)酶反應(yīng)的抑制作用在生物體內(nèi)較為常見，在細(xì)胞內(nèi)，酶反應(yīng)的產(chǎn)物雖然不斷地為另外的酶所作用，但S和P總是同時(shí)存在的；在單底物酶反應(yīng)中，產(chǎn)物P對(duì)反應(yīng)速度的影響相當(dāng)于底物S的競爭性抑制對(duì)反應(yīng)速度的影響。· 變構(gòu)抑制 原理：抑制劑與酶結(jié)合，引起酶構(gòu)象的改變，使底物結(jié)合部位的性質(zhì)發(fā)生變化和改變了后續(xù)的催化活性，而不是指形成死端復(fù)合物. 例如：某一生物合成途徑表示為A " B " C " D " E &quo

34、t; F產(chǎn)物F作為這一合成途徑中幾個(gè)早期的酶(如A"B的酶)的變構(gòu)抑制劑，對(duì)這一合成途徑加以反饋抑制，以避免產(chǎn)物過量堆積。b. 不可逆抑制作用原理：抑制劑與酶的必需基團(tuán)以共價(jià)鍵連接，將必需基團(tuán)進(jìn)行了化學(xué)修飾，從而引起酶活性的喪失；被修飾的基團(tuán)可以很多，多至酶蛋白中相似性質(zhì)的基團(tuán)都被修飾，也可專一地只修飾某一個(gè)必需基團(tuán)。§6 pH值和溫度對(duì)酶作用的影響pH值對(duì)酶活性的影響主要是：· 使酶的空間結(jié)構(gòu)破壞，引起酶活性喪失； · 影響酶活性部位催化基團(tuán)的解離狀態(tài)，使底物不能分解為產(chǎn)物； · 影響酶活性部位結(jié)合基團(tuán)的解離狀態(tài)，使其不能與底物結(jié)合；

35、83; 影響底物的解離狀態(tài)，使底物不能和酶結(jié)合，或結(jié)合后不能生成產(chǎn)物。 綜合上述種種原因，用酶活力對(duì)pH作圖往往有鐘罩形曲線，酶的作用存在一最適的pH值，它和酶的最穩(wěn)定pH值不一定相同。 溫度值對(duì)酶作用的影響：· 影響酶的穩(wěn)定程度，酶蛋白的熱變性； · 影響最大反應(yīng)速度，即k2； · 影響酶和底物的結(jié)合，即影響k1或k-1 ； · 影響酶和抑制劑、激活劑或輔酶的結(jié)合； · 影響酶和底物分子中某些解離基團(tuán)的pK值。  溫度對(duì)反應(yīng)速度的影響：根據(jù)絕對(duì)反應(yīng)速度理論， (1)式 式中k 反應(yīng)速度常數(shù)； KB Boltzma

36、n常數(shù)； K 反應(yīng)物與活化絡(luò)合物之間的平衡常數(shù). 將熱力學(xué)關(guān)系 代入(1)式   (2)式 將(2)式兩邊取對(duì)數(shù)，再對(duì)T微分：     (3)式 將(3)式與Arrhenius經(jīng)驗(yàn)方程比較： 將式 改寫為：    用以上方法即可測定酶反應(yīng)的活化能數(shù)值。§7 酶的作用機(jī)制酶的活性部位：              

37、;  酶和底物的誘導(dǎo)契合模式圖：           酶和底物的活性部位結(jié)合圖：          提出一個(gè)酶的作用機(jī)制，應(yīng)確證以下幾個(gè)方面：· 底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物每一步過程的中間絡(luò)合物及其基元反應(yīng)次序； · 這些絡(luò)合物之間相互轉(zhuǎn)變的速度常數(shù)； · 絡(luò)合物的結(jié)構(gòu)。 基元催化反應(yīng)酸堿催化：· 酸(或堿)可以通過暫時(shí)提供(或接受)一個(gè)質(zhì)

38、子以穩(wěn)定過渡態(tài)達(dá)到催化反應(yīng)的目的，如醇與酮的異構(gòu)化反應(yīng)十分緩慢，若加入酸或堿催化劑，可使反應(yīng)大大加快。 · 酶分子中氨基酸側(cè)鏈具有質(zhì)子供體和受體的功能，所以推測酸堿催化在酶分子中起了重要作用是合理的。 基元催化反應(yīng)共價(jià)催化：是通過催化劑與底物的共價(jià)鍵結(jié)合，形成過渡態(tài)來加速反應(yīng)，如伯胺催化的乙酰乙酸脫羧過程：            共價(jià)催化具有親核、親電過程：（1）催化劑和底物進(jìn)行親核反應(yīng)形成共價(jià)鍵；（2）再通過同一催化劑進(jìn)行親電催化，從反應(yīng)中心吸收電子。已分離出大量

39、的共價(jià)鍵連接的酶-底物絡(luò)合物，證明酶具有共價(jià)催化機(jī)理?；呋磻?yīng)金屬離子催化：在所有已知的酶中，幾乎有三分之一的酶表現(xiàn)活性時(shí)需要存在金屬離子。根據(jù)金屬離子與蛋白質(zhì)結(jié)合作用的大小，將需要金屬的酶分成兩大類：金屬酶，具有緊密結(jié)合的金屬離子，常見的過渡金屬離子為Fe2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+、Co3+；金屬激活酶，金屬離子結(jié)合較松，通常是堿金屬和堿土金屬離子如Na+、K+、Mg2+、Ca2+。金屬酶：· 極微量的Mo和Fe存在于氧化氮還原酶、固氮菌的活化氮絡(luò)合物中； · Fe是血紅蛋白的組分； · Co存在于維生素B12中。 在生物體中這些金屬離子含量極微。金

40、屬激活酶：· 堿金屬陽離子和酶以弱的結(jié)合形成絡(luò)合物，細(xì)胞內(nèi)含量最多的K+能激活很多酶，特別是催化磷酰基轉(zhuǎn)移或消去反應(yīng)的酶； · K+的作用基本上是和酶失活形式的負(fù)電荷基團(tuán)結(jié)合，從而引起酶分子構(gòu)象的變化，使之變?yōu)楦谢钚缘男问?；在某些情況下，K+也能促進(jìn)底物的結(jié)合。 1970年Mildvan指出，在酶(E)、金屬離子(M)和底物(S)之間形成三元絡(luò)合物，可有以下幾種形式：（1）酶橋絡(luò)合物 ME S（2）底物橋絡(luò)合物 E S M（3）金屬橋絡(luò)合物 E M S 多元催化：· 酶的催化反應(yīng)通常是幾個(gè)基元反應(yīng)協(xié)同作用的結(jié)果； · 多元催化也是使酶反應(yīng)加速的因素之一

41、。 酶作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)探測：· 動(dòng)力學(xué)研究 · 中間物探測 · X-射線晶體衍射 · 氨基酸側(cè)鏈化學(xué)修飾 · 定點(diǎn)突變 · 蛋白水解酶作用(酶的修飾) 這些方法互為補(bǔ)充，并應(yīng)得到一致的結(jié)果。80年代初期，重組DNA技術(shù)迅速發(fā)展，如果能夠得到某一蛋白質(zhì)密碼順序，具有合適的表達(dá)基因的載體，這一技術(shù)已可能將氨基酸導(dǎo)入該蛋白質(zhì)特定的位點(diǎn)，典型操作過程見圖：定點(diǎn)突變的典型操作過程：             ·

42、 定點(diǎn)突變是評(píng)價(jià)酶分子的特定氨基酸重要性的非常有效的方法，圓二色性(circular dichroism)與分光光度技術(shù)可以快速確定酶的結(jié)構(gòu)特征，在這一領(lǐng)域非常有用； · 定點(diǎn)突變首先要得到酶的基因，如果已知酶的X-射線結(jié)構(gòu)，就可以很詳細(xì)地描述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 舉例：枯草桿菌蛋白酶對(duì)核糖核酸酶的作用，它可將酶分子水解成兩部分，一部分稱S-肽(核糖核酸酶一級(jí)結(jié)構(gòu)中最初由20個(gè)氨基酸組成)，另一部分稱為S-蛋白(由酶分子上其他104個(gè)殘基組成)； 將這兩部分分開，都沒有活力，若將兩者以等摩爾比例混合，酶完全恢復(fù)活性，推測兩者對(duì)于酶的活性中心都有貢獻(xiàn)，結(jié)合側(cè)鏈修飾方法證實(shí)了第12、41和119號(hào)

43、側(cè)鏈都為酶活性所必需。§8 應(yīng)用酶學(xué)· 固定化酶（immobilized enzyme） · 酶在醫(yī)藥上的應(yīng)用 · 酶法手性化合物的拆分 酶的固定化方法：載體結(jié)合法（共價(jià)結(jié)合法、離子結(jié)合法和物理吸附法）、交聯(lián)法、包埋法（網(wǎng)絡(luò)型和微囊型）。固定化酶的模式：                         

44、60; 游離的酶經(jīng)固定化后所引起的酶性質(zhì)的改變，其原因可能有：· 酶分子構(gòu)象的改變 · 微環(huán)境的影響 · 底物在載體和溶液間存在著分配效應(yīng) · 擴(kuò)散效應(yīng) 藥用酶類：· 促進(jìn)消化酶類 · 消炎酶類 · 與纖維蛋白溶解作用有關(guān)的酶類 · 抗腫瘤的酶 酶類藥物一覽表品 種來 源用 途胃蛋白酶胃粘膜助消化木瓜蛋白酶木瓜果汁抗炎，消化溶菌酶雞蛋卵蛋白抗炎，抗出血鏈激酶B-溶血性鏈球菌部分清潔，溶解血栓凝血酶牛血漿止血彈性蛋白酶胰臟降壓，降血脂無花果蛋白酶無花果汁液驅(qū)蟲劑青霉素酶蠟狀芽孢桿菌青霉素過敏癥細(xì)胞色素酶牛、

45、豬、馬心臟改善組織缺氧 診斷用酶：· 臨床生化的中心任務(wù)是研究并定量分析疾病時(shí)的生化改變。細(xì)胞外液(血漿、血清、尿、消化液及羊水等)，是最常用的材料。 · 大多數(shù)酶存在于活細(xì)胞內(nèi)，但細(xì)胞受損時(shí)，酶則溢出并進(jìn)入細(xì)胞外液，于是細(xì)胞外液酶活性增高。測定這些酶活性增高的程度、類型及持續(xù)時(shí)間，可為臨床醫(yī)生鑒別受損細(xì)胞，了解損傷程度，估價(jià)治療效果提供極為有用的資料。 酶法拆分手性化合物：· 化學(xué)方法難以拆分的外消旋體，可藉酶動(dòng)力學(xué)拆分。主要是利用酶或微生物與消旋化合物中兩個(gè)對(duì)映體水解或還原速率不同，進(jìn)行拆分以獲得兩個(gè)光學(xué)活性產(chǎn)物。 · 例如：D-苯基甘氨基

46、酸是制備抗菌類藥物的重要中間體，它由化學(xué)合成法制備得到外消旋體，利用氨肽酶成功地進(jìn)行了拆分。 §9 酶法制備L-氨基酸L-氨基酸的主要用途：· ·        醫(yī)藥領(lǐng)域（氨基酸輸液、抗生素及多肽類藥物）· ·        食品添加劑領(lǐng)域（風(fēng)味及營養(yǎng)強(qiáng)化劑、甜味劑）· ·        飼料添加劑領(lǐng)域（蛋氨酸、賴氨酸、色氨酸） 國內(nèi)L-氨基酸生產(chǎn)狀況：· 生產(chǎn)規(guī)模小 · 生產(chǎn)工藝落后 · 生產(chǎn)品種不齊全 L-苯丙氨酸：· 學(xué)名（L-2-氨基-3-苯基丙酸） · 醫(yī)藥領(lǐng)域（人體必需的8種氨基酸之一） · 食品添加劑領(lǐng)域（用于合成阿司帕坦甜味劑） 酶法制備L-苯丙氨酸：苯丙酮酸 " L-苯丙氨酸（在轉(zhuǎn)氨酶作用下）肉桂酸 + NH3 " L-苯丙氨酸（在苯丙氨酸解氨酶作用下）酶法制備L-丙氨酸：· 學(xué)名（L-氨基丙酸，最甜的氨基酸） · 醫(yī)藥領(lǐng)域（輸