第8章液固-液液色譜法

1、第八章 高效液相色譜法液固吸附色譜液液分配色譜宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室主要內(nèi)容液液- -固吸附色譜法固吸附色譜法 一一液液- -液分配色譜法液分配色譜法 二二正相硅膠反相洗脫色譜法正相硅膠反相洗脫色譜法 三三宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室3一、液固吸附色譜法一、液固吸附色譜法宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室1 1、液固吸附色譜法的定義、液固吸附色譜法的定義 v液固吸附色譜是最早出現(xiàn)的，也是最基本的一液固吸附色譜是最早出現(xiàn)的，也是最基本的一種柱色譜類型。種柱色譜類型。 液液固固吸吸附附色色譜譜 色譜分離是基于吸附效應(yīng)的色

2、譜法稱色譜分離是基于吸附效應(yīng)的色譜法稱為吸附色譜法，以固體吸附劑為固定為吸附色譜法，以固體吸附劑為固定相，以液體為流動相的色譜法，稱為相，以液體為流動相的色譜法，稱為液固吸附色譜法液固吸附色譜法（Liquid-Solid Adsorption Chromatography，LSC），），簡稱液固色譜法。簡稱液固色譜法。宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室2 2、液固吸附色譜法的固定相、液固吸附色譜法的固定相v優(yōu)良的固定相填料應(yīng)具備以下特性：優(yōu)良的固定相填料應(yīng)具備以下特性：表面具有極性活性基團即吸附位點；形狀適宜，最表面具有極性活性基團即吸附位點；形狀適宜，最好成微米級微球形，

3、且粒徑分布均勻；多孔性且比好成微米級微球形，且粒徑分布均勻；多孔性且比表面積大，載樣量大；化學性質(zhì)穩(wěn)定；機械強度高；表面積大，載樣量大；化學性質(zhì)穩(wěn)定；機械強度高；價格合理價格合理 。宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室v在吸附色譜中，最常用的吸附劑是在吸附色譜中，最常用的吸附劑是硅膠硅膠，其次是，其次是氧氧化鋁化鋁，此外還有高分子多孔微球（有機膠）、分子，此外還有高分子多孔微球（有機膠）、分子篩及聚酰胺等。篩及聚酰胺等。 v固定相按固定相按極性極性大小分類如下：大小分類如下： 按極性按極性大小分大小分極性吸附劑極性吸附劑非極性吸附劑：活性碳非極性吸附劑：活性碳酸性吸附劑：硅膠

4、、硅酸鎂酸性吸附劑：硅膠、硅酸鎂堿性吸附劑：氧化鋁、氧化鎂堿性吸附劑：氧化鋁、氧化鎂宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室S iOOS i硅膠的性質(zhì)硅膠的性質(zhì)v硅膠表面主要存在著硅羥基（硅膠表面主要存在著硅羥基（Silanol，或稱硅醇基），或稱硅醇基）和暴露于表面的和暴露于表面的SiOSi鍵，另外還有一些硅醇基鍵，另外還有一些硅醇基可能與水以氫鍵鍵合。硅羥基的表面濃度在液固可能與水以氫鍵鍵合。硅羥基的表面濃度在液固吸附色譜中很重要，因為人們通常認為硅羥基是強吸附色譜中很重要，因為人們通常認為硅羥基是強吸附位點，而吸附位點，而SiOSi則是疏水性的。則是疏水性的。 SiOH自由

5、型硅醇基自由型硅醇基 硅氧烷型硅氧烷型 宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室硅膠表面的活性作用點硅膠表面的活性作用點物理吸附水物理吸附水干燥表面干燥表面宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室 v硅膠按硅膠按結(jié)構(gòu)類型結(jié)構(gòu)類型分類如下：分類如下： 硅膠硅膠薄殼型薄殼型全多孔型全多孔型無定形無定形球球 形形薄殼玻珠薄殼玻珠 無定形無定形全多孔硅膠全多孔硅膠 球形球形全多孔硅膠全多孔硅膠 宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室性能性能薄殼玻珠薄殼玻珠全多孔微粒硅膠全多孔微粒硅膠平均粒度平均粒度/m3040510比表面積比表面積/（m2/g）1.01.5

6、400600樣品容量樣品容量/（mg/g）0.050.115填充填充干法裝柱干法裝柱濕法裝柱濕法裝柱分析速度分析速度慢慢快快薄殼玻珠和全多孔微粒硅膠性能比較薄殼玻珠和全多孔微粒硅膠性能比較 宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室（1 1）無定形全多孔硅膠）無定形全多孔硅膠 v無定形全多孔的填料容易制備、價格低、無定形全多孔的填料容易制備、價格低、粒徑一般為粒徑一般為5 m10 m，粒度分布較均，粒度分布較均勻，理論塔板數(shù)可達勻，理論塔板數(shù)可達50000 /m，比表面積，比表面積約約300 m2/g，載樣量大，但渦流擴散大，載樣量大，但渦流擴散大，滲透性差，比較難填裝出穩(wěn)定的柱床

7、，一滲透性差，比較難填裝出穩(wěn)定的柱床，一般用來做制備柱。般用來做制備柱。 宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室（2 2）球形全多孔硅膠）球形全多孔硅膠 v球形全多孔填料外形為球形，常用粒徑為球形全多孔填料外形為球形，常用粒徑為3 m5 m，下圖為中國科學院蘭州化學物理研究所生產(chǎn)的，下圖為中國科學院蘭州化學物理研究所生產(chǎn)的高純度多孔球形硅膠電鏡照。高純度多孔球形硅膠電鏡照。放大放大30003000倍倍放大放大50005000倍倍宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室（2 2）球形全多孔硅膠）球形全多孔硅膠v球形全多孔填料具有渦流擴散小，滲透性好球形全多孔填料具有

8、渦流擴散小，滲透性好的優(yōu)點；如果是硅膠先做成珠子再堆積而成的優(yōu)點；如果是硅膠先做成珠子再堆積而成的話，即堆積硅珠，則具有傳質(zhì)阻抗小、載的話，即堆積硅珠，則具有傳質(zhì)阻抗小、載樣量大的優(yōu)點，柱效也更高。球形填料外形樣量大的優(yōu)點，柱效也更高。球形填料外形對稱，比較容易填裝出穩(wěn)定的柱床，是化學對稱，比較容易填裝出穩(wěn)定的柱床，是化學鍵合相的理想載體。鍵合相的理想載體。宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室氧化鋁氧化鋁 v氧化鋁與硅膠相似，但對水溶液、酸性或堿性水溶氧化鋁與硅膠相似，但對水溶液、酸性或堿性水溶液更加液更加不穩(wěn)定不穩(wěn)定，所以，極少用作鍵合固定相的基質(zhì)。，所以，極少用作鍵合固定

9、相的基質(zhì)。v氧化鋁適宜分離溶于有機溶劑的極性、弱極性的非氧化鋁適宜分離溶于有機溶劑的極性、弱極性的非強離解型的化合物，尤其適合于分離強離解型的化合物，尤其適合于分離芳香族化合物芳香族化合物。v當樣品為堿性化合物時，用硅膠分離會造成嚴重吸當樣品為堿性化合物時，用硅膠分離會造成嚴重吸附，此時可選用氧化鋁進行分離，但附，此時可選用氧化鋁進行分離，但酸性酸性易離解的易離解的化合物容易在氧化鋁上形成化合物容易在氧化鋁上形成死吸附死吸附。v氧化鋁分離氧化鋁分離幾何異構(gòu)體能力優(yōu)幾何異構(gòu)體能力優(yōu)于硅膠。于硅膠。 宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室3 3、液固吸附色譜法的保留機理、液固吸附色

10、譜法的保留機理 溶 質(zhì)溶 質(zhì)分 子分 子固定相對它的吸附力固定相對它的吸附力 流動相的流動相的“拉力拉力”或溶解或溶解力力 吸附力強而溶解能吸附力強而溶解能力差時，溶質(zhì)有較力差時，溶質(zhì)有較大的保留。大的保留。 吸附力差而溶解能吸附力差而溶解能力強時，溶質(zhì)有較力強時，溶質(zhì)有較小的保留。小的保留。 溶質(zhì)處于這兩相作溶質(zhì)處于這兩相作用力場的平衡之中用力場的平衡之中 宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室 在吸附色譜體系中，溶劑分子和溶質(zhì)分子均能被吸在吸附色譜體系中，溶劑分子和溶質(zhì)分子均能被吸附于吸附劑的活性位點上，當流動相流過固定相時，附于吸附劑的活性位點上，當流動相流過固定相時，樣

11、品組分分子與流動相分子競爭吸附劑表面吸附中樣品組分分子與流動相分子競爭吸附劑表面吸附中心，同時，樣品中不同組分分子也在競爭吸附中心。心，同時，樣品中不同組分分子也在競爭吸附中心。 v一是由一是由Snyder和和Soczewinski提出的提出的競爭模式競爭模式（competition model）。）。 v二是由二是由Scott和和Kucera提出的溶劑作用模式（提出的溶劑作用模式（solvent initeraction model）“雙層吸附模型雙層吸附模型” 。兩種模型兩種模型宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室競爭模式競爭模式 v競爭模式認為在被溶劑平衡的色譜柱中，弱

12、極性或競爭模式認為在被溶劑平衡的色譜柱中，弱極性或中等極性的溶劑分子先被吸附劑吸附，覆蓋于吸附中等極性的溶劑分子先被吸附劑吸附，覆蓋于吸附劑表面形成單分子層，當溶質(zhì)分子進入色譜體系后，劑表面形成單分子層，當溶質(zhì)分子進入色譜體系后，便競爭置換（或頂替）溶劑分子而形成吸附。便競爭置換（或頂替）溶劑分子而形成吸附。X. 溶質(zhì)分子溶質(zhì)分子Y. 溶劑分子溶劑分子s. 吸附劑吸附劑m. 流動相流動相 宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室雙層吸附模型雙層吸附模型 v雙層吸附模型假定吸附劑表面先被流動相中極性較雙層吸附模型假定吸附劑表面先被流動相中極性較強的組分以雙層溶劑分子的形式所完全覆蓋

13、，雙層強的組分以雙層溶劑分子的形式所完全覆蓋，雙層的結(jié)構(gòu)及形成的程度取決于流動相中極性溶劑的濃的結(jié)構(gòu)及形成的程度取決于流動相中極性溶劑的濃度，溶質(zhì)通過柱子時與雙層溶劑的第二層發(fā)生取代度，溶質(zhì)通過柱子時與雙層溶劑的第二層發(fā)生取代或締合而使溶質(zhì)保留?；蚓喓隙谷苜|(zhì)保留。 X. 溶質(zhì)分子溶質(zhì)分子Y. 溶劑分子溶劑分子s. 吸附劑吸附劑m. 流動相流動相 宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室流動相流動相吸附劑吸附劑溶質(zhì)溶質(zhì)誘導力誘導力 靜電力靜電力 氫鍵力氫鍵力 色散力色散力 電荷電荷轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移 絡(luò)合物絡(luò)合物形成形成 宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室v組分分子中的

14、極性官能團與固定相表面上活組分分子中的極性官能團與固定相表面上活性作用點（如硅羥基）之間的相互作用強弱性作用點（如硅羥基）之間的相互作用強弱決定了它的競爭能力，即保留程度的大小，決定了它的競爭能力，即保留程度的大小，這種極性相互作用的強弱歸納如下表所示。這種極性相互作用的強弱歸納如下表所示。 宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室硅膠上各類化合物或官能團吸附強弱的分類硅膠上各類化合物或官能團吸附強弱的分類 樣品的吸附樣品的吸附 能力能力樣品類型樣品類型無吸附無吸附脂肪烴脂肪烴弱吸附弱吸附烯烴、硫醇、硫醚、單環(huán)和雙環(huán)芳烴、烯烴、硫醇、硫醚、單環(huán)和雙環(huán)芳烴、鹵代烴鹵代烴中等吸附中等

15、吸附稠環(huán)芳烴、醚類、腈類、硝基化合物和稠環(huán)芳烴、醚類、腈類、硝基化合物和大多數(shù)羰基化合物大多數(shù)羰基化合物強吸附強吸附醇類、酚類、胺類、酰胺類、亞胺類、醇類、酚類、胺類、酰胺類、亞胺類、亞砜類、酸類亞砜類、酸類宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室一般保留規(guī)律一般保留規(guī)律 v F化物化物Cl化物化物Br化物化物I化物；化物；v 順式幾何異構(gòu)體比反式幾何異構(gòu)體保留值大；順式幾何異構(gòu)體比反式幾何異構(gòu)體保留值大；v 官能團之間的分子內(nèi)氫鍵將使保留值減??；官能團之間的分子內(nèi)氫鍵將使保留值減小；v 極性基團旁邊有龐大烷基存在時，保留值減??；極性基團旁邊有龐大烷基存在時，保留值減??；v 環(huán)己

16、烷衍生物和甾體化合物的中位取代基比軸端環(huán)己烷衍生物和甾體化合物的中位取代基比軸端取代基有更強的保留。取代基有更強的保留。 宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室4 4、液固吸附色譜法的流動相、液固吸附色譜法的流動相 v液固吸附色譜中使用的流動相為各種有機溶劑，液固吸附色譜中使用的流動相為各種有機溶劑，主要為非極性的烴類（如己烷、庚烷），某些有機主要為非極性的烴類（如己烷、庚烷），某些有機溶劑（如二氟甲烷、甲醇、三乙胺等）作為緩和劑溶劑（如二氟甲烷、甲醇、三乙胺等）作為緩和劑加入其中以調(diào)節(jié)流動相的溶劑強度、極性及加入其中以調(diào)節(jié)流動相的溶劑強度、極性及pH值，值，即進行所謂正相色譜

17、。流動相溶劑極性越大，洗脫即進行所謂正相色譜。流動相溶劑極性越大，洗脫能力越強，溶質(zhì)保留越小；流動相溶劑極性越小，能力越強，溶質(zhì)保留越?。涣鲃酉嗳軇O性越小，洗脫能力越弱，溶質(zhì)保留越大。洗脫能力越弱，溶質(zhì)保留越大。宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室己烷己烷環(huán)己烷環(huán)己烷甲苯甲苯苯苯乙醚乙醚氯仿氯仿一氯甲烷一氯甲烷丙酮丙酮硝基甲烷硝基甲烷乙腈乙腈丙酮丙酮乙醇乙醇甲醇甲醇己烷己烷環(huán)己烷環(huán)己烷異丙醚異丙醚甲苯甲苯苯苯乙醚乙醚氯仿氯仿一氯甲烷一氯甲烷二氯甲烷二氯甲烷丙酮丙酮乙酸乙酯乙酸乙酯硝基甲烷硝基甲烷乙腈乙腈丙酮丙酮乙醇乙醇甲醇甲醇宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分

18、教研室（1 1）混合溶劑）混合溶劑 v液固色譜中廣泛使用混合溶劑（二元、三元液固色譜中廣泛使用混合溶劑（二元、三元體系等），這是因為雖然不同的純?nèi)軇┯胁惑w系等），這是因為雖然不同的純?nèi)軇┯胁煌娜軇姸取５麄儾灰欢ㄊ沁M行液固同的溶劑強度。但他們不一定是進行液固吸附色譜的最佳溶劑強度，我們可以利用不吸附色譜的最佳溶劑強度，我們可以利用不同組成的混合溶劑獲得任意需要的溶劑強度。同組成的混合溶劑獲得任意需要的溶劑強度。 宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室流動相主體：弱極性的戊烷、己烷、庚烷等。流動相主體：弱極性的戊烷、己烷、庚烷等。改改 性性 劑：調(diào)節(jié)流動相的洗脫強度與峰形。劑

19、：調(diào)節(jié)流動相的洗脫強度與峰形。中等極性：二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯。中等極性：二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯。極性溶劑：四氫呋喃、乙腈、異丙醇、極性溶劑：四氫呋喃、乙腈、異丙醇、 甲醇、水等。甲醇、水等。 堿性物質(zhì)：如三乙胺等，分離堿性品，堿性物質(zhì)：如三乙胺等，分離堿性品， 避免峰拖尾或不可逆的保留。避免峰拖尾或不可逆的保留。 宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室（2 2）水的影響）水的影響 v硅膠及氧化鋁為良好的干燥劑。水的含量對硅膠及氧化鋁為良好的干燥劑。水的含量對該類吸附劑的活度有很大的影響，即使有極該類吸附劑的活度有很大的影響，即使有極微量的水吸附在其表面上，也會使吸附劑活微

20、量的水吸附在其表面上，也會使吸附劑活性大大降低。性大大降低。宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室5 5、液固吸附色譜的應(yīng)用、液固吸附色譜的應(yīng)用v隨著隨著HPLC技術(shù)的發(fā)展，雖然原來許多使用技術(shù)的發(fā)展，雖然原來許多使用液固吸附色譜模式的分離分析被更方便、液固吸附色譜模式的分離分析被更方便、穩(wěn)定的化學鍵合相所代替，但在以下幾個方穩(wěn)定的化學鍵合相所代替，但在以下幾個方面仍有其獨特的意義。面仍有其獨特的意義。宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室（1 1）異構(gòu)體的分離）異構(gòu)體的分離 v許多異構(gòu)體使用化學鍵合相來分離是不可能的或者許多異構(gòu)體使用化學鍵合相來分離是不可能的

21、或者是很困難的，而采用以硅膠為固定相的液固吸附是很困難的，而采用以硅膠為固定相的液固吸附色譜卻很容易分開。色譜卻很容易分開。 圖圖 液固吸附色譜法拆分苯基丁氨酸衍生物異構(gòu)體液固吸附色譜法拆分苯基丁氨酸衍生物異構(gòu)體 宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室（2 2）樣品預處理）樣品預處理 v許多生物樣品可使用經(jīng)典液固吸附色譜來許多生物樣品可使用經(jīng)典液固吸附色譜來進行純化，除去蛋白質(zhì)等干擾物，然后再進進行純化，除去蛋白質(zhì)等干擾物，然后再進一步以一步以GC或或HPLC等分離分析。等分離分析。 宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室（3 3）制備色譜）制備色譜 v由于硅膠

22、比較便易，所以進行分離比較有利，由于硅膠比較便易，所以進行分離比較有利，同時流動相為有機溶劑，容易揮發(fā)，便于產(chǎn)同時流動相為有機溶劑，容易揮發(fā)，便于產(chǎn)物提取。物提取。 宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室（4 4）常用于）常用于HPLC-GCHPLC-GC聯(lián)用技術(shù)聯(lián)用技術(shù) v由于流動相為有機溶劑，易于氣化，所以目由于流動相為有機溶劑，易于氣化，所以目前前90%的的HPLC-GC中的中的HPLC部分采用液部分采用液固吸附色譜，進行正相固吸附色譜，進行正相HPLC。 宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室33二、液液分配色譜法二、液液分配色譜法宋宋 敏敏中國藥科大學

23、藥分教研室中國藥科大學藥分教研室1 1、液、液- -液分配色譜法的定義液分配色譜法的定義液液分液液分配色譜配色譜 基于樣品組分在固定液和流動相之基于樣品組分在固定液和流動相之間間分配系數(shù)分配系數(shù)不同而分離的色譜法稱不同而分離的色譜法稱為液為液-液分配色譜法（液分配色譜法（Liquid-Liquid Chromatography，LLC）。）。宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室v流動相極性小于固定相極性的液液色譜法稱為流動相極性小于固定相極性的液液色譜法稱為正正相液液色譜法相液液色譜法，如以烷烴作為流動相，以含水硅，如以烷烴作為流動相，以含水硅膠作為固定相的色譜系統(tǒng)。正相液液

24、色譜法適合膠作為固定相的色譜系統(tǒng)。正相液液色譜法適合于分離極性化合物。于分離極性化合物。v流動相極性大于固定相極性的液液色譜法稱為流動相極性大于固定相極性的液液色譜法稱為反反相液液色譜法相液液色譜法，如以水為流動相，烷烴為固定相，如以水為流動相，烷烴為固定相的色譜系統(tǒng)。反相液液色譜法適合于分離芳烴、的色譜系統(tǒng)。反相液液色譜法適合于分離芳烴、稠環(huán)芳烴及烷烴等化合物。稠環(huán)芳烴及烷烴等化合物。v這兩種系統(tǒng)由于固定液易流失、重復性差，已被鍵這兩種系統(tǒng)由于固定液易流失、重復性差，已被鍵合相色譜法所代替，但正相液液分配色譜法在薄合相色譜法所代替，但正相液液分配色譜法在薄層色譜法中還廣泛使用。層色譜法中還廣

25、泛使用。宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室v液液分配色譜的固定相為涂漬在載體上的固定液。液液分配色譜的固定相為涂漬在載體上的固定液。涂漬了固定液的載體涂漬了固定液的載體1流動相；流動相；2固定液液膜；固定液液膜；3毛細深孔和滲入的固定液；毛細深孔和滲入的固定液；4液固界面；液固界面；5液液界面液液界面2 2、液液分配色譜法的固定相、液液分配色譜法的固定相 宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室(1)(1)載體載體 v原則上，所有多孔性的吸附材料均可作為固原則上，所有多孔性的吸附材料均可作為固定液的載體。一般常用硅膠、硅藻土等。結(jié)定液的載體。一般常用硅膠、硅藻

26、土等。結(jié)構(gòu)類型主要采用多孔層微珠及全多孔微粒型構(gòu)類型主要采用多孔層微珠及全多孔微粒型二種。二種。 宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室多孔層微珠多孔層微珠 柱效好，分析時間短；柱效好，分析時間短；但它的多孔層很薄，但它的多孔層很薄，只能涂漬少量固定液只能涂漬少量固定液（最大涂漬（最大涂漬12%），），故柱容量低，柱穩(wěn)定故柱容量低，柱穩(wěn)定性也差，因為少量的性也差，因為少量的固定液流失將大大改固定液流失將大大改變保留體積。變保留體積。 全多孔微粒全多孔微粒 全多孔微粒（如硅膠）全多孔微粒（如硅膠）孔容大（孔容大（1ml/g），），可涂漬較多的固定液，可涂漬較多的固定液，涂漬量可達

27、涂漬量可達1 1克固定液克固定液/ /每克載體（稱為每克載體（稱為100100%涂漬），其柱效比涂漬），其柱效比前者高，且柱容量高，前者高，且柱容量高，柱子穩(wěn)定性也好。柱子穩(wěn)定性也好。 載體上涂漬的固定液越多，則因固定液流失載體上涂漬的固定液越多，則因固定液流失對樣品保留體積的影響就越不顯著。對樣品保留體積的影響就越不顯著。宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室理想的載體應(yīng)該具有如下特點：理想的載體應(yīng)該具有如下特點：v 孔容大孔容大； 孔徑應(yīng)為孔徑應(yīng)為100500埃之間埃之間?？讖教?，較大?？讖教?，較大的分子可能被完全排阻，而保留時間更短，的分子可能被完全排阻，而保留時間更

28、短，分離不佳；孔徑太大，則固定液易流失，柱分離不佳；孔徑太大，則固定液易流失，柱穩(wěn)定性差，由于毛細管作用，固定液在小孔穩(wěn)定性差，由于毛細管作用，固定液在小孔要比大孔內(nèi)保持的好。要比大孔內(nèi)保持的好。理想的載體理想的載體宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室(2)(2)固定液固定液 v固定液可采用氣相色譜中常用的某些固定液，如不固定液可采用氣相色譜中常用的某些固定液，如不同聚合度的聚乙二醇、甲酰胺、丙撐二醇等。然而，同聚合度的聚乙二醇、甲酰胺、丙撐二醇等。然而，對這些固定液，適合作為流動相的只有非極性鏈烴，對這些固定液，適合作為流動相的只有非極性鏈烴，最多再加入少量（最高最多再加入

29、少量（最高10%）的氯仿，四氫呋喃和）的氯仿，四氫呋喃和其它醚類。所有常見的洗脫液都是這些固定液的良其它醚類。所有常見的洗脫液都是這些固定液的良溶劑。但由于許多有機物樣品在上述洗脫液中的溶溶劑。但由于許多有機物樣品在上述洗脫液中的溶解度很小，所以這類體系的適用性是有限的。解度很小，所以這類體系的適用性是有限的。宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室v液液分配色譜法的固定液的選擇也可參考紙色譜液液分配色譜法的固定液的選擇也可參考紙色譜法中使用的體系或從多組分中萃取已知組分的分配法中使用的體系或從多組分中萃取已知組分的分配體系。如在紙色譜里，甾體藥物可以在浸漬甲酰胺體系。如在紙色譜

30、里，甾體藥物可以在浸漬甲酰胺的紙上容易地分離，如果把甲酰胺涂在硅膠上，那的紙上容易地分離，如果把甲酰胺涂在硅膠上，那么甾族化合物就能用高效液相色譜分離，因為甲酰么甾族化合物就能用高效液相色譜分離，因為甲酰胺即使在中等極性的溶劑苯、二氯甲烷中也幾乎是胺即使在中等極性的溶劑苯、二氯甲烷中也幾乎是不溶解的。不溶解的。v載體的涂漬采用載體的涂漬采用GC中常用的固定液涂漬方法。中常用的固定液涂漬方法。宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室sssmmm=cXVKcXV3 3、液液分配色譜法的保留機理、液液分配色譜法的保留機理v液液分配色譜法的保留機理是根據(jù)樣品組分溶入液液分配色譜法的保留機

31、理是根據(jù)樣品組分溶入固定相（固定相（s）與流動相（）與流動相（m）達到）達到“平衡平衡”后的分配后的分配系數(shù)系數(shù) K 的差異而分離。的差異而分離。m： 流動相流動相 s： 固定液固定液Xm：在流動相中的溶質(zhì)分子：在流動相中的溶質(zhì)分子Xs： 在固定液中的溶質(zhì)分子在固定液中的溶質(zhì)分子 宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室v分配色譜過程與兩種互不相溶的液體在一個分配色譜過程與兩種互不相溶的液體在一個分液漏斗中進行的溶劑萃取相類似。分液漏斗中進行的溶劑萃取相類似。v當流動相體積和固定液體積一定時，物質(zhì)在當流動相體積和固定液體積一定時，物質(zhì)在固定液中的溶解度越大，分配系數(shù)越大，保固定液

32、中的溶解度越大，分配系數(shù)越大，保留時間越長；反之，在固定液中的溶解度越留時間越長；反之，在固定液中的溶解度越小，分配系數(shù)越小，保留時間越小。小，分配系數(shù)越小，保留時間越小。 宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室4 4、液液分配色譜法的流動相、液液分配色譜法的流動相v在液液分配色譜中，流動相一般采用與固定液性在液液分配色譜中，流動相一般采用與固定液性質(zhì)相差很大的不混溶的溶劑為流動相，質(zhì)相差很大的不混溶的溶劑為流動相，流動相對固流動相對固定相的溶解度盡可能小定相的溶解度盡可能小，因此固定液和流動相的性，因此固定液和流動相的性質(zhì)往往處于兩個極端，例如當選擇固定液是極性物質(zhì)往往處于兩

33、個極端，例如當選擇固定液是極性物質(zhì)時，所選用的流動相通常是極性很小的溶劑或非質(zhì)時，所選用的流動相通常是極性很小的溶劑或非極性溶劑。極性溶劑。v流動相使用前需流動相使用前需預先用固定液飽和預先用固定液飽和，或在分析柱前，或在分析柱前增加預飽和柱，以避免固定液流失。增加預飽和柱，以避免固定液流失。 宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室45三、正相硅膠反相洗脫色譜法三、正相硅膠反相洗脫色譜法宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室NS/RENS/RE的簡介的簡介v1975年年Jane首次報道在普通正相硅膠柱上，用強極首次報道在普通正相硅膠柱上，用強極性的水為流動相成功

34、分離了堿性藥物。性的水為流動相成功分離了堿性藥物。v1987年年Law研究了這種稱之為正相硅膠研究了這種稱之為正相硅膠/反相洗脫反相洗脫（NS/RE）色譜中堿性藥物的保留機理，認為其保）色譜中堿性藥物的保留機理，認為其保留主要由于離子交換所引起。留主要由于離子交換所引起。vNS/RE具有不需反相高效液相色譜（具有不需反相高效液相色譜（RP-HPLC）中）中復雜的處理手段、堿性藥物保留時間大大縮短及拖復雜的處理手段、堿性藥物保留時間大大縮短及拖尾改善、峰形對稱等優(yōu)點，是一種分析中藥中的生尾改善、峰形對稱等優(yōu)點，是一種分析中藥中的生物堿成分，或化學合成的生物堿類藥物及其代謝物物堿成分，或化學合成的

35、生物堿類藥物及其代謝物的簡便、有效、理想的方法。的簡便、有效、理想的方法。宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室1 1、固定相、固定相v本法采用未改性的本法采用未改性的原形硅膠原形硅膠為固定相，以水性溶液為固定相，以水性溶液作流動相。作流動相。v以普通硅膠作固定相簡單、方便，不需以普通硅膠作固定相簡單、方便，不需HPLC眾多眾多的鍵合相就能達到滿意的分離效果。在高的鍵合相就能達到滿意的分離效果。在高pH值值（pH8）的水有機溶劑混合液中，固定相穩(wěn)定，）的水有機溶劑混合液中，固定相穩(wěn)定，硅膠不溶于高濃度極性有機溶劑硅膠不溶于高濃度極性有機溶劑高高pH值的流動相值的流動相中，可使用

36、數(shù)月不影響柱效中，可使用數(shù)月不影響柱效 。宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室2 2、保留機理、保留機理vNS/RE對堿性藥物的保留主要是由于對堿性藥物的保留主要是由于離子交換機理離子交換機理。v在高在高pH值的條件下，硅膠表面弱酸性的硅羥基存在值的條件下，硅膠表面弱酸性的硅羥基存在一定的離子化特征，因而硅膠在高一定的離子化特征，因而硅膠在高pH值的情況下可值的情況下可作為陽離子交換劑。而許多堿性化合物在高作為陽離子交換劑。而許多堿性化合物在高pH值值（pH10）時也能部分質(zhì)子化，這樣）時也能部分質(zhì)子化，這樣NS/RE中具備了中具備了陽離子交換的物質(zhì)條件。陽離子交換的物質(zhì)條件

37、。vNS/RE系統(tǒng)種組分主要系統(tǒng)種組分主要依堿性強弱出峰依堿性強弱出峰，色譜峰的，色譜峰的對稱性很好，峰形尖銳。對稱性很好，峰形尖銳。宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室3 3、流動相、流動相vNS/RE法常用的流動相為甲醇水相緩沖液或乙腈法常用的流動相為甲醇水相緩沖液或乙腈水相緩沖液，合適的緩沖劑有三乙胺、硝酸銨水相緩沖液，合適的緩沖劑有三乙胺、硝酸銨氨水、甲酸銨氨水、高氯酸銨氨水、醋酸銨氨水、甲酸銨氨水、高氯酸銨氨水、醋酸銨氨水及磷酸氫二銨磷酸等，由于氨水及磷酸氫二銨磷酸等，由于NS/RE利用被測利用被測組分與硅醇基相互作用，因此不需要加硅醇基掩蔽組分與硅醇基相互作用，因

38、此不需要加硅醇基掩蔽劑等特殊添加劑，僅用一、二種洗脫液就能對大范劑等特殊添加劑，僅用一、二種洗脫液就能對大范圍內(nèi)的堿性藥物進行分離分析。圍內(nèi)的堿性藥物進行分離分析。宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室4 4、影響色譜保留因素、影響色譜保留因素 v 保持流動相一定的保持流動相一定的pH值和離子強度，隨著流值和離子強度，隨著流動相中水的比例增加，洗脫能力減小。動相中水的比例增加，洗脫能力減小。 v 流動相中三乙胺濃度升高，對含堿性基團組流動相中三乙胺濃度升高，對含堿性基團組分的洗脫能力提高，保留時間縮短。三乙胺分的洗脫能力提高，保留時間縮短。三乙胺為陰離子競爭離子，用于競爭硅羥基

39、，以消為陰離子競爭離子，用于競爭硅羥基，以消除硅羥基對生物間的吸附。除硅羥基對生物間的吸附。宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室v 堿性組分的保留隨緩沖鹽濃度的增加（離子強度增堿性組分的保留隨緩沖鹽濃度的增加（離子強度增加）而減少，這與典型的離子交換系統(tǒng)類似。加）而減少，這與典型的離子交換系統(tǒng)類似。 固定相：固定相：Radial-PAK硅膠；硅膠；流動相：乙腈水（流動相：乙腈水（60：40， pH 7.8）;1.異丙嗪異丙嗪 2. 撲爾敏撲爾敏 3.奎尼丁奎尼丁離子強度對保留的影響離子強度對保留的影響4 4、影響色譜保留因素、影響色譜保留因素宋宋 敏敏中國藥科大學藥分教研室中國藥科大學藥分教研室v pH值對值對NS/RE的色譜保留具有兩面性。隨的色譜保留具有兩面性。隨pH值的值的增加，堿性藥物的保留先增加后減小。增加，堿性藥物的保留先增加后減小。pH對保留的影響對保留的影響固定相：固定相：Radial-PAK硅膠；硅膠；流動相：乙腈水（流動相：乙腈水（60：40， 4mmol/L NaCl）;1.異丙嗪異丙嗪 2. 去甲麻黃堿去甲麻黃堿 3.奎