第三節(jié) 色譜分離法

1、第三節(jié)第三節(jié) 色譜分離法色譜分離法 1906年，俄國植物學(xué)家年，俄國植物學(xué)家Tswett 目的目的：分離植物色素：分離植物色素 過程過程：將植物綠葉的石油醚提取液倒入：將植物綠葉的石油醚提取液倒入 玻璃管中，并用石油醚不斷淋洗，玻璃管中，并用石油醚不斷淋洗， 逐漸形成色帶，各色素成分被分離逐漸形成色帶，各色素成分被分離 命名命名：分離方法為：分離方法為“色譜法色譜法” 稱稱： 玻璃管玻璃管 “ “色譜柱色譜柱” 稱稱： 碳酸鈣碳酸鈣 “ “固定相固定相” 稱稱： 石油醚石油醚 “ “流動相流動相” 石油醚石油醚植物色素分離圖示植物色素分離圖示色譜法是一種現(xiàn)代化的物理化學(xué)色譜法是一種現(xiàn)代化的物理

2、化學(xué)分離分離、分析分析方法。方法。特點(diǎn)：特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：三高一快優(yōu)點(diǎn)：三高一快選擇性高：可將性質(zhì)相似，結(jié)構(gòu)相近的組選擇性高：可將性質(zhì)相似，結(jié)構(gòu)相近的組分分開。分分開。分離效率高：能一次分離多種組分。分離效率高：能一次分離多種組分。檢測靈敏度高：能分析檢測靈敏度高：能分析1010-11-111010-13-13g g的物質(zhì)，的物質(zhì)，適于微量和痕量分析。適于微量和痕量分析。分析速度快：幾分鐘、十幾分鐘、幾十分分析速度快：幾分鐘、十幾分鐘、幾十分鐘完成分離，一次鐘完成分離，一次 可以測多種樣品可以測多種樣品應(yīng)用范圍廣：氣體、固體、液體應(yīng)用范圍廣：氣體、固體、液體基本概念：基本概念：固定相：固定相：在色譜

3、分離中固定不動，對化學(xué)成在色譜分離中固定不動，對化學(xué)成分產(chǎn)生保留的一相。（固體或液體）分產(chǎn)生保留的一相。（固體或液體）流動相：流動相：色譜過程中與固定相處于平衡狀態(tài)，色譜過程中與固定相處于平衡狀態(tài)，攜帶待測組分向前移動的物質(zhì)稱為流動相。攜帶待測組分向前移動的物質(zhì)稱為流動相。（氣體或液體）（氣體或液體）基本概念：基本概念：活化：活化：在一定溫度下加熱去除吸附劑中的水在一定溫度下加熱去除吸附劑中的水分，使其吸附能力提高，活性增強(qiáng)的過程。分，使其吸附能力提高，活性增強(qiáng)的過程。去活化：去活化：向吸附劑中加入一定量水分，使其向吸附劑中加入一定量水分，使其吸附能力降低，活性減弱的過程。吸附能力降低，活性減

4、弱的過程。液相色譜：液相色譜：流動相為液體的稱為液相色譜。流動相為液體的稱為液相色譜。氣相色譜：氣相色譜：流動相為氣體的稱為氣象色譜。流動相為氣體的稱為氣象色譜。按流動相分按流動相分氣相色譜氣相色譜液相色譜液相色譜超臨界流體色譜超臨界流體色譜按機(jī)理分按機(jī)理分吸附色譜吸附色譜分配色譜分配色譜離子交換色譜離子交換色譜凝膠色譜凝膠色譜 分類分類吸附色譜吸附色譜利用固定相中吸附劑表面對各組分利用固定相中吸附劑表面對各組分 不同的物理吸附能力不同的物理吸附能力( (氣氣固色譜）固色譜）分配色譜分配色譜不同組分在兩相中有不同的分配系不同組分在兩相中有不同的分配系 數(shù)數(shù)( (氣氣液色譜液色譜) )離子交換色

5、譜離子交換色譜利用離子交換原理利用離子交換原理( (離子色譜離子色譜) )凝膠色譜凝膠色譜利用多空性物質(zhì)對不同大小分子的利用多空性物質(zhì)對不同大小分子的 排阻作用排阻作用( (液相色譜液相色譜) )吸附色譜法吸附色譜法當(dāng)溶液中某組分的分子在運(yùn)動中碰到一個固體表面時，分當(dāng)溶液中某組分的分子在運(yùn)動中碰到一個固體表面時，分子會貼在固定表面上，這就發(fā)生了吸附作用。子會貼在固定表面上，這就發(fā)生了吸附作用。 1.分離原理分離原理 各組分與流動相分子爭奪吸附劑表面活各組分與流動相分子爭奪吸附劑表面活性中心性中心, ,利用吸附劑對不同組分的吸附能力差異而實現(xiàn)利用吸附劑對不同組分的吸附能力差異而實現(xiàn)分離分離. .

6、經(jīng)過吸附、解吸、再吸附、再解吸經(jīng)過吸附、解吸、再吸附、再解吸最后混合最后混合物得到分離物得到分離. . 把含有A、B兩組分的樣品加到色譜柱頂端，A、B均被吸附到固定相上。（號柱）11用適當(dāng)?shù)牧鲃酉鄾_洗色譜柱，當(dāng)流動相流過時，已被吸附在固定相上的兩種組分又溶解于流動相中，而被解吸附，并隨流動相向前移進(jìn)。（號柱）12如此，隨著流動相的不斷沖洗，在色譜柱上不斷地發(fā)生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的過程。（、號柱）如果A、B兩組分在吸附劑上，被吸附力存在微小差異，就會被分離。13結(jié)果使吸附能力弱的B組分先從色譜柱中留出。（、號柱）吸附能力強(qiáng)的A組分后從色譜柱中留出。（、號柱） 14吸附色譜法的分離效果

7、，取決于吸附色譜法的分離效果，取決于: :吸附劑吸附劑( (硅膠、氧化鋁、活性炭）硅膠、氧化鋁、活性炭）溶劑溶劑（流動相）（流動相）被分離化合物的性質(zhì)被分離化合物的性質(zhì)適用于分離中等分子量（甲醇乙醇丙酮正丁醇乙酸乙酯三氯甲烷乙醚苯四氯化碳環(huán)己烷石油醚20（三）溶劑（流動相）流動相的選擇：流動相的選擇：21薄層色譜法薄層色譜法 薄層色譜是在平面上進(jìn)行分離的一種方法，又叫薄層色譜是在平面上進(jìn)行分離的一種方法，又叫平面色譜法平面色譜法。通常將固定相。通常將固定相( (吸附劑吸附劑) )均勻地涂鋪在表均勻地涂鋪在表面潔凈的玻璃、塑料或金屬板形成薄層，制成面潔凈的玻璃、塑料或金屬板形成薄層，制成薄板薄板

8、，進(jìn)，進(jìn)行樣品分離。行樣品分離。（1 1）軟板的制備）軟板的制備軟板：直接將吸附劑鋪在玻璃板上制成，不加粘合劑軟板：直接將吸附劑鋪在玻璃板上制成，不加粘合劑要求：厚度要求：厚度隨分離要求而定，一般隨分離要求而定，一般0.250.250.5mm0.5mm 玻璃棒推動速度不宜過快、也不應(yīng)停頓玻璃棒推動速度不宜過快、也不應(yīng)停頓影響厚度均一影響厚度均一性性操作步驟操作步驟2、點(diǎn)樣、點(diǎn)樣（1 1）樣品溶液的制備：）樣品溶液的制備： 2、點(diǎn)樣、點(diǎn)樣（2 2）點(diǎn)樣量：）點(diǎn)樣量： 與薄層板的關(guān)系與薄層板的關(guān)系 太多太少的影響太多太少的影響點(diǎn)樣基線：距底邊點(diǎn)樣基線：距底邊2.0cm2.0cm樣點(diǎn)直徑：樣點(diǎn)直徑：

9、2-4mm2-4mm點(diǎn)間距離：點(diǎn)間距離：1.5-2.0cm1.5-2.0cm2、點(diǎn)樣、點(diǎn)樣（3 3）點(diǎn)樣方法：）點(diǎn)樣方法： 劃線、樣品記號點(diǎn)、點(diǎn)樣劃線、樣品記號點(diǎn)、點(diǎn)樣 注：動作要輕，注：動作要輕， 毛細(xì)管或點(diǎn)樣器不能混用，毛細(xì)管或點(diǎn)樣器不能混用， 斑點(diǎn)大小適當(dāng)，可多次點(diǎn)樣。斑點(diǎn)大小適當(dāng)，可多次點(diǎn)樣。平頭平頭50ul50ul微量點(diǎn)樣器微量點(diǎn)樣器全自動點(diǎn)樣儀全自動點(diǎn)樣儀3、展開、展開展開缸（色譜缸）展開缸（色譜缸）3、展開、展開（1 1）展開方式：）展開方式：a a、近水平展開、近水平展開特點(diǎn)：速度快、適用于軟板的展開。特點(diǎn)：速度快、適用于軟板的展開。3、展開、展開（1 1）展開方式：）展開方式

10、：b b、上行展開、上行展開 過程：預(yù)飽和（濾紙貼于展開槽內(nèi)側(cè)）、展開、標(biāo)記過程：預(yù)飽和（濾紙貼于展開槽內(nèi)側(cè)）、展開、標(biāo)記溶劑前沿溶劑前沿4、顯色和定位、顯色和定位一般規(guī)律：一般規(guī)律：日光下觀察、紫外燈下觀察、加顯色劑日光下觀察、紫外燈下觀察、加顯色劑加顯色劑：多噴霧，軟板使用浸漬顯色法加顯色劑：多噴霧，軟板使用浸漬顯色法紫外燈觀察紫外燈觀察噴顯色劑觀察噴顯色劑觀察判斷依據(jù)：判斷依據(jù)：R Rf f值值 四、結(jié)果計算和判斷四、結(jié)果計算和判斷原點(diǎn)到溶劑前沿的距離原點(diǎn)到溶劑前沿的距離原點(diǎn)到斑點(diǎn)中心的距離原點(diǎn)到斑點(diǎn)中心的距離 fR溶劑溶劑前沿前沿起始線起始線ABabc（1 1）比移值）比移值R Rf

11、f：原原點(diǎn)點(diǎn)到到溶溶劑劑前前沿沿的的距距離離原原點(diǎn)點(diǎn)到到斑斑點(diǎn)點(diǎn)中中心心的的距距離離 fRcbRcaR)b(f)a(f R Rf f是薄層色譜法基本是薄層色譜法基本定性定性參數(shù)，一定條件時參數(shù)，一定條件時R Rf f為為定值，在定值，在0 01 1之間，可用范圍之間，可用范圍R Rf f值在值在0.20.20.80.8之之間。組分極性越大，間。組分極性越大，R Rf f越小越小, ,反之越大反之越大。硅膠、氧化鋁薄層：被分離物質(zhì)硅膠、氧化鋁薄層：被分離物質(zhì)極性越大，越易被吸極性越大，越易被吸附。附。一般規(guī)律：一般規(guī)律：（1）官能團(tuán)極性越大官能團(tuán)極性越大，整個分子極性越大，越易被吸整個分子極性越

12、大，越易被吸附；附；（2）形成分子內(nèi)）形成分子內(nèi)H鍵時，被吸附力減弱；鍵時，被吸附力減弱；（3）同系物中，）同系物中，分子量越大，極性越小分子量越大，極性越小， 被吸附力越弱。被吸附力越弱。被分離物質(zhì)極性與吸附能力的關(guān)系被分離物質(zhì)極性與吸附能力的關(guān)系硅膠薄層色譜規(guī)律總結(jié)硅膠薄層色譜規(guī)律總結(jié)被分離組分被分離組分展開劑展開劑R Rf f被分離物洗脫被分離物洗脫順序順序極性大極性大極性大極性大小小后洗脫后洗脫極性小極性小極性小極性小大大先洗脫先洗脫二、分配色譜法二、分配色譜法 1.1.分離原理：分離原理：將液體均勻地涂漬在將液體均勻地涂漬在惰性物質(zhì)惰性物質(zhì)( (載載體體) )表面上作為固定相，利用被

13、分離組分在固定表面上作為固定相，利用被分離組分在固定相與流動相中的溶解度差別所造成的相與流動相中的溶解度差別所造成的分配系數(shù)差分配系數(shù)差別別而被分離。而被分離。2.固定相和流動相固定相和流動相要求要求：固定相固定相機(jī)械吸附在機(jī)械吸附在惰性載體惰性載體上的上的液體液體, ,常用的固定液有常用的固定液有水、稀硫酸、甲醇、甲酰胺等強(qiáng)極性溶劑水、稀硫酸、甲醇、甲酰胺等強(qiáng)極性溶劑 載載 體體惰性物質(zhì)，無吸附性惰性物質(zhì)，無吸附性性質(zhì)穩(wěn)定，性質(zhì)穩(wěn)定，不與固定相和流不與固定相和流動相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)動相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)常用的有吸水硅膠、纖維素、多孔硅常用的有吸水硅膠、纖維素、多孔硅藻土等。藻土等。流動相流動相必須與固

14、定相必須與固定相不為互溶不為互溶石油醚、醇類、酮類、石油醚、醇類、酮類、酯類、鹵代烷及苯等。酯類、鹵代烷及苯等。3.洗脫順序洗脫順序 正相色譜正相色譜 固定相極性固定相極性大于大于流動相極性流動相極性, ,主要分離極性主要分離極性樣品樣品. .極性極性弱弱的組分的組分先先被洗脫，極性被洗脫，極性強(qiáng)強(qiáng)的組分的組分后后被洗脫。被洗脫。 反相色譜反相色譜 固定相極性固定相極性小于小于流動相極性流動相極性, ,主要分離非主要分離非極性樣品和中等極性樣品極性樣品和中等極性樣品. .極性極性強(qiáng)強(qiáng)的組分的組分先先出柱，極出柱，極性性弱弱的組分的組分后后出柱。出柱。 定義：定義： 紙色譜分離法又稱紙層析法，是

15、根據(jù)不紙色譜分離法又稱紙層析法，是根據(jù)不同物質(zhì)在兩相中的同物質(zhì)在兩相中的分配比分配比不同而進(jìn)行分離不同而進(jìn)行分離的一種微量分離方法。的一種微量分離方法。紙色譜法紙色譜法載體載體層析紙（濾紙）；層析紙（濾紙）；固定相固定相濾紙上的吸濕水分；濾紙上的吸濕水分；流動相流動相有機(jī)溶劑（展開劑）。有機(jī)溶劑（展開劑）。 主要儀器：主要儀器：（1 1）玻璃層析筒）玻璃層析筒 150mm300mm(h)。（2）層析紙條）層析紙條 100mm240mm 。（3）毛細(xì)管）毛細(xì)管 直徑直徑1mm左右。左右。（4 4）噴霧器）噴霧器 儀器試劑儀器試劑主要試劑：主要試劑：（1）展開劑展開劑 正丁醇正丁醇: :甲酸甲酸:

16、 :水水60:12:8。（2）氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液）氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 2 gL-1水溶液。水溶液。（3）茚三酮）茚三酮 1 gL-1乙醇溶液。乙醇溶液。（4）氨基酸混合試液）氨基酸混合試液 將（將（2）配制的三）配制的三種氨基酸等量混合。種氨基酸等量混合。儀器試劑儀器試劑實驗步驟實驗步驟點(diǎn)樣點(diǎn)樣展開分離展開分離顯色顯色計算比移值計算比移值 （1）計算計算RF。 （2）定性分析。）定性分析。數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理 四、聚酰胺吸附色譜法聚酰胺：固定相流動相H2CCH2H2CCH2H2CCNCH2H2CCH2H2CCH2CNH2CCH2OOHHCH2H2CCH2H2CCH2NCH2CCH2H2CCH2H2CNCC

17、H2H2CHOOHOHO（3）吸附規(guī)律：）吸附規(guī)律： 1 形成氫鍵基團(tuán)數(shù)目越多，則吸附能力越強(qiáng)形成氫鍵基團(tuán)數(shù)目越多，則吸附能力越強(qiáng) 2 形成氫鍵基團(tuán)位置不同，被吸附的強(qiáng)度也不同形成氫鍵基團(tuán)位置不同，被吸附的強(qiáng)度也不同 3 分子芳香核、共軛雙鍵越多，吸附越牢分子芳香核、共軛雙鍵越多，吸附越牢 4 化合物形成分子內(nèi)氫鍵，則被吸附的強(qiáng)度減小化合物形成分子內(nèi)氫鍵，則被吸附的強(qiáng)度減小 5與溶劑介質(zhì)有關(guān)與溶劑介質(zhì)有關(guān).形成氫鍵能力形成氫鍵能力: 水中最強(qiáng)水中最強(qiáng),堿中最弱堿中最弱五、離子交換色譜法五、離子交換色譜法要求要求：固定相固定相離子交換樹脂離子交換樹脂流動相流動相水為溶劑的緩沖溶液水為溶劑的緩沖溶

18、液被分離組分被分離組分離子型的有機(jī)物或無機(jī)物離子型的有機(jī)物或無機(jī)物1.分離原理分離原理依據(jù)被測組分與離子交換劑交換能力（親和力）不同而實依據(jù)被測組分與離子交換劑交換能力（親和力）不同而實現(xiàn)分離現(xiàn)分離離子交換的基本過程：離子交換的基本過程：2.固定相和流動相固定相和流動相 固定相固定相是離子交換劑是離子交換劑 常見的是常見的是離子交換樹脂，離子交換樹脂，是具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)高分子的聚合物。如，苯乙烯是具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)高分子的聚合物。如，苯乙烯和二乙烯苯聚合和二乙烯苯聚合 ，其中二乙烯苯是交聯(lián)劑。，其中二乙烯苯是交聯(lián)劑。 流動相流動相水、緩沖溶液、或加入少量的乙醇、四氫水、緩沖溶液、或加入少量的乙醇

19、、四氫呋喃、乙腈等有機(jī)溶劑，提高選擇性呋喃、乙腈等有機(jī)溶劑，提高選擇性六、凝膠色譜法六、凝膠色譜法 凝膠色譜是基于凝膠色譜是基于分子大小不同分子大小不同而進(jìn)行分而進(jìn)行分離的一種分離技術(shù)（分子篩）離的一種分離技術(shù)（分子篩）。它具有。它具有一系列一系列優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：操作方便、不會使物質(zhì)變：操作方便、不會使物質(zhì)變性、適用于不穩(wěn)定的化合物、凝膠不用性、適用于不穩(wěn)定的化合物、凝膠不用再生、可反復(fù)使用再生、可反復(fù)使用。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：分離速度較分離速度較慢。慢。凝膠過濾層析過程示意凝膠過濾層析過程示意圖圖小分子小分子大分子大分子凝膠基質(zhì)凝膠基質(zhì)凝膠凝膠珠珠六、其他色譜法六、其他色譜法（一）大孔樹脂色譜法（一）大孔樹脂色譜法 吸附原理吸附原理范德華引力分子篩范德華引力分子篩 大孔樹脂具有大孔樹脂具有吸附性吸附性及及分子篩分子篩的雙重作用，的雙重作用，可分離天然藥物中可分離天然藥物中相對分子量大小相對分子量大小及及吸附力吸附力強(qiáng)弱不同強(qiáng)弱不同的化學(xué)成分分離。的化學(xué)