藥物分析A生化藥物和基因工程藥物分析PPT課件

1、基本要求基本要求 1 1掌握本類藥物質量檢驗的基本程序與掌握本類藥物質量檢驗的基本程序與方法類型。方法類型。2 2掌握掌握HPLCHPLC法和酶活力測定法在本類藥法和酶活力測定法在本類藥物測定中的應用。物測定中的應用。3 3熟悉本類藥物的范圍、種類、質量控熟悉本類藥物的范圍、種類、質量控制的要點。制的要點。4 4了解本類藥物含量測定的其他方法。了解本類藥物含量測定的其他方法。返 回第1頁/共41頁 一、防病、一、防病、治治 病的病的三大藥三大藥源源 第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述biopharmaceutics or biopharmaceuticalsbiochemical drugsbiotec

2、hnology drugsbiological products藥藥物物化化學學藥藥物物生生物物藥藥物物中中藥藥生生化化藥藥物物生生物物技技術術藥藥物物生生物物制制品品第2頁/共41頁 1 1生化藥物：生化藥物： 例例：氨基酸、多肽、蛋白質、酶等。：氨基酸、多肽、蛋白質、酶等。動動物物植植物物微微生生物物提提取取現(xiàn)現(xiàn)代代生生物物技技術術生生命命基基本本物物質質及及衍衍生生物物降降解解物物大大分分子子的的結結構構修修飾飾物物生生物物- -化化學學半半合合成成第3頁/共41頁2. 2. 基因工程藥物基因工程藥物： 以以DNADNA重組技術生產的蛋白質、多肽、重組技術生產的蛋白質、多肽、酶、激素、疫

3、苗、單克隆抗體和細胞生長酶、激素、疫苗、單克隆抗體和細胞生長因子類藥物。因子類藥物。第4頁/共41頁DNADNA重組技術（基因工程）：重組技術（基因工程）：生產過程生產過程為為天然基因天然基因合成的核合成的核苷酸序列苷酸序列內切酶內切酶連接酶連接酶載載體體重組重組的遺的遺傳物傳物質質轉轉移移到到宿主宿主細胞細胞增殖、表達增殖、表達分離純化分離純化目的目的產物產物第5頁/共41頁二、種類二、種類氨基酸、多肽與蛋白質類氨基酸、多肽與蛋白質類酶類與輔酶類酶類與輔酶類多糖類多糖類脂質類脂質類核酸及其降解物和衍生物核酸及其降解物和衍生物類藥物類藥物1 1生化藥物生化藥物第6頁/共41頁2 2基因工程藥物

4、的種類基因工程藥物的種類 1 1）激素類及神經遞質類藥物：）激素類及神經遞質類藥物： 人生長激素釋放抑制因子、人人生長激素釋放抑制因子、人胰島素、人生長激素胰島素、人生長激素 2 2）細胞因子類藥物：）細胞因子類藥物： 人干擾素人白細胞介素、集落人干擾素人白細胞介素、集落刺激因子、促紅細胞生成素刺激因子、促紅細胞生成素 3 3）酶類及凝血因子類藥物）酶類及凝血因子類藥物第7頁/共41頁 三、特點三、特點 1. 1. 生物體的基本生化成分生物體的基本生化成分 2. 2. 分子量大分子量大: : 分子量測定分子量測定 3. 3. 結構難確證結構難確證 4. 4. 全過程的質量控制：原料、生產過程、

5、全過程的質量控制：原料、生產過程、 最終產品最終產品 5. 5. 生物活性檢查生物活性檢查第8頁/共41頁 6. 6. 安全性檢查安全性檢查 7. 7. 效價（含量）測定：效價（含量）測定： 理化法理化法：有效成分的含量：有效成分的含量 效價測定和酶活力測定效價測定和酶活力測定：有效成分：有效成分 的生物活性的生物活性返 回第9頁/共41頁 生化藥物和基因藥物質量控制的項目：生化藥物和基因藥物質量控制的項目： 來源與種類來源與種類 純度純度 性狀性狀 干燥失重或干燥失重或水分水分 鑒別鑒別 熾灼殘渣熾灼殘渣 氨酸組分分析氨酸組分分析 生物活性生物活性 肽圖肽圖 熱源試驗熱源試驗 糖含量糖含量

6、含量分析含量分析 第二節(jié)第二節(jié) 質量檢驗的基本程序與方法質量檢驗的基本程序與方法第10頁/共41頁一、鑒別一、鑒別 理化鑒別法：化學鑒別法理化鑒別法：化學鑒別法 紫外分光光度紫外分光光度法法 HPLCHPLC法法生化鑒別法：酶法生化鑒別法：酶法 電泳法電泳法 等電聚焦法等電聚焦法生物鑒別法：家兔驚厥試驗生物鑒別法：家兔驚厥試驗第11頁/共41頁（一）理化鑒別法一）理化鑒別法 1.1.化學鑒別法化學鑒別法： 例：溶菌酶例：溶菌酶 - CONH- +Cu- CONH- +Cu2+ 2+ 絡合顯色絡合顯色藥藥物物 + + 試試劑劑現(xiàn)現(xiàn)象象顏顏色色沉沉淀淀第12頁/共41頁 2.2.紫外分光光度法紫外

7、分光光度法 溶劑：溶劑：0.01mol/L0.01mol/L鹽鹽酸酸例：三磷酸腺苷二鈉例：三磷酸腺苷二鈉 濃度：濃度：20g/ml20g/ml 判斷：判斷： maxmax：2572571nm1nm A A250250/A/A260260：0.170.170.270.27。3. 3. HPLCHPLC法：法： 利用對照品溶液和供試品溶液色譜圖的保利用對照品溶液和供試品溶液色譜圖的保留留時間和肽圖譜的一致性進行鑒別。時間和肽圖譜的一致性進行鑒別。 第13頁/共41頁 4. 4.酶法酶法： 例：尿激酶的鑒別例：尿激酶的鑒別-氣泡上升法氣泡上升法 原理：原理：牛牛 纖纖 維維 蛋蛋 白白 原原牛牛 凝

8、凝 血血 酶酶蛋蛋 白白 結結 塊塊尿尿 激激 酶酶牛牛 纖纖 維維 蛋蛋 白白 溶溶 酶酶 原原結結 塊塊 溶溶 解解 ：氣氣 泡泡 上上 升升第14頁/共41頁 方法方法： 取小試管，加入尿激酶巴比妥溶液、牛取小試管，加入尿激酶巴比妥溶液、牛纖維蛋白原溶液，再依次加入牛纖維蛋白溶酶纖維蛋白原溶液，再依次加入牛纖維蛋白溶酶原溶液、牛凝血酶溶液，迅速搖勻，立即置原溶液、牛凝血酶溶液，迅速搖勻，立即置37370.50.5恒溫水浴保溫，記時。反應系統(tǒng)恒溫水浴保溫，記時。反應系統(tǒng)在在30304040秒內凝結，凝結塊內有氣泡生成，秒內凝結，凝結塊內有氣泡生成，1515分鐘內凝結塊溶解，當凝結塊溶解時，

9、氣泡分鐘內凝結塊溶解，當凝結塊溶解時，氣泡逐漸上升。以逐漸上升。以0.9%0.9%氯化鈉作空白，同法氯化鈉作空白，同法 操作，操作，凝結塊在凝結塊在2 2小時內不溶。小時內不溶。第15頁/共41頁5. 5. 電泳法電泳法：以肝素鑒別為例。：以肝素鑒別為例。OOOOOOHCOO-OSO3-HNSO3-CH2OSO3-與國家肝素標準品對照，其移動位置相應。與國家肝素標準品對照，其移動位置相應。第16頁/共41頁 6. 6. 生物法生物法： 利用生物體進行試驗來鑒別藥物。利用生物體進行試驗來鑒別藥物。 例：家兔驚厥試驗鑒別胰島素。例：家兔驚厥試驗鑒別胰島素。 利用胰島素的降糖作用。給家兔大劑量注射胰

10、島素，家兔驚厥，迅速利用胰島素的降糖作用。給家兔大劑量注射胰島素，家兔驚厥，迅速靜注靜注50%GS50%GS，驚厥停止。，驚厥停止。第17頁/共41頁（二）雜質檢查二）雜質檢查 一般雜質檢查一般雜質檢查 特殊雜質檢查：原料藥純度分析特殊雜質檢查：原料藥純度分析 生產過程中雜質的檢查生產過程中雜質的檢查 1. 1. 原料藥純度分析原料藥純度分析： 多糖類多糖類-低聚糖、核酸、蛋白質低聚糖、核酸、蛋白質 酶類藥物酶類藥物-酶催化反應基本產物的分析，酶催化反應基本產物的分析， 具有一定活性的其他有關酶的檢查。具有一定活性的其他有關酶的檢查。第18頁/共41頁例例：胰蛋白酶中糜蛋白酶的檢查：胰蛋白酶中

11、糜蛋白酶的檢查 選用選用N-N-乙酰乙酰-L-L-酪氨酸乙酯作底物進行酪氨酸乙酯作底物進行糜蛋白酶的限度檢查。糜蛋白酶的限度為糜蛋白酶的限度檢查。糜蛋白酶的限度為25002500個胰蛋白酶單位中不得大于個胰蛋白酶單位中不得大于5050單位，按單位，按每每1mg1mg胰蛋白酶為胰蛋白酶為25002500個單位和每個單位和每1mg1mg糜蛋白糜蛋白酶為酶為10001000單位，折算成重量，則糜蛋白酶的單位，折算成重量，則糜蛋白酶的限度為限度為5%5%（g/gg/g）。）。1:1000=x:50 x=0.051:1000=x:50 x=0.05（mgmg） L=0.05/1=5% L=0.05/1=

12、5% 2. 2. 生產過程中雜質的檢查生產過程中雜質的檢查第19頁/共41頁 （三）安全性試驗（三）安全性試驗 熱源試驗熱源試驗 異常毒性試驗異常毒性試驗 : :急性毒性物質急性毒性物質 過敏試驗：異性蛋白過敏試驗：異性蛋白 降壓物質試驗：導致血壓降低的雜質、降壓物質試驗：導致血壓降低的雜質、組組 胺、類組胺胺、類組胺第20頁/共41頁 無菌試驗：活菌無菌試驗：活菌 基因工程藥物中可能雜質與污染物檢查基因工程藥物中可能雜質與污染物檢查 來源于宿主細胞的殘留來源于宿主細胞的殘留DNADNA，外源性雜質，外源性雜質 致突變試驗致突變試驗 生殖毒性試驗生殖毒性試驗第21頁/共41頁（四）含量測定（四

13、）含量測定生化藥物和基因藥物的含量表示方法：生化藥物和基因藥物的含量表示方法：百分含量百分含量：適用于結構明確的小分子：適用于結構明確的小分子藥藥 物或經水解后變成小分子物或經水解后變成小分子的的 藥物。藥物。生物效價或酶活力單位生物效價或酶活力單位：適用于酶類、：適用于酶類、 蛋白質類蛋白質類藥物。藥物。第22頁/共41頁含量測定方法含量測定方法： 理化分析法理化分析法： 化學分析法：重量測定法、滴定分析法化學分析法：重量測定法、滴定分析法 電化學分析法電化學分析法 光譜分析法：比色法、紫外分光、熒光分光光譜分析法：比色法、紫外分光、熒光分光光法光法 色譜分析法：色譜分析法：HPLCHPLC

14、法：法：RP-HPLCRP-HPLC、 HPIEC HPIEC 、HPGFCHPGFC、 灌注色譜法、灌注色譜法、HPCEHPCE法法 酶法酶法：酶活力測定法、酶分析法：酶活力測定法、酶分析法 電泳法電泳法 生物檢定法生物檢定法返 回第23頁/共41頁 1 1電化學分析法電化學分析法 藥物膜電極藥物膜電極 生物組織膜生物組織膜電極電極 藥物電極藥物電極 微生物電極微生物電極 離子選擇性電極法離子選擇性電極法 免疫電極免疫電極 免疫場效應免疫場效應管管 酶電極酶電極 第三節(jié)第三節(jié) 常用定量分析方法及其應用常用定量分析方法及其應用 第24頁/共41頁 2. HPLC2. HPLC法法 1 1）RP

15、-HPLCRP-HPLC：柱前衍生化自動測定氨基酸：柱前衍生化自動測定氨基酸 柱：柱：RPRP1818， 柱溫：柱溫：48 48 流動相：流動相：A-0.05% TFAA-0.05% TFA；B-B-乙腈乙腈- -異丙醇（異丙醇（4 4：1 1） 梯度洗脫梯度洗脫 熒光檢測器：熒光檢測器： exex=280nm=280nm340nm,340nm, emem=430nm=430nm第25頁/共41頁 測定測定： 樣品樣品-肽肽 樣品水解：樣品水解：5.7mol/L5.7mol/L鹽酸，鹽酸，0.1%0.1%苯酚、苯酚、通通N N2 2， 110110，20h 20h 24h24h。 樣品干燥：真

16、空樣品干燥：真空 樣品的衍生化：丹酰氯樣品的衍生化：丹酰氯 水解剩余的衍生化試劑：水解剩余的衍生化試劑：0.4mol/L 0.4mol/L NaOHNaOH 進樣測定進樣測定第26頁/共41頁N(CH3)2SO2ClR-NH2SO2NHRN(CH3)2+第27頁/共41頁第28頁/共41頁 2 2）HPIECHPIEC 測定對象：蛋白質，多肽測定對象：蛋白質，多肽 柱：離子交換鍵合相柱：離子交換鍵合相 流動相：流動相：0.3mol/L0.3mol/L1.0mol/L1.0mol/L的鹽的緩沖液。的鹽的緩沖液。 梯度洗脫：鹽的濃度增大。盡量避免使用鹵梯度洗脫：鹽的濃度增大。盡量避免使用鹵 素類鹽

17、素類鹽 特點：特點：可回收活性蛋白可回收活性蛋白。第29頁/共41頁 3 3）HPGFCHPGFC 應用：蛋白質、多肽的分離及分子量測定。應用：蛋白質、多肽的分離及分子量測定。 示例：重組人腫瘤壞死因子衍生物的分子示例：重組人腫瘤壞死因子衍生物的分子量量 的測定的測定 柱：柱：Beckman Ultraspherogel SEC Beckman Ultraspherogel SEC 30003000 流動相：流動相：0.1mmol/LKH0.1mmol/LKH2 2POPO4 4:0.1mmol/LNa:0.1mmol/LNa2 2SOSO4 4 （1:11:1）0.05%0.05%疊氮化鈉疊

18、氮化鈉第30頁/共41頁標準蛋白分子量曲線的制備標準蛋白分子量曲線的制備： 醛縮酶醛縮酶血清白蛋白血清白蛋白右旋糖苷藍右旋糖苷藍 碳酸酐酶碳酸酐酶抑蛋白酶肽抑蛋白酶肽 酪氨酸酪氨酸T T0 0 完全排阻完全排阻完全進入填料空隙完全進入填料空隙 T Tt t標準蛋白分子量曲線：標準蛋白分子量曲線：K Kd d - lg M.W. - lg M.W.第31頁/共41頁 樣品測定：樣品測定： Kd =T -T0Tt - T0測測定定樣樣品品的的 T T查查出出K Kd d計計算算l lg g M M. .W W. .計計算算M M. .W W. .第32頁/共41頁應用示例應用示例：ChPChP（2

19、0002000）重組人胰島素的質量控制）重組人胰島素的質量控制 1 1）鑒別：）鑒別： 法法1 1：在效價測定項下，供試品主峰的保留時間：在效價測定項下，供試品主峰的保留時間 應與對照品的一致。應與對照品的一致。 法法2 2：供試品與對照品分別經過酶解后，再分別：供試品與對照品分別經過酶解后，再分別 進行梯進行梯 度洗脫，供試品的肽圖譜與對照品度洗脫，供試品的肽圖譜與對照品 的肽圖譜一致。的肽圖譜一致。第33頁/共41頁 2 2）檢查：）檢查： 檢查項目：有關物質、高分子蛋白、鋅、氮、檢查項目：有關物質、高分子蛋白、鋅、氮、 干燥失重、無菌、細菌內毒素。干燥失重、無菌、細菌內毒素。 有關物質：

20、供試液經梯度洗脫，按峰面積歸有關物質：供試液經梯度洗脫，按峰面積歸一化一化 法計算有關物質的量不得超過法計算有關物質的量不得超過3.0%3.0%。 高分子蛋白質：高分子蛋白質： 第34頁/共41頁 固定相固定相：色譜用親水硅膠，它可以分離分子：色譜用親水硅膠，它可以分離分子量量 為為5000500060006000的球狀蛋白。的球狀蛋白。流動相流動相：0.4mol/L 0.4mol/L 碳酸氫銨碳酸氫銨- -乙腈（乙腈（69 : 69 : 3131）測定測定：分別測定供試液（：分別測定供試液（1mg/ml1mg/ml）和對照液）和對照液（將供試液稀釋成（將供試液稀釋成0.01mg/ml0.01

21、mg/ml），供試液顯示），供試液顯示的所有分子量大于重組人胰島素單體的各峰的所有分子量大于重組人胰島素單體的各峰面積之和，應不大于對照液主峰面積（限量面積之和，應不大于對照液主峰面積（限量1.0%)1.0%)。 第35頁/共41頁 3）效價測定：）效價測定：固定相：固定相：ODS CODS C1818 流動相：硫酸鹽緩沖液流動相：硫酸鹽緩沖液- -乙腈（乙腈（74742626） 系統(tǒng)適用性試驗系統(tǒng)適用性試驗：測定胰島素主峰和：測定胰島素主峰和A A2121脫氨脫氨胰胰 島素峰之間的分離度與拖尾因島素峰之間的分離度與拖尾因子。子。含量測定含量測定：分別進樣供試液和對照液，按峰面：分別進樣供試液和對照液，按峰面積積 外標法計算含量。外標法計算含量。第36頁/共41頁3.3.灌注色譜法灌注色譜法 固定相：聚苯乙烯二乙烯高度交聯(lián)結構上構固定