實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ絼?dòng)物斑馬魚左正宏

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ絼?dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ絼?dòng)物斑馬魚斑馬魚左正宏左正宏 斑馬魚概況斑馬魚概況 斑馬魚作為模式生物的優(yōu)點(diǎn)斑馬魚作為模式生物的優(yōu)點(diǎn) 斑馬魚的研究現(xiàn)狀斑馬魚的研究現(xiàn)狀 本課題組利用斑馬魚開展的研究工作本課題組利用斑馬魚開展的研究工作概概 況況 上個(gè)世紀(jì)70年代早期，斑馬魚僅在一個(gè)研究中心被詳細(xì)研究：在位于Eugene 的 俄勒岡大學(xué)， Charles Kimmel 及其同事開始將斑馬魚作為研究發(fā)育的動(dòng)物模型，并探索其作用。第一部分斑馬魚信息：Charles Kimmel斑馬魚作為模式動(dòng)物逐漸受到關(guān)注斑馬魚作為模式動(dòng)物逐漸受到關(guān)注Turn Eyes to FishChri

2、stiane Nsslein-Volhard 1995 諾貝爾獎(jiǎng)生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者（果蠅的發(fā)育研究）was able to identify and classify a small number of genes that are of key importance in determining the body plan and the formation of body segments, turned eyes to fish and find a wide range of mutationsWolfgang Driever國(guó)內(nèi)發(fā)展概況國(guó)內(nèi)發(fā)展概況國(guó)家斑馬魚資源中心 斑馬魚基本特性 產(chǎn)

3、于熱帶印度，孟加拉國(guó)。 成魚體長(zhǎng)46厘米。體呈紡錘形。雌雄易區(qū)分。 性情溫和，對(duì)水溫水質(zhì)要求不高，易飼養(yǎng)。 屬卵生魚類 ，4月齡進(jìn)入性成熟期。繁殖期約7天左右。產(chǎn)卵量高，繁殖力很強(qiáng) 。 體外受精，胚胎透明，在24小時(shí)內(nèi)就可發(fā)育成形， 23天孵出仔魚 。斑馬魚的繁殖斑馬魚的繁殖雄雄魚體修長(zhǎng)，鰭大，體色偏黃，臀鰭呈棕黃色，條紋顯著魚體修長(zhǎng)，鰭大，體色偏黃，臀鰭呈棕黃色，條紋顯著 斑馬魚胚胎早期發(fā)育圖譜斑馬魚胚胎早期發(fā)育圖譜Pascal Haffter et al. Development, 1996, 123, 1-36能發(fā)熒光的熱能發(fā)熒光的熱帶斑馬魚帶斑馬魚普通熱帶斑馬魚是不發(fā)熒普通熱帶斑馬魚是

4、不發(fā)熒光的光的 斑馬魚作為模式動(dòng)物的優(yōu)點(diǎn)斑馬魚作為模式動(dòng)物的優(yōu)點(diǎn) Why Fish? 酵母菌 yeast 蠕蟲 worm (Caenorhabditis elegans) 果蠅 fruit fly (Drosophila) 魚-斑馬魚 zebrafish (Danio rerio) 爪蟾 frog ( xenopus laevis ) 鼠 mouse幾種最常用的模式動(dòng)物 (Model Organism)第二部分Saccharomyces cerevisiae釀酒酵母真菌界的單細(xì)胞真核生物，有16個(gè)染色體它的全基因組已在1996年測(cè)定。細(xì)胞數(shù)目一定：成蟲細(xì)胞數(shù)目只有959個(gè)，其中包括302個(gè)神經(jīng)

5、元；有6條染色體，全基因組于1998年測(cè)定，長(zhǎng)9.7Mb。Caenorhabditis elegans線蟲Drosophila melanogaster果蠅繁殖很快、容易誘發(fā)變異的小昆蟲。總長(zhǎng)達(dá)1.8億核苷酸。xenopus laevis爪蟾Mus musculus小鼠基因組大小與人類相近，約30億個(gè)核苷酸對(duì)，有19條染色體。 “For more than a decade, vertebrate developmental biologists have watched with fascination as the mysteries of early embryonic developm

6、ent were unraveled in the fruit fly Drosophila,None of established vertebrate model share Drosophilas virtues of breeding prolifically and producing readily observable embryos” Science 264, 1994斑馬魚作為模式動(dòng)物的優(yōu)點(diǎn)斑馬魚作為模式動(dòng)物的優(yōu)點(diǎn) Why Fish? The scientific value of the zebrafish lies in its position on the evolu

7、tionary ladder. As a vertebrate, the zebrafish is several rungs closer to humans than are fruit flies (Drosophila) or worms (Caenorhabditis elegans), yet the fish is also much more malleable than most mammalian animal models. hardiness, small size, and brief life span zebrafish eggs are transparent

8、allowing direct visualization of the embryo. A single fish lays hundreds of eggs at a time, providing ample resources for “forward genetic screens” Why Fish?青鳉 （Medaka）Current Research on Zebrafish 發(fā)育發(fā)育 Development 再生再生 Regeneration 疾病疾病 Disease 在體藥物研究在體藥物研究 In vivo drug discovery第三部分 chokh/rx3基因突變導(dǎo)

9、致的眼睛缺失基因突變導(dǎo)致的眼睛缺失發(fā)育發(fā)育 EMBO reports 4, 894899 (2003)chokh 基因突變的恢復(fù)基因突變的恢復(fù) EMBO reports 4, 894899 (2003)斑馬魚眼部突變分類斑馬魚眼部突變分類SCIENCE VOL 295 18 JANUARY 2002突變導(dǎo)致的異常突變導(dǎo)致的異常SCIENCE VOL 295 18 JANUARY 2002心血管系統(tǒng)發(fā)育心血管系統(tǒng)發(fā)育Development of Zebrafish Vascular System Nature Medicine, 1995 Development of Zebrafish Vas

10、cular System28 hours 1.5 days 2 days 2.5 days 3 days 3.5 days 4.5 days 5 days 6 days 7 days 斑馬魚的骨骼發(fā)育斑馬魚的骨骼發(fā)育發(fā)育發(fā)育缺少缺少chordin表達(dá)的斑表達(dá)的斑馬魚的馬魚的BMP蛋白水平蛋白水平異常，鰭和尾部骨架異常，鰭和尾部骨架也異常也異常注射注射chordin mRNA后可恢復(fù)。因后可恢復(fù)。因此研究者使用斑馬魚此研究者使用斑馬魚的這項(xiàng)特性來進(jìn)行基的這項(xiàng)特性來進(jìn)行基因篩查，以確定脊椎因篩查，以確定脊椎動(dòng)物骨骼形成的調(diào)節(jié)動(dòng)物骨骼形成的調(diào)節(jié)機(jī)制。機(jī)制。 Rik DerynckNature Gen

11、etics ,1999Fin and skeletal defects of dintt250 homozygous mutantsnature genetics volume 23 december 1999器官發(fā)生器官發(fā)生: : 心臟和血液形成心臟和血液形成 大多數(shù)脊椎動(dòng)物的器官形狀相似，因此，斑馬魚器官形成的有關(guān)基因也有可能與人類相似。發(fā)育發(fā)育SCIENCE VOL 295 18 JANUARY 2002器官形成模式圖解器官形成模式圖解脊椎動(dòng)物器官形成比較脊椎動(dòng)物器官形成比較SCIENCE VOL 295 18 JANUARY 2002影響心臟各階段發(fā)育的基因突變影響心臟各階段發(fā)育的基因

12、突變影響血液各階段發(fā)育的基因突變影響血液各階段發(fā)育的基因突變SCIENCE VOL 295 18 JANUARY 2002突變對(duì)心臟發(fā)育的影響突變對(duì)心臟發(fā)育的影響The mutant miles apart affects the developing heart (mil, arrow).The cloche mutant has no blood or endothelium.突觸形成的在體影像觀察突觸形成的在體影像觀察 Synaptogenesis imaged in vivo突觸發(fā)生的活體影像觀察突觸發(fā)生的活體影像觀察 Synaptogenesis imaged in vivo miR

13、NA expression in zebrafishembryonic developmentScience, 2005斑馬魚的心臟再生斑馬魚的心臟再生 Heart Regeneration in Zebrafish 斑馬魚的Mps1 mitotic checkpoint kinase是 一個(gè)至關(guān)重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，如發(fā)生突變，則斑馬魚的心臟不能被修復(fù)而形成疤痕。因此，損傷誘導(dǎo)的斑馬魚心肌細(xì)胞增殖可以克服疤痕形成，使心肌再生。這個(gè)發(fā)現(xiàn)表明斑馬魚在分析心臟再生的分子機(jī)制方面起重要作用。再生再生13 DECEMBER 2002 VOL 298 SCIENCE 心臟切除后心室肌的再生心臟切除后心

14、室肌的再生 Regeneration of ventricular myocardium in the resected zebrafish heart 心臟修復(fù)伴隨心肌細(xì)胞再生心臟修復(fù)伴隨心肌細(xì)胞再生 Cardiomyocyte proliferation accompanies zebrafish heart regeneration 無疤痕修復(fù)需要心肌細(xì)胞增殖無疤痕修復(fù)需要心肌細(xì)胞增殖 Cardiomyocyte proliferation is required for scarless regeneration使用斑馬魚進(jìn)行人類疾病的研究使用斑馬魚進(jìn)行人類疾病的研究 大規(guī)模的基因篩查

15、已經(jīng)取得了巨大的成就， 確定了早期發(fā)育中的五百多個(gè)突變表現(xiàn)型。許多基因篩查中確定的斑馬魚的突變表型，為人類相應(yīng)的病理生理學(xué)過程的研究提供了有效的途徑。人類疾病模型人類疾病模型 癌癥癌癥 Cancer 造血紊亂造血紊亂 Hematopoietic disorders 心血管疾病心血管疾病 Cardiovascular disorders 腎功能紊亂腎功能紊亂 Kidney disorders 其他器官疾病其他器官疾病 Other organs疾病模型疾病模型1：癌癥：癌癥 疾病疾病 魚類的癌癥發(fā)生很常見，這一現(xiàn)象可能與水源中的致癌物有關(guān)。而魚類所有系統(tǒng)中均能發(fā)生各種良性和惡性腫瘤的特性，在組織學(xué)

16、特性上和人類腫瘤很相似。 人類基因組序列與即將完成的斑馬魚的基因序列的差異可用來證明細(xì)胞周期基因、腫瘤抑制基因及致癌基因的保守性。人類和斑馬魚膽管癌的組織學(xué)相似性人類和斑馬魚膽管癌的組織學(xué)相似性CANCER CELL : APRIL 2002人類和斑馬魚腺癌的組織學(xué)相似性人類和斑馬魚腺癌的組織學(xué)相似性NATURE REVIEWS Cancer 2003, 3:1-7斑馬魚體系復(fù)制癌癥模型的優(yōu)點(diǎn)斑馬魚體系復(fù)制癌癥模型的優(yōu)點(diǎn) 快速基因篩查可針對(duì)這些高度保守的癌癥通路 一旦發(fā)現(xiàn)癌癥有關(guān)變異，可通過增強(qiáng)/抑制性篩查確定相互影響的基因 斑馬魚系統(tǒng)易于進(jìn)行化學(xué)遺傳性篩查影響癌癥生物學(xué)研究的斑馬魚體系影響癌

17、癥生物學(xué)研究的斑馬魚體系的特性的特性 Forward Genetics: making a mutation and then find the gene; including ENU mutagenesis, insertional mutagenesis Reverse Genetics: including target lesion detection; transgenesis; lineage tracing with fluorescent proteins.疾病模型疾病模型2：腎功能紊亂：腎功能紊亂 斑馬魚腎臟發(fā)育和功能的許多方面與高級(jí)脊椎動(dòng)物類似，因此提供了簡(jiǎn)單易理解的研究體

18、系。已確定十八個(gè)隱性突變影響了斑馬魚原腎的發(fā)育，主要是腎小球和管囊的形成。 已證明幾種突變與人類常染色體顯性多囊腎疾病(ADPKD)有關(guān)。疾病模型疾病模型3: 貧血貧血Sir mutant erythrocytes have a defect in haemoglobin productionGrx5 is responsible for the sir phenotype斑馬魚模型的特殊應(yīng)用斑馬魚模型的特殊應(yīng)用Studies of Musculoskeletal and Skin Developmental Diseases Zebrafish and Cancer Research Eye

19、 Development and Disease Kidney Development and Disease Cardiovascular and Other Organogenesis in Zebrafish Research on Aging Child Health and Human Development Hematopoiesis Research on Ear Morphogenesis and Hearing Disorders Developmental Toxicology in Zebrafish Genome Research Neurogenesis and Ne

20、urological Disorders Early Developmental Programs in the Zebrafish Research on Allergies and Infectious Diseases Mutants that Affect Mental Behavior Craniofacial and Dental Research /science/models/zebrafish/reports/genomic-genetic.html小分子篩查小分子篩查 細(xì)胞株水平分析向整體水平分析轉(zhuǎn)化。 斑馬魚在藥物進(jìn)行正式臨床實(shí)驗(yàn)前可進(jìn)行

21、“高質(zhì)量”（疾病導(dǎo)向 disease-driven)藥物作用靶位的鑒定和藥物作用靶標(biāo)的活體內(nèi)定位。這些高通量研究可在機(jī)器人平臺(tái)進(jìn)行，其成本比使用小鼠研究低?；铙w藥物研究活體藥物研究小分子篩查小分子篩查活體藥物研究活體藥物研究小分子篩查小分子篩查 能夠選擇在完整模式動(dòng)物個(gè)體以及細(xì)胞中均具有生物活性的化合物，而這些細(xì)胞正經(jīng)歷正常的細(xì)胞與細(xì)胞間或細(xì)胞與matrix間的相互反應(yīng)。例如，胚胎學(xué)分析可用來篩選減少細(xì)胞增殖、促進(jìn)基因組穩(wěn)定、增加凋亡或避免血管形成的藥物。 檢查發(fā)育缺陷(一種稱為耳石的混合物可抑制內(nèi)耳結(jié)構(gòu)的形成，但不會(huì)引起其他缺陷；另一種混合物在有效中位劑量2 nM時(shí)可導(dǎo)致心肌缺陷)。本課題組

22、利用斑馬魚開展的工作本課題組利用斑馬魚開展的工作 研究方向研究方向 發(fā)育毒性：發(fā)育毒性：神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)發(fā)育和心血管發(fā)育心血管發(fā)育 第四部分Huang, L., Wang, C., Zhang, Y., Wu, M., and Zuo, Z. (2013) Phenanthrene causes ocular developmental toxicity in zebrafish embryos and the possible mechanisms involved. J. Hazard. Mater. 261C: 172-180. Wu, M., Zuo, Z., Li, B., Huang

23、, L., Chen, M., and Wang, C. (2013) Effects of low-level hexabromocyclododecane (HBCD) exposure on cardiac development in zebrafish embryos. Ecotoxicology Epub ahead of print. Zhang, Y., Huang, L., Wang, C., Gao, D., and Zuo, Z. (2013) Phenanthrene exposure produces cardiac defects during embryo dev

24、elopment of zebrafish (Danio rerio) through activation of MMP-9. Chemosphere. Epub ahead of print. Zhang, Y., Huang, L., Zuo, Z., Chen, Y., and Wang, C. (2013) Phenanthrene exposure causes cardiac arrhythmia in embryonic zebrafish via perturbing calcium handling. Aquat. Toxicol. 142-143C: 26-32. Epu

25、b ahead of print. Zhang, Y., Wang, C., Huang, L., Chen, R., Chen, Y., and Zuo, Z. (2012) Low-level pyrene exposure causes cardiac toxicity in zebrafish (Danio rerio) embryos. Aquat. Toxicol. 114-115C: 119-124. Huang, L., Wang, C., Zhang, Y., Li, J., Zhong, Y., Zhou, Y., Chen, Y., and Zuo, Z. (2011)

26、Benzoapyrene exposure influences the cardiac development and the expression of cardiovascular relative genes in zebrafish (Danio rerio) embryos. Chemosphere. 87(4): 369-375. 多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs) 主要來源于煤、石油、木材、煙草的不完全燃燒。 PAHs的發(fā)育毒性在最近才引起重視。 人類的出生缺陷比例在增加，這與多環(huán)芳烴污染不斷加劇有關(guān)？其他毒性其他毒性免疫毒性

27、免疫毒性發(fā)育毒性發(fā)育毒性PAHs致癌、致畸、致癌、致畸、致突變性致突變性急性毒性急性毒性光毒性光毒性研究背景和目的骨骼畸形骨骼畸形心臟發(fā)育和功能受損心臟發(fā)育和功能受損視覺器官發(fā)育抑制視覺器官發(fā)育抑制神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育延遲神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育延遲多環(huán)芳烴多環(huán)芳烴菲（菲（Phe）暴露對(duì)心臟形態(tài)形成的影響）暴露對(duì)心臟形態(tài)形成的影響 Phe 暴露暴露 72h 對(duì)斑馬魚胚胎心臟總畸形率的影響對(duì)斑馬魚胚胎心臟總畸形率的影響Control Phe PheVVAAVAPhe暴露對(duì)斑馬魚心臟形態(tài)的影響暴露對(duì)斑馬魚心臟形態(tài)的影響側(cè)面觀，側(cè)面觀，A： 心房，心房，V： 心室，心室，Bar = 50m菲（菲（Phe）暴露對(duì)心臟形態(tài)

28、形成的影響）暴露對(duì)心臟形態(tài)形成的影響 Phe對(duì)心室壁厚度的影響對(duì)心室壁厚度的影響原位雜交分析原位雜交分析 Vmhc、Myl7 基因在斑馬魚基因在斑馬魚胚胎心臟的分布胚胎心臟的分布小結(jié)小結(jié)環(huán)境濃度的環(huán)境濃度的Phe暴露能引發(fā)斑馬魚胚胎心臟發(fā)育畸形，其可能的作用機(jī)制為：暴露能引發(fā)斑馬魚胚胎心臟發(fā)育畸形，其可能的作用機(jī)制為：Phe暴暴露誘導(dǎo)露誘導(dǎo)MMP-9表達(dá)、增加表達(dá)、增加MMP-9活性，促進(jìn)心肌細(xì)胞間質(zhì)活性，促進(jìn)心肌細(xì)胞間質(zhì)ECM降解、導(dǎo)致腔室壁降解、導(dǎo)致腔室壁變??；變?。籔he暴露同時(shí)誘發(fā)暴露同時(shí)誘發(fā)TGF-1調(diào)節(jié)的膠原合成的增加，并最終導(dǎo)致心臟畸形。調(diào)節(jié)的膠原合成的增加，并最終導(dǎo)致心臟畸形。

29、Chemosphere， 2013 菲（菲（Phe）暴露對(duì)心臟功能的影響 Phe 暴露暴露 72h 導(dǎo)致斑馬魚胚胎心律不齊導(dǎo)致斑馬魚胚胎心律不齊Phe 暴露暴露72h 對(duì)斑馬魚胚胎心率的影響對(duì)斑馬魚胚胎心率的影響Phe暴露對(duì)大鼠心肌細(xì)胞鈣離子平衡的影響暴露對(duì)大鼠心肌細(xì)胞鈣離子平衡的影響 a 胞漿內(nèi)游離胞漿內(nèi)游離Ca2+的蓄積，的蓄積，b 肌漿網(wǎng)內(nèi)肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+的變化的變化 Phe暴露后，細(xì)胞胞漿中暴露后，細(xì)胞胞漿中Ca2+嚴(yán)重滯留，游離嚴(yán)重滯留，游離Ca2+濃濃度顯著性上升，肌漿網(wǎng)內(nèi)度顯著性上升，肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+明顯減少。提示：明顯減少。提示：Phe暴露后肌漿網(wǎng)暴露后肌漿網(wǎng)Ca2+攝取能力攝取能力受到明顯的影響受到明顯的影響心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)游離鈣濃度的變化心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)游離鈣濃度的變化小結(jié)小結(jié)環(huán)境濃度的環(huán)境濃度的Phe暴露同時(shí)也能導(dǎo)致心臟機(jī)能障礙。其可能分子機(jī)制為：暴露同時(shí)也能導(dǎo)致心臟機(jī)能障礙。其可能分子機(jī)制為：Phe暴露暴露通過直接或間接的方式抑制通過直接或間接的方式抑制Tbx5表達(dá)，從而導(dǎo)致其調(diào)控的表達(dá)，從而導(dǎo)致其調(diào)控的SERCA2a表達(dá)降低，表達(dá)降低，使得心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)對(duì)胞漿中使得心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)對(duì)胞漿中Ca