曲霉菌檢測(cè)技術(shù)要點(diǎn)及Troubleshooting

1、曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒技術(shù)要點(diǎn)技術(shù)要點(diǎn)郭芳岑產(chǎn)品經(jīng)理伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司2曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒基本技術(shù)介紹基本技術(shù)介紹3曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒包裝規(guī)格包裝規(guī)格：96T/Kit 試劑試劑盒組成盒組成：微孔板、 濃縮清洗液、 陰性對(duì)照血清、 cut-off質(zhì)控血清、 陽(yáng)性對(duì)照血清、 酶標(biāo)結(jié)合物、 樣本處理液、 TMB溶液、 終止液、 微板密封板、 說(shuō)明書(shū)等。 4曲霉菌試劑盒基本原理曲霉菌試劑盒基本原理 目的目的 采用酶聯(lián)免疫雙抗體夾心一步法（酶聯(lián)免疫雙抗體夾心一步法（ELISAELISA）半定量檢測(cè)人血清血清樣本中半乳甘露聚糖抗原

2、，用于對(duì)侵襲性曲霉菌感染高?；颊叩暮Y查診篩查診斷，動(dòng)態(tài)療效監(jiān)測(cè)及臨床用藥的評(píng)估斷，動(dòng)態(tài)療效監(jiān)測(cè)及臨床用藥的評(píng)估 原理 采用雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)血清樣本中的半乳甘露聚糖抗原。微板中包被半乳甘露聚糖抗體，可與樣本中半乳甘露聚糖抗原和試劑中酶標(biāo)抗體試劑結(jié)合形成抗體抗體- -抗原抗原- -酶標(biāo)抗體復(fù)合物酶標(biāo)抗體復(fù)合物，然后加入TMB底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)。通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度（OD值），經(jīng)公式計(jì)算得到I值（GM指數(shù)），根據(jù)GMI與cut-off值（0.5）的比較判斷有無(wú)曲霉菌的感染或感染的程度 5所需儀器或材料所需儀器或材料（1） 實(shí)驗(yàn)室臺(tái)式離心機(jī)：1.5mL聚丙烯試管，能獲得10,000g的離心加

3、速度（2） 加熱塊，或水浴設(shè)備（溫度為100 ）（3） 微孔板孵育器371 （4） 全自動(dòng)或半自動(dòng)微孔板洗板機(jī) （5） 備有450nm和620/630nm濾光片的酶標(biāo)儀6曲霉菌操作流程曲霉菌操作流程1.處理對(duì)照血清和患者樣本（血清/BAL）:300ul +100ul R72. 扣緊試管蓋，120加熱6分鐘（heater）3. 扣緊試管蓋，100加熱3分鐘（水?。?. 10,000g 離心10分鐘7曲霉菌操作流程曲霉菌操作流程4.準(zhǔn)備記錄表，以區(qū)分對(duì)照和患者得到樣本（不同微孔）5. 每孔加入50ul R6（酶結(jié)合物）6. 每孔加入50ul處理好的樣本上清（對(duì)照或患者）7. 用封板膜將96孔板封好

4、后，置于37孵育90分分鐘鐘8曲霉菌操作流程曲霉菌操作流程8.準(zhǔn)備洗液：將稀釋液R2按照1:20比例用去離子水稀釋 9. 用洗液抽吸抽吸洗滌5次10. 每孔快速快速加入200ul顯色劑TMB溶液（R9），注意避光注意避光11. 室溫（18-25）避光，孵育避光，孵育30分分鐘鐘（不封膜）9曲霉菌操作流程曲霉菌操作流程12.每孔加入100ul終止液（R10），小心擦拭96孔板底部13. 在450/620nm波長(zhǎng)下讀取OD值。加入終止液后需在30分分鐘鐘內(nèi)內(nèi)完成讀數(shù)14. 樣本中GM抗原的結(jié)果通過(guò)計(jì)算GMI（GM指數(shù)）確定：GMI=樣樣本本ODCut-off對(duì)對(duì)照均照均值值（ （R4 OD） ）G

5、MI0.5 陽(yáng)性陽(yáng)性10樣本記錄表樣本記錄表Step 4Step 4 準(zhǔn)備一份可以識(shí)別微孔板上受檢血清和對(duì)照血清的圖表。用其中一孔作為陰性對(duì)照血清使用（R3），兩孔作為Cut-off對(duì)照血清（R4），一孔用于陽(yáng)性對(duì)照血清（R5）。 R31.511臨床臨床GMGM檢測(cè)流程檢測(cè)流程12曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒操作注意事項(xiàng)及技術(shù)要點(diǎn)操作注意事項(xiàng)及技術(shù)要點(diǎn)13實(shí)驗(yàn)室工作流程實(shí)驗(yàn)室工作流程患者準(zhǔn)備樣本采集樣本保存、運(yùn)輸樣本檢測(cè)報(bào)告簽發(fā)報(bào)告應(yīng)用14如何保證檢測(cè)質(zhì)量？如何保證檢測(cè)質(zhì)量？人機(jī)料法環(huán)15曲霉菌的特點(diǎn)曲霉菌的特點(diǎn) 霉菌的分布 占空氣中真菌的12%來(lái)源于百度百科 空氣中真菌前三甲：

6、Cladosporium：37% Non-sporing：22.5% Yeast：18.3% 灰塵中真菌前三甲：Yeast：50.6%Cladosporium：17%Aspergillus:12%Aspergillus:12%來(lái)源于現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生2007年第23卷第9期1409 最適宜生長(zhǎng)溫度25-3016曲霉菌的檢測(cè)首要重視環(huán)境問(wèn)題曲霉菌的檢測(cè)首要重視環(huán)境問(wèn)題以下工作應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)完成： 試劑盒和耗材拆包裝及密封 樣本取樣并加處理液17實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 打開(kāi)超凈臺(tái) 75%酒精擦拭潔凈臺(tái)桌面及內(nèi)壁 紫外燈消毒15分鐘以上，操作前關(guān)閉紫外燈 記號(hào)筆（防水） 離心管架 加樣槽18實(shí)驗(yàn)操作步驟及注意

7、要點(diǎn)實(shí)驗(yàn)操作步驟及注意要點(diǎn)在使用前，將試劑從冰箱冷藏室取出平衡平衡3030分鐘至室溫分鐘至室溫后方可使用 19樣本處理樣本處理 超凈臺(tái)內(nèi)操作 潔凈的耗材 加樣槍的正確操作20做好標(biāo)記，防止結(jié)果無(wú)法對(duì)應(yīng)做好標(biāo)記，防止結(jié)果無(wú)法對(duì)應(yīng)21耗材的潔凈要求耗材的潔凈要求 無(wú)熱原 消毒無(wú)熱原 無(wú)塵 超凈臺(tái)內(nèi)開(kāi)包裝 超凈臺(tái)內(nèi)密封后移出22正確使用加樣槍正確使用加樣槍 定期校準(zhǔn) 垂直操作 槍頭要卡緊 慢吸快打 吸一檔打二檔或吸一檔加樣后反復(fù)吹打 不建議吸二檔打一檔 槍頭不要再次使用23加熱加熱 注意孵育時(shí)間和溫度 猜我喜歡哪個(gè)？24Heat BlockHeat Block的一點(diǎn)小問(wèn)題的一點(diǎn)小問(wèn)題25對(duì)小離心管的

8、要求對(duì)小離心管的要求 不要太緊 不要太松 無(wú)塵無(wú)熱原26離心離心 離心時(shí)“配平”是基本常識(shí) 注意轉(zhuǎn)速和時(shí)間 注意換算 公式：G=1.1110-5Rrpm2 G：離心力 R：離心半徑（單位：厘米） rpm：轉(zhuǎn)速 例： 如離心機(jī)為10cm離心半徑，則Rpm應(yīng)為9492 如離心機(jī)為15cm離心半徑，則Rpm應(yīng)為632827樣本布局樣本布局 注意加樣位置 理解ELISA實(shí)驗(yàn)的“邊緣效應(yīng)”28加酶結(jié)合物加酶結(jié)合物 排槍不如你想象那么好用 使用前做好檢查 使用要點(diǎn)同單槍 排槍使用需要加樣槽 加樣槽要潔凈，每次用后要及時(shí)清洗。29加樣加樣 注意節(jié)奏 你會(huì)質(zhì)疑自己是不是“老花眼”30孵育孵育 孵育時(shí)要蓋密封條

9、 震蕩混勻要小心 拆掉密封條要小心31配制洗液配制洗液 注意配制比例 純水要使用新鮮制取 不要舍不得用R2 要沖洗管路 管路會(huì)有殘留 瓶子會(huì)有掛壁32洗板洗板 不要過(guò)于相信機(jī)器 管路是否潔凈 加樣是否都加滿(mǎn) 吸樣是否都吸盡 我的習(xí)慣 最后一次吸樣結(jié)束后拍一拍 不要挑戰(zhàn)“拍力”的極限33加顯色劑加顯色劑 注意這個(gè)詞：Rapidly 回顧一下： 排槍使用加樣槽 注意：絕對(duì)不要同加酶結(jié)合物的加樣槽混用。 如果實(shí)在要用，要確保酶結(jié)合物不會(huì)混進(jìn)TMB溶液中。34顯色孵育顯色孵育 不覆蓋封板膜 溫度要求：室溫 最重要的一點(diǎn)： 避光35終止終止 注意按照TMB的加樣順序 盡量保持同TMB加樣的節(jié)奏36讀數(shù)讀

10、數(shù) 注意在終止后3030分鐘內(nèi)分鐘內(nèi)讀數(shù) 雙波長(zhǎng)（ 450/620nm ）讀數(shù) 讀數(shù)前用吸水紙擦干酶聯(lián)板底部 如果對(duì)讀數(shù)有疑問(wèn)，可以用白紙鋪底看小孔內(nèi)的顏色 讀數(shù)值越高，則顏色越黃 如果孔內(nèi)為藍(lán)色，需要補(bǔ)加終止液 隱約可見(jiàn)藍(lán)色，可能是終止液加入未混勻。37結(jié)果結(jié)果 準(zhǔn)確的結(jié)果：準(zhǔn)確的結(jié)果：優(yōu)質(zhì)的試劑正確的操作良好的儀器38曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒Trouble shootingTrouble shooting39問(wèn)題問(wèn)題可能的原因可能的原因解決方案解決方案對(duì)照血清值太高對(duì)照血清被污染 確保 R3, R4 和 R5對(duì)照血清沒(méi)有混淆 避免環(huán)境中曲霉菌的污染，在潔凈環(huán)境中使用對(duì)照血清

11、 確保沒(méi)有重復(fù)使用槍頭前期處理不當(dāng) 確保前期處理是使用300ul對(duì)照血清和100ul的處理液（R7）進(jìn)行的 試劑用量錯(cuò)誤 加樣槍是否是否調(diào)到正確的刻度（是否定期維護(hù)） 用正確的試劑量重新檢測(cè)曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒- -Troubleshooting Guide40問(wèn)題問(wèn)題可能的原因可能的原因解決方案解決方案對(duì)照血清值太高加入了過(guò)量的處理后的對(duì)照上清 確保加入了50 l 處理后的對(duì)照上清處理后的樣本上清加入過(guò)早，在酶結(jié)合物之前加入（R6之前） 每孔先加入50 l 酶結(jié)合物(R6) ，再加入對(duì)照上清第一次孵育時(shí)沒(méi)有密封好 緊壓微孔板密封膜以確保密封好孵育溫度不對(duì) 確保樣本與R6的

12、孵育溫度為37 +/- 1C:加熱塊的選擇確保沒(méi)有超過(guò)最大容納量確保溫度沒(méi)有反復(fù)波動(dòng)加熱塊的維護(hù)是否定期曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒- -Troubleshooting Guide41問(wèn)題問(wèn)題可能的原因可能的原因解決方案解決方案對(duì)照血清值太高孵育溫度不對(duì) 確保顯示底物的孵育溫度為 18-25C:- 當(dāng)時(shí)的室溫是多少？- 是否開(kāi)了空調(diào)？最后孵育步驟操作不當(dāng) 不封膜 避光 18-25 C 孵育過(guò)度 確保孵育溫度和時(shí)間嚴(yán)格依照說(shuō)明書(shū)洗滌不夠 手工還是自動(dòng)洗板？ 洗板機(jī)是否正常維護(hù)？運(yùn)行是否正常？ 確保洗滌后將微孔板徹底吸干 避免洗板過(guò)程中的污染曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒-

13、-Troubleshooting Guide42問(wèn)題問(wèn)題可能的原因可能的原因解決方案解決方案對(duì)照血清值太高洗滌不夠洗滌了幾次洗液用量是多少？洗板機(jī)是否洗的徹底？沒(méi)用去離子水稀釋洗液 確保使用去離子水稀釋洗液 如果用洗板機(jī)，確保正確注入洗液洗液稀釋比例不對(duì) 按照說(shuō)明書(shū)要求比例進(jìn)行稀釋顯色液 TMB被污染或染色 棄掉污染的R9并使用新的 不要把剩余的顯色液重新倒回試劑瓶曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒- -Troubleshooting Guide43問(wèn)題問(wèn)題可能的原因可能的原因解決方案解決方案對(duì)照血清值太高終止液被污染 丟棄污染的終止液并更換新的 不要把剩余的終止液倒回試劑瓶 避免終止液

14、接觸金屬物品讀板：酶標(biāo)儀使用不當(dāng) 使用的酶標(biāo)儀程序是否正確設(shè)置 選擇450 nm 濾光器和 620 或630 nm 參考濾光器 加入終止液后30分鐘內(nèi)讀完.試劑存儲(chǔ)溫度或使用溫度不當(dāng) 所有試劑從冷藏室置于室溫(18-25C) 30 分鐘后方可使用 存儲(chǔ)試劑在2 - 8C. 試劑使用前需完全混勻曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒- -Troubleshooting Guide44問(wèn)題問(wèn)題可能的原因可能的原因解決方案解決方案陽(yáng)性對(duì)照值偏低試劑過(guò)期或儲(chǔ)存不當(dāng) 使用效期內(nèi)的產(chǎn)品 . 微孔板開(kāi)封后可保存8周，需用干燥劑且密封儲(chǔ)存 工作洗液可在2 - 30C保存14天使用前未放置室溫平衡 所有試劑從

15、冷藏室置于室溫(18-25C) 30 分鐘后方可使用 試劑使用前需完全混勻陽(yáng)性血清加入量錯(cuò)誤，或者未加入 確保吸入正確的血清以及劑量 加樣搶是否校準(zhǔn) 確保將陽(yáng)性血清加入正確的微孔血清前處理不當(dāng) 確保血清處理步驟和溫度嚴(yán)格遵守說(shuō)明書(shū)曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒- -Troubleshooting Guide45問(wèn)題問(wèn)題可能的原因可能的原因解決方案解決方案陽(yáng)性對(duì)照值偏低孵育溫度不對(duì) 確保與酶結(jié)合物的孵育是在37 1C. 確保與顯色劑的孵育溫度為18-25C. 確保加熱塊溫度沒(méi)有過(guò)高 確保加熱塊溫度沒(méi)有反復(fù)波動(dòng)洗液過(guò)度稀釋或使用不當(dāng) 1份濃縮洗液與19份去離子水或蒸餾水配比 確保洗板機(jī)預(yù)

16、先裝入了洗液重復(fù)使用試劑槽或試劑槽被污染 保證試劑槽是一次性使用 未使用的剩余試劑不能倒回試劑瓶中用聚苯乙烯容器裝顯色液TMB 使用聚丙烯容器裝顯色液TMB曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒- -Troubleshooting Guide46問(wèn)題問(wèn)題可能的原因可能的原因解決方案解決方案陽(yáng)性對(duì)照值偏低顯色液TMB污染 丟棄污染的顯色液并更換新的 確保使用正確劑量 顯色孵育不夠或不當(dāng) 避光孵育30 5 分鐘 不要使用密封膜 終止液加入不當(dāng)或讀數(shù)不當(dāng) 加入終止液后30分鐘內(nèi)讀數(shù) 使用450nm和620/630 nm 參照濾光器. 在加入前確保終止液完全混勻曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒曲霉菌抗原檢測(cè)試劑

17、盒- -Troubleshooting Guide47問(wèn)題問(wèn)題可能的原因可能的原因解決方案解決方案OD 值低于0.000酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)置錯(cuò)誤 設(shè)置酶標(biāo)儀波長(zhǎng)在 450 nm 和620 to 630 nm 參比濾光器酶標(biāo)儀參數(shù)設(shè)置錯(cuò)誤 確保酶標(biāo)儀參數(shù)設(shè)置正確 濾光器臟污或松動(dòng) 檢查、清潔或更換濾光器未加入樣本或試劑 確保正確加入了樣本或試劑終止液加入或混勻不當(dāng) 加入終止液后輕怕微孔板，確保與反應(yīng)體系混勻 檢查加樣搶的重復(fù)性，必要時(shí)校準(zhǔn) 曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒- -Troubleshooting Guide48問(wèn)題問(wèn)題可能的原因可能的原因解決方案解決方案第二次孵育后沒(méi)有顏色未加入處

18、理后的樣本或?qū)φ丈锨?確保加入未加入酶結(jié)合物 確保加入未加入顯色劑TMB溶液 確保加入工作液(R2) 配制不當(dāng) 依照說(shuō)明書(shū)正確配制曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒- -Troubleshooting Guide49問(wèn)題問(wèn)題可能的原因可能的原因解決方案解決方案陽(yáng)性樣本不能重復(fù)重復(fù)檢測(cè)時(shí)所選樣本錯(cuò)誤（不是該陽(yáng)性樣本） 確保樣本選擇正確初次檢測(cè)可能受陽(yáng)性樣本污染 小心處理陽(yáng)性樣本避免污染檢測(cè)樣本樣本之間出現(xiàn)交叉污染 確保微孔中的內(nèi)容物沒(méi)有飛濺 確保密封膜沒(méi)被使用過(guò) 小心揭開(kāi)密封膜避免微孔中內(nèi)容物濺出 洗板時(shí)確保微孔中內(nèi)容物無(wú)溢出曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒- -Troubleshooting Guide50問(wèn)題問(wèn)題可能的原因可能的原因解決方案解決方案陽(yáng)性樣本不能重復(fù)加樣槍或槍頭污染 清潔加樣槍 保證槍頭一次性使用 避免加樣搶被陽(yáng)性樣本污染 殘留結(jié)合物或樣本