實(shí)用-第6次課

1、七切片七切片v 超薄切片是將固化的包埋塊在超薄切片機(jī)上切為薄超薄切片是將固化的包埋塊在超薄切片機(jī)上切為薄 片的過程片的過程( (厚度約為厚度約為5Onm)5Onm)，它是整個(gè)制樣程序的，它是整個(gè)制樣程序的 中心環(huán)節(jié)。中心環(huán)節(jié)。v 超薄切片的好壞與切片機(jī)的性能、切片刀的質(zhì)量、超薄切片的好壞與切片機(jī)的性能、切片刀的質(zhì)量、 包埋塊的切割性能以及操作者的技術(shù)經(jīng)驗(yàn)等因素包埋塊的切割性能以及操作者的技術(shù)經(jīng)驗(yàn)等因素 密切相關(guān)。密切相關(guān)。v 當(dāng)進(jìn)行超薄切片前，必須做好一切準(zhǔn)備工作，如選當(dāng)進(jìn)行超薄切片前，必須做好一切準(zhǔn)備工作，如選 擇和清洗載網(wǎng)、制備支持膜、制備玻璃刀、修整擇和清洗載網(wǎng)、制備支持膜、制備玻璃刀、

2、修整 包埋塊等，開始切片時(shí)必須心境平穩(wěn)，精力集中，包埋塊等，開始切片時(shí)必須心境平穩(wěn)，精力集中， 避免任何干擾（如隨意離位、各種震動(dòng)、人員往避免任何干擾（如隨意離位、各種震動(dòng)、人員往 來、塵粒污染等）。來、塵粒污染等）。v 超薄切片的操作過程與石蠟切片基本相似，但承載超薄切片的操作過程與石蠟切片基本相似，但承載 切片的不是載玻片，而是具有透明支持膜的圓形銅切片的不是載玻片，而是具有透明支持膜的圓形銅 網(wǎng)，特殊切片還需用鎳網(wǎng)、不銹鋼網(wǎng)或銀絲網(wǎng)。網(wǎng)，特殊切片還需用鎳網(wǎng)、不銹鋼網(wǎng)或銀絲網(wǎng)。v 銅網(wǎng)大都以電解法制成，直徑銅網(wǎng)大都以電解法制成，直徑3mm(3mm(少數(shù)為少數(shù)為2mm)2mm)，網(wǎng)，網(wǎng) 孔的

3、形狀有園形、方形、單孔形、狹縫形等，網(wǎng)孔孔的形狀有園形、方形、單孔形、狹縫形等，網(wǎng)孔 的數(shù)目有的數(shù)目有5050400400目多種規(guī)格。目多種規(guī)格。v 超薄切片時(shí)一般選用超薄切片時(shí)一般選用200200目銅網(wǎng)，網(wǎng)孔大者觀察的目銅網(wǎng)，網(wǎng)孔大者觀察的 有效面積亦大，但其對切片的支持穩(wěn)定性能較差。有效面積亦大，但其對切片的支持穩(wěn)定性能較差。 因此如果觀察分辨力要求高的樣品時(shí)，則選用因此如果觀察分辨力要求高的樣品時(shí)，則選用200200 目以上的銅網(wǎng)，以增強(qiáng)樣品的穩(wěn)定性能。目以上的銅網(wǎng)，以增強(qiáng)樣品的穩(wěn)定性能。1 1、選擇與清洗載網(wǎng)、選擇與清洗載網(wǎng)v 新銅網(wǎng)新銅網(wǎng) 可先用丙酮清洗數(shù)遍，而后再以無水乙醇清可先用

4、丙酮清洗數(shù)遍，而后再以無水乙醇清 洗幾次，待干燥后使用。清洗的目的是去除銅網(wǎng)洗幾次，待干燥后使用。清洗的目的是去除銅網(wǎng) 上的油污，以便支持膜與銅網(wǎng)得以牢固的貼附。上的油污，以便支持膜與銅網(wǎng)得以牢固的貼附。v 舊銅網(wǎng)舊銅網(wǎng) 凡使用過的銅網(wǎng)，均可經(jīng)下法清洗以后，重凡使用過的銅網(wǎng)，均可經(jīng)下法清洗以后，重 復(fù)使用復(fù)使用: :q 酸洗法酸洗法 放入盛有濃硫酸的小燒杯或錐形瓶內(nèi)輕輕搖放入盛有濃硫酸的小燒杯或錐形瓶內(nèi)輕輕搖 動(dòng)，約經(jīng)動(dòng)，約經(jīng)1 13 3分鐘后即可清洗干凈。倒出硫酸，水分鐘后即可清洗干凈。倒出硫酸，水 洗數(shù)次后，再用氨水清洗一次，用蒸餾水反復(fù)洗洗數(shù)次后，再用氨水清洗一次，用蒸餾水反復(fù)洗 滌數(shù)次

5、。最后在無水乙醇或丙酮內(nèi)清洗兩遍，取滌數(shù)次。最后在無水乙醇或丙酮內(nèi)清洗兩遍，取 出平鋪于濾紙上自然涼干待用。出平鋪于濾紙上自然涼干待用。 銅網(wǎng)的洗滌處理因新舊而有不同銅網(wǎng)的洗滌處理因新舊而有不同q 超聲清洗法超聲清洗法 先將舊銅網(wǎng)放入小燒杯內(nèi)，以醋酸異戊酯或二先將舊銅網(wǎng)放入小燒杯內(nèi)，以醋酸異戊酯或二 氯乙烷溶去火棉膠膜和氯乙烷溶去火棉膠膜和FormvarFormvar膜，浸泡時(shí)間約半小膜，浸泡時(shí)間約半小 時(shí)。然后再放入盛有時(shí)。然后再放入盛有9595乙醇或丙酮的小燒杯內(nèi)，乙醇或丙酮的小燒杯內(nèi)， 將超聲波探頭插入其內(nèi)超聲清洗。時(shí)間約將超聲波探頭插入其內(nèi)超聲清洗。時(shí)間約5 51010分鐘，分鐘， 超

6、聲波頻率超聲波頻率8Hz8Hz。2.2.制備支持膜制備支持膜v 銅網(wǎng)的網(wǎng)孔是很小的，但對于放置超薄切片及其它銅網(wǎng)的網(wǎng)孔是很小的，但對于放置超薄切片及其它 樣品來說，網(wǎng)孔還嫌大。又不足以平坦地支持切片。樣品來說，網(wǎng)孔還嫌大。又不足以平坦地支持切片。 所以要在銅網(wǎng)上復(fù)一層透明的薄膜，這層薄膜叫做所以要在銅網(wǎng)上復(fù)一層透明的薄膜，這層薄膜叫做 支持膜。支持膜。v 要求要求q 支持膜在電子顯微鏡下不顯示本身結(jié)構(gòu)；支持膜在電子顯微鏡下不顯示本身結(jié)構(gòu)；q 耐高溫，能經(jīng)受電子束的轟擊，有一定的機(jī)械強(qiáng)度耐高溫，能經(jīng)受電子束的轟擊，有一定的機(jī)械強(qiáng)度q 膜要薄，一般為膜要薄，一般為1001002OOA2OOA，不得

7、超過，不得超過2OOA2OOA。v 類型類型q FormvarFormvar膜膜q 火棉膠膜火棉膠膜q 碳膜碳膜v 該膜的化學(xué)成分為聚乙烯醇縮甲醛該膜的化學(xué)成分為聚乙烯醇縮甲醛(PVF)(PVF)。v 首先制備首先制備0.3%0.3%的的FormvarFormvar二氯乙烯溶液二氯乙烯溶液( (亦可用二氯亦可用二氯乙乙 烷或氯仿烷或氯仿) )，然后用洗凈的玻璃片伸入到該溶液中停，然后用洗凈的玻璃片伸入到該溶液中停 留片刻，平穩(wěn)取出，自然干燥后玻片上形成一層薄留片刻，平穩(wěn)取出，自然干燥后玻片上形成一層薄 膜，再用針或刀片沿玻片邊緣將此膜劃破，繼將該膜，再用針或刀片沿玻片邊緣將此膜劃破，繼將該 玻

8、片的一端浸入玻璃平皿的蒸餾水中，待玻片上的玻片的一端浸入玻璃平皿的蒸餾水中，待玻片上的 薄膜完全漂于水面，把玻片輕輕下壓取出。薄膜完全漂于水面，把玻片輕輕下壓取出。v 再將銅網(wǎng)排列在膜上，用濾紙與銅網(wǎng)完全貼附后，用再將銅網(wǎng)排列在膜上，用濾紙與銅網(wǎng)完全貼附后，用 鑷子夾住濾紙的一角輕輕將其取出放于培養(yǎng)皿中，鑷子夾住濾紙的一角輕輕將其取出放于培養(yǎng)皿中， 待自然干燥后使用。待自然干燥后使用。FormvarFormvar膜膜Formvar膜的制備方法q 制膜時(shí)玻璃片一定要光潔干凈，否則制膜時(shí)玻璃片一定要光潔干凈，否則FormvarFormvar膜不膜不 能從玻片上脫落飄起；能從玻片上脫落飄起；q 制膜

9、時(shí)室內(nèi)濕度不能太大制膜時(shí)室內(nèi)濕度不能太大(60%)(60%)，否則易在膜上出，否則易在膜上出 現(xiàn)微孔現(xiàn)微孔; ;q 溶劑中不能混有水分與雜質(zhì)，操作時(shí)應(yīng)注意防止，溶劑中不能混有水分與雜質(zhì)，操作時(shí)應(yīng)注意防止， 否則膜上會(huì)有許多斑點(diǎn)。否則膜上會(huì)有許多斑點(diǎn)。FormvarFormvar膜具有良好的透明度與機(jī)械強(qiáng)度，不易被膜具有良好的透明度與機(jī)械強(qiáng)度，不易被電子束擊破，因此為當(dāng)前電鏡制樣最普遍采用的支持膜。電子束擊破，因此為當(dāng)前電鏡制樣最普遍采用的支持膜。注意注意v 常用常用1 13%3%火棉膠醋酸異戊酯溶液。火棉膠醋酸異戊酯溶液。v 取市售的取市售的6%6%火棉膠溶液火棉膠溶液( (系用酒精、乙醚配制

10、系用酒精、乙醚配制) )，加入，加入 等量的醋酸異戊酯，即成等量的醋酸異戊酯，即成3%3%溶液。溶液。v 制膜時(shí)先取直徑制膜時(shí)先取直徑9 912cm12cm的培養(yǎng)皿，盛滿雙重蒸餾水，的培養(yǎng)皿，盛滿雙重蒸餾水， 在水面上輕輕滴在水面上輕輕滴1 12 2滴上述溶液，醋酸異戊酯很快揮滴上述溶液，醋酸異戊酯很快揮 發(fā)后，即可在水面上形成一層均勻的火棉膠薄膜。發(fā)后，即可在水面上形成一層均勻的火棉膠薄膜。v 此時(shí)將洗凈的銅網(wǎng)排列在膜上，然后在銅網(wǎng)上放上一此時(shí)將洗凈的銅網(wǎng)排列在膜上，然后在銅網(wǎng)上放上一 張濾紙，待濾紙浸濕后輕輕提起，將貼有銅網(wǎng)的濾紙張濾紙，待濾紙浸濕后輕輕提起，將貼有銅網(wǎng)的濾紙 取出水面，放

11、于培養(yǎng)皿申，在取出水面，放于培養(yǎng)皿申，在50500 0溫箱中烘干待溫箱中烘干待 用。用?；鹈弈z膜火棉膠膜v 碳膜的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)穩(wěn)定性能均優(yōu)于其它支持膜，碳膜的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)穩(wěn)定性能均優(yōu)于其它支持膜， 因此多用來觀察高分辨樣品。因此多用來觀察高分辨樣品。v 制作方法如下制作方法如下q 取此直徑為取此直徑為3 3或或5mm5mm的兩根碳棒，一根作固定極，將頂?shù)膬筛及?，一根作固定極，將頂 端磨平，另一極作推進(jìn)極，將一端磨成細(xì)尖。端磨平，另一極作推進(jìn)極，將一端磨成細(xì)尖。q 取上述磨制好的碳棒裝在真空噴鍍儀的電極柱上，使取上述磨制好的碳棒裝在真空噴鍍儀的電極柱上，使 推進(jìn)極的尖端與固定極的平端相接觸

12、，并調(diào)整碳極噴推進(jìn)極的尖端與固定極的平端相接觸，并調(diào)整碳極噴 發(fā)點(diǎn)至樣品的距離發(fā)點(diǎn)至樣品的距離121214cm14cm。q 將已帶有火棉膠膜或?qū)⒁褞в谢鹈弈z膜或FormvarFormvar膜的銅網(wǎng)數(shù)個(gè)，放在噴膜的銅網(wǎng)數(shù)個(gè)，放在噴 發(fā)點(diǎn)的下方，蓋好真空罩，抽真空至發(fā)點(diǎn)的下方，蓋好真空罩，抽真空至lXlX0 0- -托，連托，連 接電源使碳極通電，加大電流至接電源使碳極通電，加大電流至202030A30A，使兩碳棒，使兩碳棒 接觸點(diǎn)產(chǎn)生弧光放電，碳棒噴發(fā)出極細(xì)的顆粒，約接觸點(diǎn)產(chǎn)生弧光放電，碳棒噴發(fā)出極細(xì)的顆粒，約 噴發(fā)噴發(fā)5 5秒鐘左右即可獲得足夠厚度的碳加強(qiáng)膜，其厚秒鐘左右即可獲得足夠厚度的碳加

13、強(qiáng)膜，其厚 度要求為度要求為0nm0nm左右。左右。 碳膜碳膜 3 3、包埋塊的修整、包埋塊的修整制作好的包埋塊，應(yīng)將其尖端修成適當(dāng)?shù)男螤詈痛笮?，制作好的包埋塊，應(yīng)將其尖端修成適當(dāng)?shù)男螤詈痛笮?，除去組織周圍多余的包埋介質(zhì)，使包埋于其中的組織除去組織周圍多余的包埋介質(zhì)，使包埋于其中的組織露于包埋塊的尖端，才能用于切片。包埋塊的頂端表露于包埋塊的尖端，才能用于切片。包埋塊的頂端表面形狀，一般修成梯形、長方形或正方形、面積約為面形狀，一般修成梯形、長方形或正方形、面積約為1mm1mm2 2。包埋塊頂端的四周則修成錐體狀。包埋塊頂端的四周則修成錐體狀。v 修整時(shí)先將包埋塊夾在專用的夾持器中，先用單面修

14、整時(shí)先將包埋塊夾在專用的夾持器中，先用單面 刀片傾斜刀片傾斜45450 0向外粗修出四個(gè)斜面，使包埋塊頂端向外粗修出四個(gè)斜面，使包埋塊頂端 呈錐體狀呈錐體狀; ;v 然后在立體顯微鏡下進(jìn)行細(xì)修，此時(shí)用雙面刀片將然后在立體顯微鏡下進(jìn)行細(xì)修，此時(shí)用雙面刀片將 包埋塊頂端修平，使其露出組織包埋塊頂端修平，使其露出組織( (注意不要修及組注意不要修及組 織織) )。v 修好的包埋塊，其游離面最好為梯形，因?yàn)樘菪渭刃藓玫陌駢K，其游離面最好為梯形，因?yàn)樘菪渭?有利于切片脫離刀鋒，避免切片粘附，同時(shí)也可有利于切片脫離刀鋒，避免切片粘附，同時(shí)也可 連續(xù)成帶，有利于判斷前后順序。連續(xù)成帶，有利于判斷前后順序。

15、修塊過程修塊過程4 4、切片刀的制備、切片刀的制備v 切片刀的制備與選擇是超薄切片成敗的關(guān)鍵之一。切片刀的制備與選擇是超薄切片成敗的關(guān)鍵之一。v 超薄切片時(shí)，大都選用玻璃刀，在切比較堅(jiān)硬的樣超薄切片時(shí)，大都選用玻璃刀，在切比較堅(jiān)硬的樣 品或想獲得較大切片時(shí)可選用鉆石刀。品或想獲得較大切片時(shí)可選用鉆石刀。v 玻璃刀制作簡便，價(jià)格低廉，但刀刃脆不耐用，而玻璃刀制作簡便，價(jià)格低廉，但刀刃脆不耐用，而 且不能切割硬質(zhì)材料。且不能切割硬質(zhì)材料。v 鉆石刀質(zhì)地堅(jiān)硬，經(jīng)久耐用，但價(jià)格昂貴。鉆石刀質(zhì)地堅(jiān)硬，經(jīng)久耐用，但價(jià)格昂貴。v 制作玻璃刀所用的玻璃，必須為不含雜質(zhì)的硬質(zhì)玻制作玻璃刀所用的玻璃，必須為不含雜

16、質(zhì)的硬質(zhì)玻 璃，其厚度要求為璃，其厚度要求為5 56mm6mm。v 手工制刀法手工制刀法 q 先將玻璃用鉆石刀裁成先將玻璃用鉆石刀裁成3Omm3Omm寬的玻璃條，然后將玻寬的玻璃條，然后將玻 璃條按璃條按30mm30mm間距劃線，間距劃線，q 將玻璃條的劃線對準(zhǔn)桌子邊緣，用手按住玻璃條，將玻璃條的劃線對準(zhǔn)桌子邊緣，用手按住玻璃條， 另一手用平口鉗夾住玻璃并用力下掰，玻璃條即可另一手用平口鉗夾住玻璃并用力下掰，玻璃條即可 斷成方塊斷成方塊; ;q 然后在方塊玻璃表面沿略偏離對角線的方向呈然后在方塊玻璃表面沿略偏離對角線的方向呈4545角角 劃線，用兩把平口鉗在劃線兩側(cè)夾住玻璃，兩手用劃線，用兩把

17、平口鉗在劃線兩側(cè)夾住玻璃，兩手用 力猛掰，即可斷為兩把三角形的玻璃刀。力猛掰，即可斷為兩把三角形的玻璃刀。玻璃刀玻璃刀v 機(jī)械制刀法機(jī)械制刀法 q 機(jī)械制刀大都選用瑞典機(jī)械制刀大都選用瑞典LKB7800LKB7800型制刀機(jī)，其主要型制刀機(jī)，其主要 部件包括部件包括: :玻璃劃割器、玻璃劃割器、夾持器夾持器( (壓緊玻璃用壓緊玻璃用) )、斷裂旋鈕斷裂旋鈕( (產(chǎn)生向上的頂力、與夾持器的壓力相反，產(chǎn)生向上的頂力、與夾持器的壓力相反， 使玻璃斷開使玻璃斷開) )、導(dǎo)板導(dǎo)板( (選用刀尖角的角度選用刀尖角的角度) )、調(diào)節(jié)盤調(diào)節(jié)盤( (調(diào)節(jié)劃割線偏離對角線的程度調(diào)節(jié)劃割線偏離對角線的程度) )。q

18、 7800 7800型制刀機(jī)可制作型制刀機(jī)可制作25mm25mm和和38mm38mm寬的玻璃刀。寬的玻璃刀。q 刀尖角的角度可任意調(diào)節(jié)，一般選用刀尖角的角度可任意調(diào)節(jié)，一般選用4545刀。刀。q 制刀時(shí)先將玻璃條裁割為方形或菱形，再沿著略偏制刀時(shí)先將玻璃條裁割為方形或菱形，再沿著略偏 離對角線的方向劃割，制成兩把三角形的玻璃刀。離對角線的方向劃割，制成兩把三角形的玻璃刀。q 制好玻璃刀后，圍繞刀口制作一水槽，以便切片漂制好玻璃刀后，圍繞刀口制作一水槽，以便切片漂 在水面上。在水面上。 水槽分金屬水槽分金屬( (或工程塑料或工程塑料) )和膠布水槽兩種，前和膠布水槽兩種，前 者可反復(fù)使用，后者是

19、用長約者可反復(fù)使用，后者是用長約4cm4cm、寬約、寬約0.6cm0.6cm膠布膠布 條貼在刀口上制成。制好膠布水槽后，再用熔化的條貼在刀口上制成。制好膠布水槽后，再用熔化的 熟石蠟封好接口，以防漏水。熟石蠟封好接口，以防漏水。鉆石刀又稱金剛刀，它具有以下優(yōu)點(diǎn)：鉆石刀又稱金剛刀，它具有以下優(yōu)點(diǎn)：v 其刀口在室溫下不存在氧化和分子重新排列問題，可其刀口在室溫下不存在氧化和分子重新排列問題，可 反復(fù)使用，節(jié)約了制取玻璃刀的大量時(shí)間；反復(fù)使用，節(jié)約了制取玻璃刀的大量時(shí)間；v 可切割各種軟硬度的樣品，尤其適用千特別硒的材料；可切割各種軟硬度的樣品，尤其適用千特別硒的材料；v 刀口范圍大，可切割出較大的

20、切片；刀口范圍大，可切割出較大的切片；v 刀鋒不易損傷，故可用于連續(xù)切片；刀鋒不易損傷，故可用于連續(xù)切片；v 刀鋒銳利，一般無刻痕，可得到刀鋒銳利，一般無刻痕，可得到101020nm20nm平整滿意的平整滿意的 切片。切片。鉆石刀鉆石刀由于鉆石刀價(jià)格昂貴，且易碰撞受損，所以使用由于鉆石刀價(jià)格昂貴，且易碰撞受損，所以使用時(shí)務(wù)需注意以下事項(xiàng)時(shí)務(wù)需注意以下事項(xiàng): :v 缺少熟練使用玻璃刀經(jīng)驗(yàn)者，不要使用鉆石刀缺少熟練使用玻璃刀經(jīng)驗(yàn)者，不要使用鉆石刀; ;v 可用玻璃刀切片的樣品，盡量不用或少用鉆石刀可用玻璃刀切片的樣品，盡量不用或少用鉆石刀; ;v 鉆石刀的刀刃切勿手摸，安裝時(shí)要用特制的刀架，鉆石刀

21、的刀刃切勿手摸，安裝時(shí)要用特制的刀架， 其刀刃不能碰及硬物其刀刃不能碰及硬物; ;v 包埋塊游離端的表面積不得大于包埋塊游離端的表面積不得大于lmmlmm; ;v 切硬度較大的樣品時(shí)，其切片厚度應(yīng)小于切硬度較大的樣品時(shí)，其切片厚度應(yīng)小于100nm;100nm;v 切速選擇一般為切速選擇一般為lmmlmm/ /秒，最大不要高于秒，最大不要高于2mm/2mm/秒秒( (切切 速是指刀鋒通過包埋游離端的速率）速是指刀鋒通過包埋游離端的速率）; ;v 用完后要立即清洗，濾紙吸干后妥善保存。用完后要立即清洗，濾紙吸干后妥善保存。v 一般透射電鏡觀察樣品時(shí)，電子束無法穿過一般透射電鏡觀察樣品時(shí)，電子束無法

22、穿過 0.0.m m以上的切片，所以需將樣品切成以上的切片，所以需將樣品切成101050nm50nm的的 薄片才能觀察，與光鏡觀察的薄片才能觀察，與光鏡觀察的3 37 7m m切片對比而言，切片對比而言， 常將透射電鏡的切片稱為超薄切片。常將透射電鏡的切片稱為超薄切片。v 目前透射電鏡觀察最合適厚度為目前透射電鏡觀察最合適厚度為303040nm40nm之間。為之間。為 制取此類切片而設(shè)計(jì)的切片機(jī)稱超薄切片機(jī)。制取此類切片而設(shè)計(jì)的切片機(jī)稱超薄切片機(jī)。5 5、切片、切片v 超薄切片機(jī)按其設(shè)計(jì)的推進(jìn)原理，可分為機(jī)械推進(jìn)式超薄切片機(jī)按其設(shè)計(jì)的推進(jìn)原理，可分為機(jī)械推進(jìn)式 和熱膨脹推進(jìn)式兩類。目前國內(nèi)使用

23、較多的是瑞典和熱膨脹推進(jìn)式兩類。目前國內(nèi)使用較多的是瑞典 LKBLKB系列熱膨脹推進(jìn)式超薄切片機(jī)。系列熱膨脹推進(jìn)式超薄切片機(jī)。v 不同型號的超薄切片機(jī)雖然操作方式各不相同，但其不同型號的超薄切片機(jī)雖然操作方式各不相同，但其 切片原理都基本相同。切片原理都基本相同。v 所有切片機(jī)在切片過程中，都是使一個(gè)裝有樣品塊的所有切片機(jī)在切片過程中，都是使一個(gè)裝有樣品塊的 活動(dòng)臂上下運(yùn)動(dòng)并通過刀刃，在活動(dòng)臂每次下降切片活動(dòng)臂上下運(yùn)動(dòng)并通過刀刃，在活動(dòng)臂每次下降切片 之前均對著刀刃作微小的推進(jìn)，這樣便便一極薄的切之前均對著刀刃作微小的推進(jìn)，這樣便便一極薄的切 片從樣品塊表面被切割下來。刀上有一裝有液體的小片從

24、樣品塊表面被切割下來。刀上有一裝有液體的小 水槽、脫落下來的切片懸浮在小水槽的液面上。水槽、脫落下來的切片懸浮在小水槽的液面上。(1)(1)、超薄切片機(jī)、超薄切片機(jī)v 所有超薄切片機(jī)都有三種進(jìn)尺范圍，即粗調(diào)、微所有超薄切片機(jī)都有三種進(jìn)尺范圍，即粗調(diào)、微 進(jìn)尺和超微進(jìn)尺，借以調(diào)節(jié)樣品塊與刀刃間的距進(jìn)尺和超微進(jìn)尺，借以調(diào)節(jié)樣品塊與刀刃間的距 離及切片的厚度，同時(shí)還可保證機(jī)器的準(zhǔn)確線性離及切片的厚度，同時(shí)還可保證機(jī)器的準(zhǔn)確線性 運(yùn)動(dòng)并具有良好的重復(fù)性能。在切片機(jī)上都附有運(yùn)動(dòng)并具有良好的重復(fù)性能。在切片機(jī)上都附有 一個(gè)雙目顯微鏡和一個(gè)日光燈，用于選擇刀口、一個(gè)雙目顯微鏡和一個(gè)日光燈，用于選擇刀口、 刀

25、刃與樣品塊對準(zhǔn)和觀察切片的情況刀刃與樣品塊對準(zhǔn)和觀察切片的情況; ;還有一個(gè)聚還有一個(gè)聚 光燈，專門用以檢查刀刃的質(zhì)量。光燈，專門用以檢查刀刃的質(zhì)量。 從模式圖中可看出，熱脹式超薄切片機(jī)的樣品臂從模式圖中可看出，熱脹式超薄切片機(jī)的樣品臂的尾部連著一塊簧片，它由特殊的合金制成。當(dāng)電熱的尾部連著一塊簧片，它由特殊的合金制成。當(dāng)電熱絲通電時(shí)，簧片受熱，在絲通電時(shí)，簧片受熱，在2020分鐘左右的時(shí)間里，簧片分鐘左右的時(shí)間里，簧片可保持均勻而準(zhǔn)確地線性膨脹。正是這種極微小的膨可保持均勻而準(zhǔn)確地線性膨脹。正是這種極微小的膨脹力，推動(dòng)樣品臂向刀的方向移動(dòng)。這樣，在完成一脹力，推動(dòng)樣品臂向刀的方向移動(dòng)。這樣，

26、在完成一次切片的動(dòng)作時(shí)，就會(huì)切下一片超薄切片來。為了使次切片的動(dòng)作時(shí)，就會(huì)切下一片超薄切片來。為了使切片能順利落入水槽，在每個(gè)切片動(dòng)作的間歇中和樣切片能順利落入水槽，在每個(gè)切片動(dòng)作的間歇中和樣品臂抬起的同時(shí)，刀臺(tái)復(fù)位品臂抬起的同時(shí)，刀臺(tái)復(fù)位; ;以保證再切下一片。為以保證再切下一片。為了使簧片在切片過程中始終保持線性膨脹狀態(tài)，需要了使簧片在切片過程中始終保持線性膨脹狀態(tài)，需要每切完一個(gè)樣品后，利用換樣品的時(shí)間，打開吹風(fēng)機(jī)每切完一個(gè)樣品后，利用換樣品的時(shí)間，打開吹風(fēng)機(jī)冷卻片刻。否則持續(xù)加熱會(huì)使簧片失去原有的線性膨冷卻片刻。否則持續(xù)加熱會(huì)使簧片失去原有的線性膨脹，切片的厚薄就不均勻了。脹，切片的厚

27、薄就不均勻了。以瑞典以瑞典LKB-mLKB-m型超薄切片機(jī)為例，說明切片的基本步驟：型超薄切片機(jī)為例，說明切片的基本步驟：v 安裝包埋塊安裝包埋塊 將修好的包埋塊夾在樣品夾中，頂端露出約將修好的包埋塊夾在樣品夾中，頂端露出約2mm;2mm; 鎖住樣品臂，將樣品夾固定在鎖住樣品臂，將樣品夾固定在“樣品定向頭樣品定向頭”中。中。v 安放玻璃刀安放玻璃刀 將帶有水槽的玻璃刀放在刀夾中夾緊，并與刀將帶有水槽的玻璃刀放在刀夾中夾緊，并與刀 夾旁的標(biāo)尺等高。夾旁的標(biāo)尺等高。v 調(diào)好組織塊與玻璃刀的位置調(diào)好組織塊與玻璃刀的位置 用粗、中調(diào)進(jìn)刀，使刀盡量拉近組織塊的切面用粗、中調(diào)進(jìn)刀，使刀盡量拉近組織塊的切面

28、; ; 調(diào)節(jié)定向頭的高度，使組織塊的切面下緣與刀口等調(diào)節(jié)定向頭的高度，使組織塊的切面下緣與刀口等 高。水平移動(dòng)刀臺(tái)，使刀刃平直無缺口處對準(zhǔn)組織高。水平移動(dòng)刀臺(tái)，使刀刃平直無缺口處對準(zhǔn)組織 塊切面。松開樣品臂固定鎖，一手轉(zhuǎn)動(dòng)樣品臂升降塊切面。松開樣品臂固定鎖，一手轉(zhuǎn)動(dòng)樣品臂升降 鈕使樣品臂上下運(yùn)動(dòng)，一手調(diào)節(jié)中調(diào)或微調(diào)鈕，在鈕使樣品臂上下運(yùn)動(dòng)，一手調(diào)節(jié)中調(diào)或微調(diào)鈕，在 立體顯微鏡觀察下調(diào)至刀刃剛好切到組織為止。立體顯微鏡觀察下調(diào)至刀刃剛好切到組織為止。(2)(2)、超薄切片的基本步驟、超薄切片的基本步驟v 調(diào)節(jié)水槽液面及燈光位置調(diào)節(jié)水槽液面及燈光位置 用注射器向水槽中加入蒸餾水，直至液面略低用注射

29、器向水槽中加入蒸餾水，直至液面略低 于刀刃。調(diào)好燈光位置，使刀刃下方的液面上出現(xiàn)于刀刃。調(diào)好燈光位置，使刀刃下方的液面上出現(xiàn) 較大亮斑，以便看清切片的干涉顏色。較大亮斑，以便看清切片的干涉顏色。v 選定切片速度選定切片速度 切片速度是指切片刀的刀鋒通過樣品塊切割面切片速度是指切片刀的刀鋒通過樣品塊切割面 時(shí)每秒走行的距離而言。玻璃刀超薄切片的切片速時(shí)每秒走行的距離而言。玻璃刀超薄切片的切片速 度通常為度通常為2 25mm/5mm/秒，包埋塊偏軟時(shí)應(yīng)選擇較高的切秒，包埋塊偏軟時(shí)應(yīng)選擇較高的切 片速度，如包埋塊較硬時(shí)則應(yīng)選較慢的切速。片速度，如包埋塊較硬時(shí)則應(yīng)選較慢的切速。v 轉(zhuǎn)換樣品臂的動(dòng)作方式

30、轉(zhuǎn)換樣品臂的動(dòng)作方式 將樣品臂從手動(dòng)轉(zhuǎn)至自動(dòng)，切片機(jī)即自動(dòng)切片。將樣品臂從手動(dòng)轉(zhuǎn)至自動(dòng)，切片機(jī)即自動(dòng)切片。v 調(diào)節(jié)加熱電流調(diào)節(jié)加熱電流 通常選用通常選用50506Onm6Onm加熱進(jìn)尺，然后觀察切片的干加熱進(jìn)尺，然后觀察切片的干 涉顏色，如果切片太厚則應(yīng)減少加熱電流，切片太涉顏色，如果切片太厚則應(yīng)減少加熱電流，切片太 薄或切不著樣品時(shí)則應(yīng)增加電流，以使切片達(dá)到標(biāo)薄或切不著樣品時(shí)則應(yīng)增加電流，以使切片達(dá)到標(biāo) 準(zhǔn)的干涉色即為所要求的厚度。準(zhǔn)的干涉色即為所要求的厚度。v 切片表面的反射光和切片下面的折射光之間，會(huì)切片表面的反射光和切片下面的折射光之間，會(huì) 產(chǎn)生一種光學(xué)干涉的呈色現(xiàn)象，切片厚度呈現(xiàn)的產(chǎn)

31、生一種光學(xué)干涉的呈色現(xiàn)象，切片厚度呈現(xiàn)的 干涉顏色亦因之有別，根據(jù)這一原理就可以判斷干涉顏色亦因之有別，根據(jù)這一原理就可以判斷 切片的大致厚度。切片的大致厚度。v 一般情況下灰色及暗灰色的切片較薄，其分辨力一般情況下灰色及暗灰色的切片較薄，其分辨力 較高，但反差較弱且易于破裂較高，但反差較弱且易于破裂; ;金黃色或紫色的切金黃色或紫色的切 片較厚，其反差較好，但分辨力較低片較厚，其反差較好，但分辨力較低; ;一般認(rèn)為，一般認(rèn)為， 銀白色的切片較符合理想，反差和分辨率均適中。銀白色的切片較符合理想，反差和分辨率均適中。(3)(3)切片厚度的判斷切片厚度的判斷切片干涉顏色與切片厚度切片干涉顏色與切

32、片厚度干涉顏色暗灰色灰色銀白色金黃色紫色干涉顏色暗灰色灰色銀白色金黃色紫色切片厚度切片厚度（nmnm） 以下以下 以上以上v 飄浮在水槽液面上的切片，需撈于銅網(wǎng)上才適于在電飄浮在水槽液面上的切片，需撈于銅網(wǎng)上才適于在電 鏡下觀察。鏡下觀察。v 因?yàn)榍衅鼙?，極易重疊和起皺摺，故在撈片之前先因?yàn)榍衅鼙?，極易重疊和起皺摺，故在撈片之前先 用鑷子夾一塊沾有二甲苯或氯仿的濾紙靠近刀槽液用鑷子夾一塊沾有二甲苯或氯仿的濾紙靠近刀槽液 面，借溶劑揮發(fā)的蒸氣將切片稍加軟化，并使切片上面，借溶劑揮發(fā)的蒸氣將切片稍加軟化，并使切片上 的皺摺展平，這一過程叫展片。的皺摺展平，這一過程叫展片。v 長時(shí)間的展片會(huì)損傷

33、樣品的微細(xì)結(jié)構(gòu)，故展片時(shí)間不長時(shí)間的展片會(huì)損傷樣品的微細(xì)結(jié)構(gòu)，故展片時(shí)間不 能過長，以能過長，以3 3秒鐘為宜秒鐘為宜; ;而且展片時(shí)，要防止溶劑而且展片時(shí)，要防止溶劑 距切片過近或接觸切片。距切片過近或接觸切片。v 展片后用一根睫毛針，在立體顯微鏡下將平展于水面展片后用一根睫毛針，在立體顯微鏡下將平展于水面 上的切片帶輕輕撥成幾段，再以專用鑷子夾住銅網(wǎng)邊上的切片帶輕輕撥成幾段，再以專用鑷子夾住銅網(wǎng)邊 緣，使帶有支持膜的一面對準(zhǔn)切片輕輕沾取，即可將緣，使帶有支持膜的一面對準(zhǔn)切片輕輕沾取，即可將 切片沾附于銅網(wǎng)之上。而后，用濾紙角吸掉銅網(wǎng)上多切片沾附于銅網(wǎng)之上。而后，用濾紙角吸掉銅網(wǎng)上多 余的水

34、分，放入培養(yǎng)皿的濾紙上等待染色。余的水分，放入培養(yǎng)皿的濾紙上等待染色。4.4.撈片撈片超薄切片需經(jīng)染色后，才能在電鏡下顯示出清超薄切片需經(jīng)染色后，才能在電鏡下顯示出清晰的結(jié)構(gòu)圖像。超薄切片的染色是一種晰的結(jié)構(gòu)圖像。超薄切片的染色是一種 電子染色電子染色 ，其目的是增強(qiáng)樣品中各種結(jié)構(gòu)圖像之間的反差，所其目的是增強(qiáng)樣品中各種結(jié)構(gòu)圖像之間的反差，所以與光鏡切片所呈現(xiàn)的色彩完全不同，它所顯示的以與光鏡切片所呈現(xiàn)的色彩完全不同，它所顯示的圖像為黑白對比圖像。圖像為黑白對比圖像。1 1、電鏡圖像反差的形成、電鏡圖像反差的形成八、染色八、染色電子束照射到樣品以后，與組成樣品物質(zhì)中的原子電子束照射到樣品以后，

35、與組成樣品物質(zhì)中的原子核及核外電子產(chǎn)生彈性散射與非彈性散射作用，并產(chǎn)生核及核外電子產(chǎn)生彈性散射與非彈性散射作用，并產(chǎn)生帶有樣品信息的其他各種訊號。上述彈性散射，特別是帶有樣品信息的其他各種訊號。上述彈性散射，特別是非彈性散射，為電鏡成像的最重要因素。樣品中質(zhì)量密非彈性散射，為電鏡成像的最重要因素。樣品中質(zhì)量密度高的區(qū)域，可散射較多的電子，其透過的電子量較少，度高的區(qū)域，可散射較多的電子，其透過的電子量較少，在熒光屏上呈現(xiàn)出電子致密的暗區(qū)；相反，在質(zhì)量密度在熒光屏上呈現(xiàn)出電子致密的暗區(qū)；相反，在質(zhì)量密度低的區(qū)域，散射的電子較少，透過的電子較多，故可呈低的區(qū)域，散射的電子較少，透過的電子較多，故可

36、呈現(xiàn)為電子透明的亮區(qū)。這樣，即可形成一個(gè)具有明暗反現(xiàn)為電子透明的亮區(qū)。這樣，即可形成一個(gè)具有明暗反差對比的、容易辨認(rèn)的電鏡圖像。因此，電鏡圖像的反差對比的、容易辨認(rèn)的電鏡圖像。因此，電鏡圖像的反差是由樣品不同部位電子散射力的差異所決定的，也反差是由樣品不同部位電子散射力的差異所決定的，也反映了樣品不同部位電子密度的差異。映了樣品不同部位電子密度的差異。生物組織系由碳、氫、氧、氮等輕元素所組成，生物組織系由碳、氫、氧、氮等輕元素所組成，由于這些元素的原子序數(shù)較低、散射電子的能力較弱，由于這些元素的原子序數(shù)較低、散射電子的能力較弱，所以未經(jīng)染色的超薄切片反差很低，在電鏡下幾乎看所以未經(jīng)染色的超薄切

37、片反差很低，在電鏡下幾乎看不清生物組織的微細(xì)結(jié)構(gòu)。重金屬化合物有較強(qiáng)的電不清生物組織的微細(xì)結(jié)構(gòu)。重金屬化合物有較強(qiáng)的電子散射能力，超薄切片多采用鈾、鉛、鋨、鎢等重金子散射能力，超薄切片多采用鈾、鉛、鋨、鎢等重金屬鹽類作為染色劑。經(jīng)浸染重金屬化合物的超薄切片，屬鹽類作為染色劑。經(jīng)浸染重金屬化合物的超薄切片，不同結(jié)構(gòu)成分會(huì)吸附不同數(shù)量的重金屬原子，吸附重不同結(jié)構(gòu)成分會(huì)吸附不同數(shù)量的重金屬原子，吸附重金屬較多的部分有較強(qiáng)的電子散射力，在電鏡圖像中金屬較多的部分有較強(qiáng)的電子散射力，在電鏡圖像中可呈現(xiàn)電子致密的黑色；相反，結(jié)合重金屬較少的部可呈現(xiàn)電子致密的黑色；相反，結(jié)合重金屬較少的部位電子散射力較弱，

38、在電鏡圖像申呈現(xiàn)的顏色較淺；位電子散射力較弱，在電鏡圖像申呈現(xiàn)的顏色較淺；沒有吸附重金屬原子的部分，則透過的電子最多，故沒有吸附重金屬原子的部分，則透過的電子最多，故在熒光屏電鏡圖像上呈現(xiàn)為無色透明的區(qū)域。所以重在熒光屏電鏡圖像上呈現(xiàn)為無色透明的區(qū)域。所以重金屬鹽染色是一種提高樣品結(jié)構(gòu)反差、增強(qiáng)圖像清晰金屬鹽染色是一種提高樣品結(jié)構(gòu)反差、增強(qiáng)圖像清晰度的度的 電子染色電子染色 。2 2、切片的電子染色、切片的電子染色v 醋酸鈾醋酸鈾( (醋酸雙氧鈾醋酸雙氧鈾) ) 是廣泛采用的染色劑。是廣泛采用的染色劑。v 特點(diǎn)特點(diǎn)q 可與細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)分子結(jié)合，以提高核酸、蛋白質(zhì)和可與細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)分子結(jié)合，以提

39、高核酸、蛋白質(zhì)和 結(jié)締組織纖維成分的反差為主，對膜的染色效果較差；結(jié)締組織纖維成分的反差為主，對膜的染色效果較差；q 它具有一定放射性及化學(xué)毒性，對光和高溫具有不穩(wěn)它具有一定放射性及化學(xué)毒性，對光和高溫具有不穩(wěn) 定性，所以其配液需貯藏于棕色瓶和定性，所以其配液需貯藏于棕色瓶和4 4的冰箱內(nèi)。的冰箱內(nèi)。v 配制配制 常用濃度為飽和液，配制時(shí)可取醋酸鈾常用濃度為飽和液，配制時(shí)可取醋酸鈾2 2克加入克加入 50507070乙醇乙醇100ml100ml內(nèi)，亦可用雙蒸水配制，溶液內(nèi)，亦可用雙蒸水配制，溶液pHpH值值 約為約為4.24.2左右。切片染色可在室溫或左右。切片染色可在室溫或3737環(huán)境里進(jìn)行

40、，環(huán)境里進(jìn)行， 時(shí)間為時(shí)間為15153030分鐘或更長。分鐘或更長。3 3、常用的電子染色劑、常用的電子染色劑(1)(1)醋酸鈾醋酸鈾v 鉛鹽最常使用，有鉛鹽最常使用，有全能染色劑全能染色劑之稱。之稱。v 特點(diǎn)特點(diǎn)q 可以與細(xì)胞內(nèi)的核蛋白及糖元結(jié)合，亦可大大提高細(xì)胞膜系統(tǒng)可以與細(xì)胞內(nèi)的核蛋白及糖元結(jié)合，亦可大大提高細(xì)胞膜系統(tǒng) 與脂類物質(zhì)的反差，幾乎可以浸染細(xì)胞內(nèi)的所有成分。與脂類物質(zhì)的反差，幾乎可以浸染細(xì)胞內(nèi)的所有成分。q 鉛鹽的缺點(diǎn)是具有一定的毒性，極易與空氣中的鉛鹽的缺點(diǎn)是具有一定的毒性，極易與空氣中的COCO結(jié)合產(chǎn)生結(jié)合產(chǎn)生 +9+9碳酸鉛沉淀而污染切片，后者在電鏡下呈現(xiàn)黑色致密的圓形碳

41、酸鉛沉淀而污染切片，后者在電鏡下呈現(xiàn)黑色致密的圓形 及不定形顆粒。及不定形顆粒。v 配制配制 配制鉛鹽溶液所使用的雙蒸水，先加熱煮沸，以除去水里配制鉛鹽溶液所使用的雙蒸水，先加熱煮沸，以除去水里 的的COCO；配制好的溶液，可在其表面滴加一層液體石臘或密封；配制好的溶液，可在其表面滴加一層液體石臘或密封 于注射器中保存，使之與空氣隔離；染色前最好先將染色劑離于注射器中保存，使之與空氣隔離；染色前最好先將染色劑離 心，以除去沉淀部分；染色時(shí)要選用小的平皿，或采取其他密心，以除去沉淀部分；染色時(shí)要選用小的平皿，或采取其他密 封措施，以減少與空氣接觸的機(jī)會(huì)；染色后用水洗去染液，立封措施，以減少與空氣

42、接觸的機(jī)會(huì)；染色后用水洗去染液，立 即在即在40405O5O溫箱中烘干待用。溫箱中烘干待用。v 鉛鹽類染色劑包括檸檬酸鉛、醋酸鉛、氫氧化鉛、酒鉛鹽類染色劑包括檸檬酸鉛、醋酸鉛、氫氧化鉛、酒 石酸鉛等，以石酸鉛等，以檸檬酸鉛檸檬酸鉛( (拘椽酸鉛拘椽酸鉛) )最為常用。最為常用。(2)(2)鉛鹽類染色劑鉛鹽類染色劑v 高錳酸鉀除可用于固定高錳酸鉀除可用于固定( (對膜結(jié)構(gòu)固定較理想對膜結(jié)構(gòu)固定較理想) )外，亦外，亦 可用作切片染色劑?？捎米髑衅旧珓?。v 特點(diǎn)特點(diǎn) 經(jīng)鋨酸固定后的組織，若再用高錳酸鉀染色，則經(jīng)鋨酸固定后的組織，若再用高錳酸鉀染色，則 能更好地顯示神經(jīng)髓鞘、基底膜、張力原纖維、細(xì)

43、胞能更好地顯示神經(jīng)髓鞘、基底膜、張力原纖維、細(xì)胞 膜、橋粒等結(jié)構(gòu)。膜、橋粒等結(jié)構(gòu)。v 配制配制 通常用新配制的通常用新配制的1%1%高錳酸鉀水溶液，切片浸染高錳酸鉀水溶液，切片浸染3030 分鐘后，用分鐘后，用0.0250.025檸檬酸溶液清洗，再用雙蒸水漂檸檬酸溶液清洗，再用雙蒸水漂 洗切片，其染色效果與檸檬酸鉛相似。染色時(shí)應(yīng)注意洗切片，其染色效果與檸檬酸鉛相似。染色時(shí)應(yīng)注意 使染液充滿密封容器內(nèi)，以免染液氧化而污染切片。使染液充滿密封容器內(nèi)，以免染液氧化而污染切片。(3)(3)高錳酸鉀高錳酸鉀多在脫水之前進(jìn)行。樣品塊經(jīng)鋨酸固定后，可多在脫水之前進(jìn)行。樣品塊經(jīng)鋨酸固定后，可用醋酸鈾用醋酸鈾5050