單克隆抗體制備技術(shù)

1、 單克隆抗體制備技術(shù) 2008年11月6日雜交瘤技術(shù)的基本原理雜交瘤技術(shù)的基本原理雜交瘤技術(shù)的基本原理雜交瘤技術(shù)的基本原理1：HAT選擇培養(yǎng)基： 次黃嘌呤(hypoxanthine,H) 氨基蝶呤(aminopterin,A) 胸腺嘧啶核苷(thymidine,T).2：細(xì)胞的DNA合成一般有兩條途徑：A：由糖和氨基酸合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA，葉酸作為重要的輔酶參與反應(yīng)。B：在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在下，經(jīng)次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶(HGPRT)或胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化下合成DNA。雜交瘤技術(shù)的基本原理雜交瘤技術(shù)的基本原理HAT培養(yǎng)基的選擇原理：A：氨基蝶呤(A)是葉酸拮抗劑，可阻斷細(xì)

2、胞利用正常途徑合成DNA，細(xì)胞在含有氨基蝶呤的培養(yǎng)基中不能通過正常途徑合成DNA。B：瘤細(xì)胞是HGPRT酶陰性細(xì)胞，自身不能通過替代途徑合成DNA而繁殖。C：B細(xì)胞雖含有HGPRT，但不能在體外培養(yǎng)存活（只存活57d，且功能下降)。D：融合細(xì)胞含有B細(xì)胞和瘤細(xì)胞，其中瘤細(xì)胞核利用B細(xì)胞的HGPRT酶進(jìn)行旁路合成DNA而存活。免疫程序與檢測方法的建立o免疫程序o建立檢測方法o檢測免疫效果免疫程序免疫程序 取6-8周齡BalbC雌鼠，首免，每只鼠用0.5 mL含50 g的重組蛋白與10 % 體積的ISA15A VG 佐劑混勻，頸背部皮下多點(diǎn)注射；間隔3 w進(jìn)行二免，免疫原、劑量和方法同上；再間隔2

3、 w進(jìn)行三免，免疫原不含佐劑，腹腔注射，劑量同上。細(xì)胞融合前3 d加強(qiáng)免疫，腹腔注射0.5 mL含50-100 g純化的蛋白。 3-5天后用于融合。 免疫程序免疫程序 免疫時(shí)是否采用佐劑和事先處理抗原，要依抗原性的強(qiáng)弱而定。一般來講可溶性抗原用完全佐劑效果較好?？乖客瑯优c抗原強(qiáng)弱有關(guān)，以IgG為例，第一次為100g，第二次為50g，免疫途徑第一次可經(jīng)腹腔注射。對于細(xì)胞性抗原不用佐劑，每次腹腔注射1l06-1107。檢測方法的建立及免疫效果的評價(jià)A：建立成熟的檢測方法是關(guān)鍵，一般有以下幾種方法： ELISA IPMA 免疫熒光B：免疫效果的評價(jià) 一般于三免疫后一周，通過尾靜脈采血檢測抗體產(chǎn)生情

4、況，一般以稀釋1000倍仍為陽性判為免疫成功。雜交瘤細(xì)胞株的建立o SP2/0細(xì)胞的準(zhǔn)備 o 飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備o 免疫脾細(xì)胞的制備o 融合 o 陽性雜交瘤的篩選 o 細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇o 單克隆抗體的制備 SP2/0細(xì)胞的準(zhǔn)備o SP2/0細(xì)胞在融合前應(yīng)先用含8-氮鳥嘌呤的培養(yǎng)基作適應(yīng)培養(yǎng)，使生存的細(xì)胞對HAT呈均一的敏感性。o 融合前24-48 h將SP2/0細(xì)胞分瓶擴(kuò)大培養(yǎng)，融合前6 h，棄去瓶中培養(yǎng)液，換上新液。o 融合時(shí)，選擇形態(tài)良好、呈對數(shù)生長的SP2/0細(xì)胞，將其從瓶壁上輕輕吹下，收集于15 mL離心管內(nèi)，1000 rpm離心5 min，用5 mL無血清的1640懸浮沉淀，再離心一次

5、，然后用無血清的1640培養(yǎng)液重新懸浮，細(xì)胞計(jì)數(shù)，取107細(xì)胞懸液備用。 飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備o融合前一天制備飼養(yǎng)細(xì)胞，一般選用8周齡Balb/C小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，步驟如下：1.將Balb/C小鼠摘除眼球采血（留做陰性對照），然后拉頸處死，浸泡在75%酒精內(nèi)，5min。2.用無菌剪刀剪開皮膚，用無菌鑷子撕開皮膚，暴露腹膜。3.用5mL無菌注射器吸取5mL HAT選擇培養(yǎng)液注入到小鼠腹腔中（嚴(yán)禁刺破腸管），注射器不拔出，然后用無菌鑷子輕輕觸動(dòng)幾次左右兩側(cè)腹膜，吸出營養(yǎng)液。4.重復(fù)1次上步操作，補(bǔ)足20mL HAT選擇培養(yǎng)液，混勻后加入2塊96孔板，100L/孔，放入37 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。（此為經(jīng)驗(yàn)

6、操作，標(biāo)準(zhǔn)操作要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，濃度為1105/mL；如果做2塊飼養(yǎng)細(xì)胞，吹兩次即可，如果做3塊則加吹一次）免疫脾細(xì)胞的制備o加強(qiáng)免疫3-5天后小鼠眼球采血（作為陽性對照，盡量多的采血，否則脾中紅細(xì)胞較多，影響融合），然后拉頸處死，浸泡在75%酒精內(nèi)，5min。o用無菌剪刀剪開皮膚，無菌鑷子撕開皮膚，暴露腹膜；再用無菌剪刀剪開腹膜，暴露脾臟；無菌取脾臟，無血清1640洗一次，去除結(jié)締組織；無菌注射器吸取1640培養(yǎng)液，將脾細(xì)胞吹出；1000rpm離心5min，細(xì)胞用1640培養(yǎng)液洗1次，細(xì)胞計(jì)數(shù)，取5107-1108脾細(xì)胞懸液備用。 融 合o將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1：10-1：5的比例混合在一起

7、，在15mL離心管中用無血清1640洗1次，離心，1000rpm,5min;棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響PEG濃度。輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略松動(dòng)。o60s內(nèi)加入37預(yù)溫的1mL 50%PEG溶液，邊加邊輕微搖動(dòng)。37水浴靜置作用90s。o加37預(yù)溫的1640培養(yǎng)液以終止PEG作用，首先，1 min加入1 mL，然后在5 min內(nèi)緩慢加入10mL，終止后置于37作用5min。o離心，800rpm, 5min。o棄上清，輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略松動(dòng)，用40mL含HAT選擇培養(yǎng)液輕輕重懸。o將上述細(xì)胞，加到已有飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孔板內(nèi)，每孔加100L。一般一個(gè)免疫脾臟可接種4-6塊

8、96孔板。o將培養(yǎng)板置37、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 培養(yǎng)天數(shù)培養(yǎng)天數(shù) 脾細(xì)胞脾細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞 飼養(yǎng)細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞 雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞 0 良好良好 良好良好 良好良好 可見融合細(xì)胞可見融合細(xì)胞 1-2 開始死亡開始死亡 銳減銳減 良好良好 成成2-3個(gè)亮細(xì)胞個(gè)亮細(xì)胞 3-4 大部死亡大部死亡 幾乎完全死亡幾乎完全死亡 良好良好 成簇成簇3-5，10個(gè)細(xì)胞個(gè)細(xì)胞 5-7 死亡死亡 死亡死亡 變形變形 100個(gè)左右細(xì)胞呈小島個(gè)左右細(xì)胞呈小島 7-14 死亡死亡 死亡死亡 變形變形 1/3-1/5孔底面積孔底面積融合后各種細(xì)胞的情況換液換液：融合之后5d換液，吸出150L，加入200

9、L HT營養(yǎng)液。融合過程中注意事項(xiàng)o SP2/0細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞數(shù)比例適當(dāng)。o 兩種細(xì)胞要處于較好的狀態(tài)，吹吸細(xì)胞時(shí)要輕柔。o PEG融合之后，加營養(yǎng)液中和時(shí)要緩慢，以免將破壞融合細(xì)胞。陽性雜交瘤的篩選o 雜交瘤細(xì)胞長到孔底1/5-1/10時(shí)可以進(jìn)行檢測，一般情況下10d即可；還可以當(dāng)營養(yǎng)液發(fā)黃時(shí)檢測。o 取樣：無菌取雜交瘤培養(yǎng)上清，然后在原孔中加入HT培養(yǎng)液。o 應(yīng)用已經(jīng)建立起的檢測方法篩選陽性孔，以制備PCV2-Cap單抗為例： 用重組PCV2-Cap蛋白和野生型桿狀病毒包被ELISA板進(jìn)行平行檢測，每孔加入50L雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液（如果同時(shí)檢測項(xiàng)目繁多，可以統(tǒng)一稀釋2-5倍進(jìn)行檢測）。

10、重組PCV2-Cap蛋白檢測為陽性而野生型桿狀病毒為陰性的的雜交瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)入24孔板進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)（HT培養(yǎng)液）， 長至80%單層時(shí)再檢測一次，如果仍然為陽性則立即進(jìn)行進(jìn)行亞克隆。陽性雜交瘤的篩選過程中注意事項(xiàng)o 檢測雜交瘤細(xì)胞的時(shí)機(jī)很重要，早了抗體產(chǎn)生量少，不易檢出；晚了細(xì)胞死亡較多，不利于后續(xù)培養(yǎng)及亞克隆。o 從96孔板中取樣品之后應(yīng)立即補(bǔ)上HT培養(yǎng)液，利于細(xì)胞保持較好的狀態(tài)。o 取樣時(shí)做好標(biāo)記，以免造成錯(cuò)誤。雜交瘤細(xì)胞的亞克隆原則o 對于檢測抗體陽性的雜交克隆應(yīng)盡早進(jìn)行克隆化，否則抗體分泌的細(xì)胞會(huì)被抗體非分泌的細(xì)胞所抑制，因?yàn)榭贵w非分泌細(xì)胞的生長速度比抗體分泌的細(xì)胞生長速度快，二者競爭的結(jié)果

11、會(huì)使抗體分泌的細(xì)胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細(xì)胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細(xì)胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。雜交瘤細(xì)胞的亞克隆的方法o 24孔中細(xì)胞生長狀態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞可以進(jìn)行亞克隆，將細(xì)胞用營養(yǎng)液吹起，適當(dāng)稀釋后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取100個(gè)細(xì)胞加入到20mL含20% FBS營養(yǎng)液中，混勻后加到96孔板中，200L/孔。也可以亞克隆前一天制備飼養(yǎng)層細(xì)胞，再進(jìn)行亞克隆。當(dāng)細(xì)胞長至孔底1/5-1/10時(shí)（大約10天）進(jìn)行檢測，將具有單個(gè)克隆的陽性細(xì)胞孔繼續(xù)進(jìn)行第二次亞克隆，當(dāng)亞克隆之后檢測到每個(gè)雜交瘤細(xì)胞孔都為陽性為止，一般要經(jīng)過3次亞克隆。亞克隆過程中注意事項(xiàng)o 亞克隆之前可

12、以制備飼養(yǎng)層細(xì)胞，促進(jìn)雜交瘤細(xì)胞生長；如果細(xì)胞狀態(tài)好，也可以不用飼養(yǎng)層細(xì)胞。o 在細(xì)胞計(jì)數(shù)前應(yīng)該將雜交瘤細(xì)胞做適當(dāng)?shù)南♂?，稀釋倍?shù)根據(jù)細(xì)胞量而定，10-100倍不等。細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)將細(xì)胞控制在2-10104/mL，這樣計(jì)數(shù)時(shí)即快又準(zhǔn)。o 第一次亞克隆時(shí)，為了確保成功，可以取200個(gè)細(xì)胞進(jìn)行亞克隆。o 如果細(xì)胞生長不良，可以中途換液，把細(xì)胞吹散。細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇o 單抗的制備是一個(gè)較長的過程，中途可能會(huì)發(fā)生污染而前功盡棄，所以要及時(shí)進(jìn)行細(xì)胞的凍存：各個(gè)時(shí)期的陽性孔雜交瘤細(xì)胞都要凍存。 將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞吹起后，1000rpm離心5min，棄上清，用凍存液將細(xì)胞重懸，之后凍存，程序如下：4 放置1h

13、，-20 放置4h，-80 過夜，然后置液氮中保存。o 細(xì)胞的復(fù)蘇：從液氮中取出細(xì)胞，迅速置于37 水浴鍋中迅速融化細(xì)胞，營養(yǎng)液稀釋后1000rpm離心5min，棄上清，用營養(yǎng)液將細(xì)胞重懸之后常規(guī)培養(yǎng)。單克隆抗體的制備o 培養(yǎng)上清法 將陽性雜交瘤擴(kuò)大培養(yǎng)，直到細(xì)胞全部死亡，收集培養(yǎng)液凍存?zhèn)溆茫摲▎慰购可?。o 腹水的制備常規(guī)是先腹腔注射0.5mL Pristane (降植烷) 或液體石臘于BaLbc鼠，1周后腹腔注射1106個(gè)雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞710天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動(dòng)物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲110

14、mL腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達(dá)5-20mg/ml， 這是目前最常用的方法，還可將腹水中細(xì)胞凍存起來，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水快、量多。單克隆抗體的鑒定o 抗體特異性的鑒定 o McAb的Ig類與亞類的鑒定 o Western-blot分析 o McAb中和活性的鑒定 o McAb識別抗原表位的鑒定 o McAb親和力的鑒定 抗體特異性的鑒定o除用免疫原(抗原)進(jìn)行抗體的檢測外，還應(yīng)用與其抗原成分相關(guān)的其它抗原進(jìn)行交叉試驗(yàn)，方法可用ELISA、IFA、IPMA等法。McAb的Ig類與亞類的鑒定o 采用商品化的亞類鑒定試劑盒進(jìn)行。Western-blo

15、t分析o 以抗PCV2 的單抗為例：取純化的PCV2病毒進(jìn)行SDS-PAGE分析，然后將其轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜（NC）上，與篩選到的5株單抗進(jìn)行Western-blot，以SP2/0培養(yǎng)上清作為對照，HRP-Goat Anti-Mouse IgG(H+L)為二抗，用3，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）底物溶液顯色、拍照。McAb中和活性的鑒定o 以抗PCV2單抗為例，用固定病毒稀釋抗體的方法進(jìn)行病毒中和試驗(yàn)用于檢測單抗的中和活性。將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液和腹水按 1: 2系列稀釋，分別與含有 200 個(gè)TCID50 的 PCV2/LG 株等體積混合，置37 感作3 h；同設(shè) PCV2 陽性血清、SP2/

16、0 細(xì)胞培養(yǎng)上清作為陽性和陰性對照。病毒接種細(xì)胞培養(yǎng)至72 h，固定細(xì)胞，用 PCV2 陽性血清進(jìn)行IPMA檢測各孔病毒抗原反應(yīng)，將能夠抑制50 %病毒增殖的抗體最高稀釋倍數(shù)定為抗體中和效價(jià)。 McAb識別抗原表位的鑒定o 采用間接ELISA法相加試驗(yàn)，計(jì)算相加指數(shù)（AI）來分析單抗決定簇，具體做法如下： 在包被好抗原的ELISA板中分別加入各種單抗（均為稀釋5倍）各100L，以及各單抗兩兩組合各50 L，37孵育1 h，后序步驟與常規(guī)ELISA相同。根據(jù)下列公式計(jì)算AI，A1，A2分別為各株單抗的A值，A1+2為兩兩組合的混合單抗的A值。AI 大于10%表示兩株單抗針對不同抗原表位，具有相加效應(yīng)； AI小于10%則表示兩株單抗針對抗原表位相同或相近。AI= （A1+2- A1）/ A2100%McAb相對親和力的鑒定o 采用ELISA法，用抗原包被ELISA板，一抗為不同稀釋度的單抗，二抗為羊抗鼠IgG，ABTS顯色后測定A值。再以單抗的濃度的濃度為橫坐標(biāo)，以其相應(yīng)的A值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上根據(jù)直線中點(diǎn)對應(yīng)的各株單抗的濃度，即可求出各株單抗的相對親和力。溶液的配制o HAT選擇培養(yǎng)液： 76 mL 1640營養(yǎng)液 20 mL FBS（PAA） 2 mL HAT（Sigma，50X） 2 mL 5.6%碳酸氫鈉溶液 100