診斷分子生物學基本技術(shù)

1、診斷分子生物學基本技術(shù)診斷分子生物學基本技術(shù)診斷分子生物學基本技術(shù)診斷分子生物學基本技術(shù)基礎知識實驗基礎診斷技術(shù)臨床應用ampr半乳糖苷酶N端編碼序列變性與復性變性與復性（denaturation and renaturation）變性 在某些理化因素作用下，DNA分子互補堿基對之間的氫鍵斷裂，使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)松散，變成單鏈，即變性l增色效應 解鏈過程中，DNA的A260增加，并與解鏈溫度有一定的關(guān)系，這重關(guān)系稱為DNA的增色效應 復性 變性DNA在適當?shù)臈l件下，兩條互補鏈可重新恢復天然的雙螺旋構(gòu)象即復性l退火 熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻即可復性，這一過程稱為退火解鏈溫度解鏈溫度Tm(melt

2、ing temperature)解鏈曲線 在連續(xù)加熱DNA過程中，以溫度對A260的關(guān)系作圖，所得曲線稱為解鏈曲線 解鏈溫度 Tm 在解鏈曲線中，紫外線吸收值達到達50%時的溫度為Tm。在Tm時，核酸分子內(nèi)50%的雙鏈結(jié)構(gòu)被打開Tm的影響因素l堿基組成 與G+C比例有關(guān)， G+C比例越高，Tm值越高l實驗條件 例如三氯醋酸存在使Tm變小，氯化鈉存在使Tm升高基因載體基因載體（gene vector）概念 把目的基因?qū)胨拗骷毎?，使之傳代、擴增、表達的工具。特點 自我復制 遺傳標記 插入位點種類 質(zhì)粒 噬菌體 病毒質(zhì)粒質(zhì)粒（plasmid）概念 存在于細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。結(jié)構(gòu)

3、l 起動區(qū)（復制原點Ori）l 標記位點 抗抗生素標記（抗氨芐青霉素ampr、抗四環(huán)素terr） 半乳糖苷酶 片段l 基因發(fā)動子（乳糖操縱子等）l轉(zhuǎn)錄終止位點l 限制性內(nèi)切酶位點 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶（restriction endonuclease)概念 識別DNA的特異序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。分類 三類 重組技術(shù)中常用一類識別位點 回文結(jié)構(gòu)即核苷酸結(jié)構(gòu)呈二元旋轉(zhuǎn)對稱。切口類型 平端 AGCT- Alu - AG CT- -TGCA- -TC GA- 粘端 - GAATT C- EcoR1 -G AATTC- -C TTAAG- -CTTAA G-DNADN

4、A連結(jié)酶連結(jié)酶（DNA ligase）概念 連接DNA鏈3-OH末端和相鄰DNA鏈的5-P末端，生成磷酸二酯鍵而形成完整的DNA鏈種類 l T4噬菌體DNA連結(jié)酶lT4噬菌體RNA連結(jié)酶l大腸E.coliDNA連結(jié)酶作用l連接粘端l連接平端目的基因目的基因（target gene）概念 需要研究的基因叫目的基因。來源l基因文庫 存在于轉(zhuǎn)化菌內(nèi)、由克隆載體所帶的所有基因組DNA的集合。l化學合成法 用DNA合成儀利用化學原理合成該核苷酸序列。lcDNA 以mRNA為模板， 利用反轉(zhuǎn)錄酶合成與mRNA互補的DNA。l聚合酶鏈反應 在體外利用酶促反應獲得特異序列的基因組DNA。核酸的分離與純化核酸的

5、分離與純化（the separation and purification of nucleic acid）細胞的溶解 因標本而異 用SDS、Triton x-100 、 超聲破碎等核酸的分離 苯酚使蛋白質(zhì)變性沉淀于有機相，而核酸保留在水相，將核酸分離核酸的提取 冷乙醇或異丙醇沉淀核酸，離心回收核酸去除雜質(zhì) 70%的乙醇洗滌沉淀，除去處多余的鹽類核酸探針的標記核酸探針的標記（the labelling probe of nucleic acid）概念 對已知堿基序列的單鏈核酸用示蹤物進行標記得到核酸探針示蹤物分類 l放射性核素類 優(yōu)點 ： 靈敏度高、特異性高、不影響酶促反應。缺點：污染環(huán)境、損

6、害人體。l非放射性核素類 抗原抗體免疫標記物地高辛、親和配體標記物生物素、熒光標記物lFITC、電子密度標記物膠體金等。標記方法 缺口平移法 隨機引物法 末端標記法缺口平移標記法缺口平移標記法（The label method of nick level moving）概念 由Dnase 在DNA雙鏈上切出隨機切口，DNA聚合酶沿缺口水解5端核苷酸和3端修復加入被標記核苷酸同時進行，切口平行推移，可均一標記DNA鏈，合成與模板互補的新鏈。優(yōu)點 快速、簡便、成本相對低、比活性較高、標記均一，大分子標記效果好（1000bp）。缺點 單鏈DNA、RNA、200bp不能用該法標記。隨機引物標記法隨機引

7、物標記法(The label method of random primer)概念 采用6個核苷酸的隨機引物 與模板DNA結(jié)合的原理將標記物摻入到新合成的DNA片段中去，完成探針標記反應。l隨機引物 是指有各種可能排列組合順序的混合物，能與任何核酸序列退火雜交，并為DNA聚合酶的反應起到引物作用。方法 將雙鏈DNA變性為單鏈，與隨機引物退火雜交，在含有dNTP底物的示蹤物的存在下，由Klenow片段催化下，從引物3末端開始按5-3方向合成新的互補DNA鏈，即標記的DNA探針。優(yōu)點 具有缺口平移標記法的優(yōu)點，而且能標記任何長度的DNA及RNA。末端標記法末端標記法（The end- labell

8、ing method ）概念 用核酸修飾酶對核酸片段的5或3末端進行部分標記，不對全長標記。分類 lKlenow片段末端標記法 在有標記的dNTP存在下， Klenow片段可以填充雙鏈DNA凹陷的3末端，獲得標記的DNA探針。lT4DNA聚合酶置換合成標記法 利用T4DNA聚合酶的3-5核酸外切酶和5-3核酸內(nèi)切酶的作用，使3末端凹陷，加入有標記的dNTP，獲得標記的DNA探針，用于末端為3突出粘端和平端的情況。lT4多聚核苷酸激酶標記法 T4多聚核苷酸激酶可將-32PATP的- 32P轉(zhuǎn)移到DNA游離的5-OH上，還可催化- 32P與5末端的磷酸基團交換，因此無論是否5末端去磷酸均可用此法標

9、記。分子生物學實驗診斷技術(shù)分子生物學實驗診斷技術(shù)核酸擴增技術(shù)核酸雜交技術(shù)多態(tài)性的分析核酸序列分析DNA重組技術(shù)雜交核酸技術(shù)雜交核酸技術(shù)（The hybridization technique of nucleic acid） 核酸分子雜交 在DNA復性過程中，如果把不同的DNA單鏈分子或者把DNA與RNA放在一起，只要存在堿基配對關(guān)系，就可以在不同分子間形成雜化雙鏈，這種分子現(xiàn)象為核酸分子雜交 核酸雜交技術(shù) 利用核酸堿基嚴格配對的特異性，核酸標記物的靈敏度而建立的檢測核酸結(jié)構(gòu)與功能的方法。分類l斑點雜交 用于基因組 DNA或RNA的分析lSouthern blot 用于基因組 DNA的分析lN

10、orthern blot 用于以知mRNA表達水平的分析l原位雜交 細胞內(nèi)雜交，用于DNA或RNA的分析Southern blotSouthern blot（1 1）概念 用轉(zhuǎn)膜法進行DNA雜交分析步驟l提取消化 提取基因組DNA并將其經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化成片段l電泳 將DNA片段在瓊脂糖凝膠中電泳變性使其成為單鏈l轉(zhuǎn)膜 將硝酸纖維素（nitrocellulose,NC）膜放在膠上，上面放吸水紙，利用毛細作用使膠中DNA片段轉(zhuǎn)移到NC膜上l雜交 此雜交膜在雜交 液中與探針雜交l顯影 用放射自顯影顯示出雜交分子帶Southern blot （2） 重物重物吸水紙吸水紙濾紙凝膠緩沖液Northern

11、 blotNorthern blot概念 用轉(zhuǎn)膜法進行RNA雜交分析步驟l提取 總RNA的提取l電泳 將RNA片段在瓊脂糖凝膠中電泳變性，防止發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)形成l轉(zhuǎn)膜 NC膜放在膠上，上面放吸水紙，利用毛細作用使膠中RNA片段轉(zhuǎn)移到NC膜上l雜交 此雜交膜在雜交 液中與DNA探針雜交l顯影 用放射自顯影顯示出雜交分子帶l注意 所用試劑均用0.1% DEPC水配制l注意 所有器具均需高溫處理斑點雜交斑點雜交（dot hybridization technique ）概念 核酸與探針直接在NC膜上雜交的方法步驟l提取 提取DNA或RNA樣品l點樣 樣品點在NC膜上， 烘烤使其固定在膜上l雜交 將膜、探

12、針、雜交液封入雜交袋中，雜交l顯影 用放射自顯影顯示出雜交分子點原位雜交原位雜交（in situ hybridization）概念 保持細胞形態(tài)，在細胞內(nèi)進行核酸雜交步驟l固定標本 涂片或組織切片置微波爐中照射，固定標本 l雜交 將探針（常用生物素標記法）復蓋在標本上，加入雜交液，雜交l顯色 載玻片放入緩沖液中，加入底物，顯色。l攝影 顯微鏡下觀察結(jié)果，攝影核酸雜交技術(shù)與基因診斷核酸雜交技術(shù)與基因診斷（ The hybridization technique of nucleic acid and diagnosis ）限制性內(nèi)切酶酶譜分析法l概念 利用限制性內(nèi)切酶和特異性DNA探針來檢測是否

13、存在基因突變l原理 當待測DNA序列發(fā)生突變時會導致某些限制性內(nèi)切酶位點的改變，其片段的長度與數(shù)量在電泳遷移率上會隨之改變。借此做出診斷l(xiāng)應用 檢測基因突變的位點與數(shù)量核酸雜交技術(shù)與基因診斷核酸雜交技術(shù)與基因診斷（ The hybridization technique of nucleic acid and diagnosis ）DNA限制性片段多態(tài)性分析（RELP）l概念 DNA多態(tài)性發(fā)生在限制性內(nèi)切酶識別位點上，酶解該片段會產(chǎn)生長度不同的片段，此片段為遺傳標志，檢測致病基因的帶者l原理 在人類基因組中，平均約200對堿基可發(fā)生一對突變（稱為中性突變），中性突變導致個體間的差異，叫DNA多

14、態(tài)性。在某家族中，致病基因與特異多態(tài)性緊密連鎖，此多態(tài)性為遺傳標志l應用 遺傳病的基因診斷核酸雜交技術(shù)與基因診斷核酸雜交技術(shù)與基因診斷（ The hybridization technique of nucleic acid and diagnosis ）等位基因特異寡核苷酸探針雜交l概念 根據(jù)已知遺傳病基因突變的核苷酸序列，人工合成寡核苷酸探針（突變與正常），分別與受檢者雜交，判斷其為突變的純合子、雜合子、新的突變類型或正常l原理 若受檢者只與突變探針雜交，則為突變純合子；若與兩種探針雜交，則為突變雜合子；若與正常探針雜交，則不存在該突變基因；若與兩者均不雜交，提示新的突變。聚合酶鏈反應聚合

15、酶鏈反應PCRPCR（polymerase chain reaction，PCR）概念 用于擴增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段原理 以待擴增的DNA為模板，以一對與模板5和3末端互補的寡核苷酸片段為引屋，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復制的機制，合成新鏈，反復重復這一過程，可使目的DNA片段得到擴增。基本步驟 l變性 95 使模板DNA完全變性為單鏈l應退火 較Tm低5，使引物與模板DNA退火結(jié)合l延伸 72 DNA聚合酶以dNTP為底物催化DNA的合成反應PCRPCR與基因診斷與基因診斷（PCR and gene diagnosis）目的基因的克?。０鍨閏DNA或基因組）l利用特異性

16、引物獲得已知的目的基因l利用簡并引物獲得同源性的基因片段l利用隨機引物隨機克隆基因基因的體外突變l可以隨機設計引物在體外進行基因的嵌合、缺失、點突變等改造DNA的微量分析l病原微生物的微量檢測l突變基因的篩選l法醫(yī)學的鑒定lDNA序列分析PCRPCR引物的設計引物的設計（ The design of PCR primer）長度 以擴增片段而定，一般1530個堿基，引物越長，特異性越強堿基 GC含量以45%55%為佳，GC應隨機分布Tm值 Tm值應底于延長溫度引物內(nèi)和引物間不宜形成二級結(jié)構(gòu)特異性 特異性強，不擴增目的基因以外的DNAPCRPCR擴增條件的設計擴增條件的設計（The design

17、of PCR extension condition）退火 一般Tm5，與目的基因長度有關(guān)，目的基因短，退火溫度 可底，時間可短。退火溫度 太高，有時會得不擴增產(chǎn)物，退火溫度 太低，容易得不到產(chǎn)物延伸 與目的基因長度有關(guān)，一般認為DNA聚合酶的聚合速度1000bp/min.時間太短，會得不到產(chǎn)物，時間太長，會出現(xiàn)Smear.擴增次數(shù) 擴增次數(shù)太少，擴增量不足，擴增次數(shù)太多，提高靈敏度，易造成非特異性擴增，會出現(xiàn)Smear.引物 引物過多，易出現(xiàn)雙引物聚合，電泳出現(xiàn)小于100bp的帶，引物過少，擴增量少。PCRPCR技術(shù)探討技術(shù)探討（The investigation of PCR techni

18、que） Smear 現(xiàn)象l原因原因酶量過多變性時間過短變性溫度過低dNTP量過少延伸時間過長循環(huán)次數(shù)過多模板量過多l(xiāng)建議建議0.5U遞減變性時間5秒遞增變性溫度0.5遞增50um遞增10秒遞減2個循環(huán)遞減模板量20%遞減PCRPCR技術(shù)探討技術(shù)探討（The investigation of PCR technique 非特異性擴增l原因原因引物濃度過高引物設計不合理酶量過多循環(huán)次數(shù)過多變性溫度過低延伸時間過短模板量過多l(xiāng)建議建議0.1um遞減改變引物位置與長度0.5U遞減2個循環(huán)遞減2遞增10秒遞增酶量20%遞減單鏈構(gòu)象多態(tài)分析技術(shù)單鏈構(gòu)象多態(tài)分析技術(shù)（The analysis techni

19、que of single strand conformational polymorphism ）概念 由DNA單鏈構(gòu)象所決定遷移率的電泳技術(shù)原理 在中性聚丙烯凝膠電泳時，DNA單鏈的遷移率除與長短有關(guān)，更取決于DNA自身折疊形成的由堿基順序決定的構(gòu)象，甚至單個堿基不同，遷移率就不同，因此檢測出含有基因突變的DNA或RNA片段 特點 這項技術(shù)具有簡便、快速、敏感、和經(jīng)濟等特點，適用于大樣本基因變異的篩查SSCPSSCP技術(shù)的應用技術(shù)的應用（The application of SSCP technique）適用于大樣本基因變異的篩查用于癌基因和抗癌基因突變的檢測DNA多態(tài)性分析復等位基因的分

20、析遺傳病的致病基因分析基因制圖SSCPSSCP技術(shù)流程技術(shù)流程（The procedure of SSCP technique）總RNA的提取逆轉(zhuǎn)錄合成cDNAPCR特異擴增目的基因目的基因變性在中性聚丙烯凝膠電泳凝膠的處理l同位素標記的樣品放射自顯影l(fā)銀染法或溴化乙錠（EB）染色參考條件參考條件（reference condition）長度 目的基因小于400bp分離單鏈效果好，突變檢出率高溫度 溫度高，不利于分離突變DNA，最好采用恒溫4或2026交聯(lián)度 低交聯(lián)度、大孔徑的聚丙烯酰胺凝膠有利于DNA互補鏈的分離，對DNA構(gòu)型變化敏感，建議用12%C甘油 是核酸的弱變性劑，能部分打開DNA單

21、鏈的折疊結(jié)構(gòu)，但濃度過大，降低遷移率，建議用510%的甘油電壓 影響分析結(jié)果，建議先用低電壓，后加大電壓的條件，分辨率高，電泳時間短SSCPSSCP正常結(jié)果分析正常結(jié)果分析（The analysis of SSCP normal result）位置 DNA單鏈在電泳中的位置無法預先確定，應設立未變性樣品對照條帶數(shù) 由于單鏈構(gòu)象的多樣性，中間狀態(tài)的存在，可以出現(xiàn)多條單鏈突變條帶 不一定在兩條單鏈都表現(xiàn)出，有時可見于一條單鏈上假陰性 用該法不能證明無突變發(fā)生，若無突變發(fā)生可以改變電泳條件假陽性 篩選出泳動變位，不能完全排除假陽性核酸序列分析核酸序列分析(The sequence analysis

22、of nucleic acid)DNA末斷合成終止法l原理 在待測DNA的3末端人工合成引物，在DNA聚合酶的作用下，復制鏈延長，在ddNTP(2,3雙脫氧核糖核苷三磷酸)存在下，復制延長隨機受阻，形成分子量大小不等的片段。電泳分離，自顯影，讀分析堿基片段l步驟 l 標記 將單鏈模板DNA分成4份，每一管加入32PdATP、dNTP、引物和酶，每管還加入4種ddNTP中的一種，進行反應l電泳 聚丙烯酰胺凝膠高壓（1600V）電泳，復制延長隨機受阻，可形成一個核苷酸的差異的大小不等的片段l顯影 電泳后干燥，對X光片進行放射自顯影 l圖譜 自下往上讀，得到5-3的堿基序列，其互補鏈是待測的DNA的

23、3-5堿基序列核酸序列分析核酸序列分析(The sequence analysis of nucleic acid)復制模板l基因工程 M13是單鏈噬菌體，轉(zhuǎn)染宿主菌復制為雙鏈增殖，又以單鏈透出菌體。把待測DNA重組插入雙鏈M13復制型DNA中，經(jīng)培養(yǎng)擴增，可分離得到單鏈M13DNA，即復制模板lcDNA 提取樣品總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為DNA，特異擴增目的基因，純化，即復制模板基因工程基因工程（gene engineering）概述 基因工程又稱重組體DNA技術(shù)，是指在體外將不同來源的DNA分子進行重新組合，并使它們在適當?shù)乃拗骷毎袑崿F(xiàn)增殖表達的遺傳操作主要步驟l目的基因的獲取l載體的選擇與構(gòu)建l復制子的形成l轉(zhuǎn)化l篩選復制子l表達外源基因復制子復制子（replicon）概念 即重組DNA，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)與載體DNA結(jié)合成具有自我復制能力的DNA分子構(gòu)建方式 l粘性末端連接 l平端連接l同聚物加尾連接 同聚物加尾連接同聚物加尾連接（The ligation of adding- tail polymer）概念 利用同聚物序列，如多聚A與多聚T之間的退火作用完成連接。步驟 l粘性末端 在末端轉(zhuǎn)移酶的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列，制造粘性末端l連接 在連接酶作用下