維生素b1細菌總數(shù)的測定

1、維生素B1細菌總數(shù)的測定班級：生物制藥1311組別：第2組一、細菌數(shù)測定的基本概念藥品細菌數(shù)測定是微生物的定量檢查，是用來判斷藥品被細菌污染程度和衛(wèi)生質量評價的重要指標，也是檢測藥品質量的重要指標之一。細菌計數(shù)是指在一定條件下（如需氧情況、營養(yǎng)條件、pH 、培養(yǎng)溫度和時間等）每1g、lml、l0cm2 供試品液經培養(yǎng)后所生長的菌落數(shù)。所謂一定條件是按我國藥典規(guī)定，在需氧條件下，3035，一般培養(yǎng)48h,在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上生長的細菌菌落數(shù)。細菌數(shù)的測定方法有多種：平板法、薄膜過濾法、涂抹法。藥品細菌數(shù)測定是活菌計數(shù)，最常用的平板法是以平板菌落計數(shù)為依據(jù)，即每個菌落代表個菌細胞，但有的菌落也可

2、能是多個菌細胞形成，如雙球菌、四聯(lián)球菌、八疊球菌、葡萄球菌等，很可能是多個菌細胞在一起。故準確地說，細菌數(shù)測定值實際上是菌落形成單位數(shù)( CFU)。 平板法菌落計數(shù)法，是受一定條件的限制：如供試液是否均質，供試液中的細菌是否充分分散；培養(yǎng)基的質量、培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)時間的影響；有繁殖能力的菌細胞才能形成菌落，死菌及某此受損傷的細菌或營養(yǎng)要求苛刻的細菌在規(guī)定的培養(yǎng)基上不能生長，因而不被計數(shù)。在試驗操作中應考慮到這此問題。二、設施、設備、儀器及器皿1、設施 細菌數(shù)測定全過程應嚴格遵守無菌操作，在環(huán)境潔凈凈度l0000級和局部潔凈度100 級單向流空氣區(qū)域內進行，以防止再污染。2、設備、儀器 恒溫培養(yǎng)箱

3、（3035）、微波爐、勻漿儀（400010000r / min ）、康氏振蕩器、恒溫水浴、電熱干燥箱（250300 ）、電冰箱、空調、高壓蒸汽滅菌器（使用時要進行滅菌效果驗證并應定期請有關部門檢定）菌落計數(shù)器、顯微鏡（1500X）、電子天平（感量0.1g）、pH 值系列比色計、全封閉可拆卸或開放式的薄膜過濾器。3、器皿 錐形瓶（250300ml ）、培養(yǎng)皿（9cm）、量筒（100ml）、試管（1818mm）、刻度吸管（l ml , 10ml）、載玻片、玻璃或搪瓷、不銹鋼消毒缸（帶蓋）。玻璃器皿用前應洗滌干凈，無殘留抗菌物質。吸管上端距0 .5 cm 處塞入約2 cm 左右的適當疏松棉花，裝入吸

4、管筒內或牛皮紙口袋中。錐形瓶、量筒、試管塞（硅氟塑料塞），再用牛皮紙包扎。使用的器皿應采用經驗證合格的方法進行滅菌。4、用具 大、小橡皮乳頭（置干凈帶蓋的容器中并應定期用5%來蘇爾溶液浸泡），無菌衣、帽、口罩、手套（洗凈后用布袋或牛皮紙包嚴）滅菌，備用。也可使用一次性無菌衣、帽、口罩。接種環(huán)(白依金或鎳鉻合金）、乙醇（酒精）燈、乙醇棉球或碘伏錦球、滅菌剪刀、鑷子或滅菌的手術刀、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號筆等。5、培養(yǎng)基、稀釋劑 除另有規(guī)定外一般使用營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基, 可按處方配制亦可采用干燥脫水培養(yǎng)基。主要稀釋劑有0. 9無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液（供試品稀釋用），0.9%無菌氯化鈉溶液（

5、對照菌稀釋用）。三、檢驗方法1、試驗前的準備1）、將試驗用滅菌的器皿、稀釋劑及供試品外包裝去掉，內包裝消毒后移至無菌室內。每次試驗所用物品必須事先計劃周密，準備足夠用量，避免操作中出入操作間。2）、開啟無菌室紫外線殺菌燈和空氣過濾裝置并使其工作30min 。3）、操作人員用肥皂洗手，進入緩沖問，換上工作鞋。再消毒液洗手，穿戴無菌衣、帽、口罩、手套。4）、用碘伏棉球或乙醇棉球擦拭供試品瓶、盒、袋等的開口處周圍，待干后，用滅菌的手術剪刀將供試品啟封。2、檢查方法1）、供試液的制備：2）、供試液的稀釋（l0 倍遞增稀釋法）：根據(jù)微生物限度要求或對供試品污染的程度估計，選擇適宜的、連續(xù)23個稀釋級的供

6、試液。用1 ml 滅菌吸管吸取1 ：10供試液lml，沿管壁徐徐注入裝有9ml稀釋液的試管中，（注意吸管尖不要觸及管內稀釋液），搖勻制備成l : l 00的供試液，另取l 支吸管同法操作制備1 : 1000 的供試液.3）、注皿：分別用滅菌吸管吸取不同稀釋級供試液各lml ，注入平皿中，每個稀釋級23個平皿，注入溶化冷卻約45的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基1517ml，快速轉動平皿，使供試液與培養(yǎng)基混勻，放置，待凝，倒置培養(yǎng)。除另有規(guī)定外，一般在3035 培養(yǎng)48h 。若污染細菌生長緩慢可延長培養(yǎng)時間。4）、陰性對照試驗： 為確定試驗全過程的無菌性（包括稀釋劑、玻璃器皿等）應做陰性對照試驗。試驗方法：取試驗

7、用的稀釋劑1 ml ，置無菌平皿中，每次試驗做2 個平皿，按上述細菌計數(shù)方法進行操作陰性對照平板不得有菌生長。5）、菌落計數(shù)： 從平板的背面直接以肉眼用標記筆點計，以透視光襯以暗色背景，仔細觀察，計數(shù)。必要時借助于放大鏡觀察。點計菌落數(shù)后，計算稀釋級的平均菌落數(shù)，若相同釋級的兩個平板的菌落數(shù)平均數(shù)不小于15 ，則兩平板菌落數(shù)不能相差l 倍或以上。 細菌菌落形態(tài)特征：常為白色、灰白色或灰色，亦有淡褐色、淡黃色、紅色（如培養(yǎng)基中加人0 . 1%TTC試劑），菌落邊緣整齊或不整齊，有放射狀、樹枝狀、鋸齒狀、卷發(fā)狀菌落表而有光滑、粗糙、皺折、突起或扁平，菌落大小差別很大，同一平板上可出現(xiàn)針尖大小至大于

8、10mm 菌落，外觀多樣，小而突起或大而扁平，或石霧狀，不規(guī)則。 一般營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細菌計數(shù)；虎紅培養(yǎng)基用于霉菌及酵母菌計數(shù)。 3、菌落報告規(guī)則 宜選取細菌平均菌落數(shù)在30300之間的稀釋級，作為菌數(shù)報告的依據(jù)。1）、當僅有1個稀釋級的菌落數(shù)符合上述規(guī)定，以該級的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告菌數(shù)（見表9.1.1 例l ) 2)、 當同時有2 個稀釋級的菌落數(shù)符合上述規(guī)定時，計算二稀釋級的菌落數(shù)比值（高稀釋級除以低稀釋級的比值），若二者比值不大于2 ，以兩稀釋級的菌落平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告菌數(shù)；若大于2 ，但不超過5時，以低稀釋級的菌落平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)（見表9.1.1例2 、例3

9、 ) 3) 、當二者比值大于5 ，或高稀釋級的菌落數(shù)大于或等于低稀釋級的菌落數(shù)等異常情況時，應查明原因再行檢查，必要時，應進行方法的重新驗證（見表9.1.1 例4 ) 4）、當各稀釋級的平均菌落數(shù)均小于30，以最低稀釋級的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)（見表9.1.1 例5 ) 5）、如各稀釋級的平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均菌落數(shù)小于l 時，以1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)4、結果判斷1）、在進行菌落汁數(shù)時，應仔細觀察。勿漏計細小的、瓊脂內和平皿邊緣生長的菌落，同時應注意細菌菌落與供試品中顆粒、沉淀物、氣泡等的鑒別。必要時用放大鏡或低倍顯微鏡直接觀察或挑取可疑物

10、涂片鏡檢。如仍難區(qū)別，可延長培養(yǎng)時間57天，細菌菌落常會生長增大而加以鑒別。2）、如同一稀釋度二個平板菌落數(shù)超出一倍以上，不應計數(shù)，菌落蔓延成片也不應計數(shù)。3）、若供試品測定。其菌數(shù)結果超過標準限度規(guī)定時，應從同一批樣品中隨機取樣，獨立復試兩次，以3 次測定結果的平均值結果。根據(jù)點計結果和前數(shù)報告規(guī)則報告菌數(shù)，若供試品的細菌數(shù)超過規(guī)定的限值時，應從同一批樣品中隨機取樣、獨立復試兩次，以3 次測定結果的平均數(shù)報告。5、注意事項l）、在培養(yǎng)中一些生長鞭毛的細菌具有動力，可因培養(yǎng)基濕度過高給動力菌造成泳動的條件，促使一些菌落蔓延生長，干擾細菌計數(shù)。 可在培養(yǎng)基中加入0.001%TTC抑制菌落蔓延生長

11、或將已凝固的瓊脂平板開蓋，倒置100級層流下1 2h或置換經干熱滅菌的陶瓦蓋替代原平皿蓋，可降低培養(yǎng)皿內水分，減少菌落蔓延生長。2）、供試液中常會有不溶性顆?；虺恋砦锎嬖冢袝r很難與菌落區(qū)分，必要時可使用放大鏡或顯微鏡進行觀察，如仍難區(qū)分，可延長培養(yǎng)時間或在未加TTC的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上加入0.001%TTC510ml，30min后菌落即染成深紅色可與其他有形物進行鑒別。3）、供試品檢驗全過程必須符合無菌技術要求。4）、在做10倍遞增稀釋時，每一稀釋級應換l 支吸管，吸管插入稀釋液內不低于2 . 5cm ,反復沖洗數(shù)次，吸液高于吸管上部刻度少許，然后提起吸管貼于容器內壁吸取1cm?？拷好婀鼙冢ǖ鸾佑|液面），緩慢地吹出全部供試液至