電泳和色譜分離技術應用ppt課件

1、制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春高等制藥分離工程高等制藥分離工程第6章蒸發(fā)電泳分別技術電泳分別技術講授人講授人: :李彩虹李彩虹內蒙古工業(yè)大學內蒙古工業(yè)大學制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春高等制藥分離工程高等制藥分離工程概述過程特點第一節(jié)電泳根本概念第一節(jié)電泳根本概念 1、電泳是指帶電荷的供試品、電泳是指帶電荷的供試品(蛋白質、核甘酸等蛋白質、核甘酸等)在惰性在惰性支持介質中支持介質中(如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺

2、凝膠等胺凝膠等)在電場作用下向其對應的電極方向按各自的速在電場作用下向其對應的電極方向按各自的速度進展泳動，使組分分別成狹窄區(qū)帶，用適宜的檢測方度進展泳動，使組分分別成狹窄區(qū)帶，用適宜的檢測方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計算其百分含量的方法。電泳法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計算其百分含量的方法。電泳技術是實驗室中分析、鑒定和分別技術之一。技術是實驗室中分析、鑒定和分別技術之一。制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春高等制藥分離工程高等制藥分離工程概述過程特點第一節(jié)電泳根本概念第一節(jié)電泳根本概念2、電泳分類：、電泳分類：制作者：黃德春制作者：黃德春

3、制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春高等制藥分離工程高等制藥分離工程概述過程特點第二節(jié)第二節(jié) 電泳分別根本原理電泳分別根本原理 帶電粒子在電場中產(chǎn)生定向遷移，引起其遷移所受力帶電粒子在電場中產(chǎn)生定向遷移，引起其遷移所受力F)F)與電場強度與電場強度(E)(E)和粒子所帶凈電荷和粒子所帶凈電荷Z)Z)成正比成正比: :粒子在電場中所受力與溶液黏度、分子半徑、及穩(wěn)態(tài)下粒子在電場中所受力與溶液黏度、分子半徑、及穩(wěn)態(tài)下挪動速度有關挪動速度有關ZEFrvF6Evu/rZu6制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春

4、高等制藥分離工程高等制藥分離工程n各種不同分子量的蛋白質在電場內遷移速率與它的凈電荷數(shù)成正比，而與其分子半徑及溶液黏度成反比。n實驗證明，蛋白質的電泳遷移速率與蛋白質分子量的對數(shù)成線性關系制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春高等制藥分離工程高等制藥分離工程n根據(jù)此性質，可對具有一樣電荷，不同分子量的蛋白質進展分別。制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春高等制藥分離工程高等制藥分離工程電泳技術分類電泳技術分類n影響電泳遷移率的要素n n電場強度。電場強度是指單位長度(cm)的

5、電位降也稱電勢梯度。根據(jù)電場強度不同，將電泳分為常壓電泳(2-10V/cm)和高壓電泳(20-200V/cm)。電場強度高，帶電質點的遷移率加速，因此省時，但會產(chǎn)生大量熱量。n 制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春高等制藥分離工程高等制藥分離工程n溶液的pH值。溶液的pH值決議被分別物質的解離程度和質點的帶電性質及所帶凈電荷量。n對于帶有兩性基團的電解質，溶液存在一pH值，此時，溶液所帶正負電荷相等，即分子的凈電荷等于零，此時，在電場中不再挪動，這一pH值稱為電解質的等電點isoelectric point, PI)。n假設溶液pH

6、值處于等電點酸側，即pHp I，那么蛋白質帶正電荷，在電場中向負極挪動；n假設溶液pH值處于等電點堿側，即pHpI，那么蛋內質帶負電荷,向正極挪動。溶液的pH值離pI越遠，質點所帶凈電荷越多，電泳遷移率越大。制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春高等制藥分離工程高等制藥分離工程n 溶液的離子強度n一方面，電泳液中的離子濃度添加時會引起質點遷移率的降低。n帶電質點吸引相反電荷的離子聚集其周圍，構成一個與運動質點電荷相反的離子氛(ionic atmosphere),離子氛不僅降低質點的帶電量，同時添加質點前移的阻力，甚至使其不能泳動。n另

7、一方面，離子濃度過低，會降低緩沖液的總濃度及緩沖容量，不易維持溶液的pH值，影響n質點的帶電量，改動泳動速度。制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春高等制藥分離工程高等制藥分離工程n電滲。在電場作用下液體對于固體支持物的相對挪動稱為電滲(electroosmosis)。由于電滲的影響，質點遷移的表觀速度不同于其固有速度。n因固體支持物多孔，且?guī)в锌山怆x的化學基團，因此常吸附溶液中的正離子或負離子，使溶液相對帶負電或正電。如以濾紙作支持物時，紙上纖維素吸附OH-帶負電荷，而與紙接觸的水溶液因產(chǎn)生H3O+，帶正電荷移向負極，假設質點原來在

8、電場中移向負極，結果質點的表觀速度比其固有速度要快；假設質點原來移向正極，表觀速度比其固有速度要慢。因此應盡能夠選擇低電滲作用的支持物以減少電滲的影響。制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春高等制藥分離工程高等制藥分離工程n電泳的技術問題和對策：n影響遷移速率的主要要素1各組分的分子凈電荷數(shù);(2)分子量;(3)電泳系統(tǒng)介質的有效黏滯度。n1普通控制溶液pH4.5-9.5范圍內。n2選擇適當?shù)木彌_系統(tǒng)。n3外表活性劑n4控制電泳系統(tǒng)介質的有效黏滯度制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作

9、者：黃德春高等制藥分離工程高等制藥分離工程n5電泳過程的產(chǎn)熱問題nA、蛋白量變性;B、引起區(qū)帶分散，降低分辨率。n最常采用的方法是將電泳產(chǎn)生的熱量從電泳系統(tǒng)中移出，堅持電泳溫度恒定。IEW KIW/2制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春高等制藥分離工程高等制藥分離工程概述過程特點第第11章章 色譜分別過程色譜分別過程色譜法指多種成分的混合物，由于在流動相和固定相中有色譜法指多種成分的混合物，由于在流動相和固定相中有不同的分配，在流動過程中，經(jīng)多次分配后而獲得分別。不同的分配，在流動過程中，經(jīng)多次分配后而獲得分別。同其他傳統(tǒng)分別純化方

10、法相比，色譜分別過程具有如下特同其他傳統(tǒng)分別純化方法相比，色譜分別過程具有如下特點。點。1、運用范圍廣、運用范圍廣2、分別效率高、分別效率高3、操作方式多樣、操作方式多樣4、高靈敏度在線檢測、高靈敏度在線檢測制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春高等制藥分離工程高等制藥分離工程概述過程特點色譜分別過程的根本原理色譜分別過程的根本原理 色譜分別過程的本質是溶質在不互溶的固定相和色譜分別過程的本質是溶質在不互溶的固定相和流動相之間進展的一種延續(xù)多次的交換過程，它流動相之間進展的一種延續(xù)多次的交換過程，它借各組分在兩相間的分配系數(shù)、吸附才干

11、、親和借各組分在兩相間的分配系數(shù)、吸附才干、親和力等差別而使不同的溶質分別力等差別而使不同的溶質分別 。即混合物中各。即混合物中各個組分按其在兩相間分配系數(shù)的不同先后流出色個組分按其在兩相間分配系數(shù)的不同先后流出色譜柱而得到分別。譜柱而得到分別。制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春高等制藥分離工程高等制藥分離工程制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春高等制藥分離工程高等制藥分離工程概述過程特點 固定相固定相 色譜柱填料分為球形顆粒填料和不規(guī)那么外形顆粒色譜柱填料分為球形顆粒

12、填料和不規(guī)那么外形顆粒填料。具有較高的機械強度，不易破碎，柱的填填料。具有較高的機械強度，不易破碎，柱的填裝注重性好，并可添加樣品在柱中的浸透性。裝注重性好，并可添加樣品在柱中的浸透性。色譜分別過程常用柱填料有以下幾種。色譜分別過程常用柱填料有以下幾種。1硅膠衍生的固定相硅膠衍生的固定相;2活性炭活性炭;3離子離子交換樹脂交換樹脂;4大孔吸附樹脂大孔吸附樹脂;5凝膠凝膠;6手性固定相手性固定相. 制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春高等制藥分離工程高等制藥分離工程概述過程特點色譜柱及柱技術色譜柱及柱技術 色譜柱是色譜技術的中心，色譜

13、柱是色譜技術的中心， 色譜柱的性能依賴于三個要素：色譜柱的性能依賴于三個要素：色譜柱填充技術、柱設計和消費。色譜柱填充技術、柱設計和消費。1色譜柱填裝方法色譜柱填裝方法制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春高等制藥分離工程高等制藥分離工程概述過程特點2色譜柱設計色譜柱設計以使被分別物質以以使被分別物質以“面進樣而不是面進樣而不是“點進樣的方點進樣的方式分布在柱頭截面上，構成平整的活塞流，減少式分布在柱頭截面上，構成平整的活塞流，減少譜帶擴張。譜帶擴張。 制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德

14、春制作者：黃德春高等制藥分離工程高等制藥分離工程概述過程特點 色譜的分類色譜的分類 1 1、按兩相形狀分類、按兩相形狀分類按流動相形狀分類按流動相形狀分類氣相色譜氣相色譜GC); GC); 液相色譜液相色譜LC);LC);超臨界流超臨界流體色譜體色譜SFC)SFC)。按固定相形狀分類按固定相形狀分類氣氣- -固色譜固色譜GSC);GSC);氣氣- -液色譜液色譜GLC)GLC)液液- -固色譜固色譜LSC);LSC);液液- -液色譜液色譜LLCLLC制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春高等制藥分離工程高等制藥分離工程概述過程特點

15、色譜的分類色譜的分類 2 2、按處置量分類、按處置量分類根據(jù)分別樣品量的不同，以分別純化為目的根據(jù)分別樣品量的不同，以分別純化為目的的色譜可分為：半制備的色譜可分為：半制備semi-preparativesemi-preparative，微克級至克級、大規(guī)模微克級至克級、大規(guī)模Large scaleLarge scale，克級至千克級、消費型克級至千克級、消費型 industrial industrial scale or processscale or process，克級至千克級幾種類，克級至千克級幾種類型色譜。型色譜。制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春

16、制作者：黃德春制作者：黃德春高等制藥分離工程高等制藥分離工程概述過程特點 色譜的分類色譜的分類 3 3、按分別機制分類、按分別機制分類分子排阻色譜或凝膠過濾色譜分子排阻色譜或凝膠過濾色譜size size exclusion chromatographyexclusion chromatography，SECSEC或或gel gel filtration chromatographyfiltration chromatography，GCGC。離子交換色譜離子交換色譜ion exchange ion exchange chromatographychromatography，IECIEC。制作

17、者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春高等制藥分離工程高等制藥分離工程概述過程特點 色譜的分類色譜的分類 3 3、按分別機制分類、按分別機制分類疏水作用色譜疏水作用色譜hydrophobic hydrophobic interaction chromatographyinteraction chromatography，HICHIC。親和色譜親和色譜affinity chromatographyaffinity chromatography，ACAC。正相正相/ /反相色譜反相色譜normal/reversed phase normal/

18、reversed phase chromatographychromatography，N/R PCN/R PC制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春高等制藥分離工程高等制藥分離工程概述過程特點 色譜的分類色譜的分類 3 3、按運用目的分類、按運用目的分類分析用色譜分析用色譜制備用色譜制備用色譜流程用色譜流程用色譜制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春高等制藥分離工程高等制藥分離工程概述過程特點 色譜分別過程根底實際色譜分別過程根底實際 保管值、分別度和柱效應保管值、分別度和

19、柱效應1 1保管值保管值 保管值通常以保管時間保管值通常以保管時間 及容量因子及容量因子 來表示。來表示。 保管值是色譜過程的根本熱力學參數(shù)之一。保管值是色譜過程的根本熱力學參數(shù)之一。它也是色譜定性的根本根據(jù)。它也是色譜定性的根本根據(jù)。 從進樣開場到柱后出現(xiàn)樣品的濃度極大值從進樣開場到柱后出現(xiàn)樣品的濃度極大值所需的時間所需的時間為保管時間，與固定相和流動相的性質、柱為保管時間，與固定相和流動相的性質、柱溫、流速、柱體積等要素有關。溫、流速、柱體積等要素有關。 Rtk制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春高等制藥分離工程高等制藥分離工程

20、概述過程特點 色譜分別過程根底實際色譜分別過程根底實際容量因子指在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動相容量因子指在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動相之間到達平衡時的質量之比。之間到達平衡時的質量之比。它與柱尺寸及流速無關，而與溶質在兩相間的分配性質、它與柱尺寸及流速無關，而與溶質在兩相間的分配性質、柱溫及固定相和流動相之體積比有關。柱溫及固定相和流動相之體積比有關。smqkq 溶質在固定相的量溶質在流動相的量mmrtttk制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春高等制藥分離工程高等制藥分離工程概述過程特點 色譜分別過程根底實際色譜

21、分別過程根底實際 保管值、分別度和柱效應保管值、分別度和柱效應1 1分別度分別度 相鄰色譜峰峰頂之間的間隔除以兩色譜峰相鄰色譜峰峰頂之間的間隔除以兩色譜峰的平均寬度。的平均寬度。 當當R=1R=1時，兩色譜峰的分別程度可達時，兩色譜峰的分別程度可達94%94%；當；當R=1.5R=1.5時，兩個色譜峰已完全分別。時，兩個色譜峰已完全分別。 21121221/2RRRsbbbbtttR制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春高等制藥分離工程高等制藥分離工程概述過程特點色譜分別過程根底實際色譜分別過程根底實際 保管值、分別度和柱效應保管值、

22、分別度和柱效應1 1柱效應：用塔板高度和塔板數(shù)衡量色柱效應：用塔板高度和塔板數(shù)衡量色譜柱效應譜柱效應 。 有效塔板數(shù)和有效塔板高度有效塔板數(shù)和有效塔板高度 21/ 25.54RtNLHN21kNNk有效21kHHk有效制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春高等制藥分離工程高等制藥分離工程概述過程特點色譜分別過程根底實際色譜分別過程根底實際 色譜實際模型色譜實際模型 1 1速度方程實際速度方程實際 A A、B B、C C分別代表渦流分散系數(shù)、分子分散分別代表渦流分散系數(shù)、分子分散項系數(shù)和傳質阻力項系項系數(shù)和傳質阻力項系2 2平衡色譜實際

23、平衡色譜實際假定在整個過程中，色譜柱中不存在傳質阻假定在整個過程中，色譜柱中不存在傳質阻力，溶質在固定相和流動相中分配平衡能力，溶質在固定相和流動相中分配平衡能瞬間完成。瞬間完成。CuuBAH/制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春高等制藥分離工程高等制藥分離工程概述過程特點色譜分別過程根底實際色譜分別過程根底實際 即在色譜柱內任何時辰和位置，溶質在固定即在色譜柱內任何時辰和位置，溶質在固定相和流動相中的濃度均符合等溫方程相和流動相中的濃度均符合等溫方程 由于忽略了非理想流動及各種傳質阻力的存由于忽略了非理想流動及各種傳質阻力的存在，

24、這個模型是比較粗略的。在，這個模型是比較粗略的。 smcf c制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春高等制藥分離工程高等制藥分離工程概述過程特點色譜分別過程根底實際色譜分別過程根底實際3塔板實際塔板實際 塔板實際將色譜過程比較為蒸餾過程，不同色譜柱塔板實際將色譜過程比較為蒸餾過程，不同色譜柱看成是由一系列實際塔板所組成。在一個實際板看成是由一系列實際塔板所組成。在一個實際板當量高度當量高度HETP的柱高內，溶質在兩相間到達一的柱高內，溶質在兩相間到達一次平衡。由塔板實際可計算實際塔板數(shù)及塔板高次平衡。由塔板實際可計算實際塔板數(shù)及塔板高

25、度度.但它是半閱歷式實際，不能提示色譜過程本但它是半閱歷式實際，不能提示色譜過程本質。質。制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春高等制藥分離工程高等制藥分離工程概述過程特點色譜分別過程根底實際色譜分別過程根底實際4軸向分散實際軸向分散實際 在色譜過程中，組分在流動相中的軸向分散是影響在色譜過程中，組分在流動相中的軸向分散是影響色譜區(qū)域譜帶擴張的主要要素，而有限的傳質速色譜區(qū)域譜帶擴張的主要要素，而有限的傳質速率對區(qū)域譜帶擴張沒有影響。軸向分散實際的根率對區(qū)域譜帶擴張沒有影響。軸向分散實際的根本方程為本方程為 軸向分散實際思索了溶質在流

26、動相和固定相間的軸向分散實際思索了溶質在流動相和固定相間的傳質速率及流動相的流動形狀，當傳質速率較快傳質速率及流動相的流動形狀，當傳質速率較快而軸向分散為區(qū)域擴張的主要要素時，該實際具而軸向分散為區(qū)域擴張的主要要素時，該實際具有較好的指點意義。有較好的指點意義。221mmscccDuzzt 軸制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春制作者：黃德春高等制藥分離工程高等制藥分離工程概述過程特點氣相色譜及其運用氣相色譜及其運用 氣相色譜儀氣相色譜儀以惰性氣體載氣作為流動相，以固定液或固體以惰性氣體載氣作為流動相，以固定液或固體填充劑作為固定相的色譜設備。處置的對象是低填充劑作為固定相的色譜設