絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備

1、任務(wù)一、SHMT的電泳制備方案的制定樊貝貝第二組生藥111120114231051、概念 中文簡(jiǎn)稱：“絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶” 英文名稱： Serine hydroxymethyltransferase 簡(jiǎn)介：它是酶促制備L-絲氨酸的關(guān)鍵酶，在四氫葉酸(THFA)、甲醛及磷酸吡哆醛(PLP)存在下催化甘氨酸生成L-絲氨酸。它的生理學(xué)功能是催化絲氨酸和甘氨酸之間可逆的互換。一、知識(shí)鏈接一、知識(shí)鏈接2、電泳方法根據(jù)支持物的不同，可以分為紙電泳，薄層電泳、薄膜電泳、凝膠電泳、等電聚焦電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳等。3、酶工程領(lǐng)域中采用較多的聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）4、影響電泳的因素： 電泳介質(zhì)的PH值

2、， 緩沖液的離子強(qiáng)度， 電場(chǎng)強(qiáng)度， 電滲現(xiàn)象。5、SHMT在光合組織中的生理作用 （1） 光合作用組織中線粒體GDCSHMT系統(tǒng)在Gly和Ser分解中起著重要作用（2） SHMT在非光合組織中的生理作用（3)SHMT在根瘤碳流動(dòng)中的作用（4）光呼吸SHMT影響植物對(duì)生物和非生物脅迫的抵抗能力6、SHMT的分離制備的方法電泳法（如：聚丙烯酰胺凝膠電泳、瓊脂糖凝膠電泳)定義：定義：利用溶液中帶有不同量的電荷的陽離子或陰離子，在外加電場(chǎng)中以不同的遷移速度向電極移動(dòng)，而達(dá)到分離目的的分析方法7、電泳作用：用于分離蛋白質(zhì)和寡核苷酸。 作用原理： 聚丙烯酰胺凝膠為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)。 8、電泳形式：

3、 （1）非變性聚丙烯酰胺凝膠 （2）SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE） 非變性聚丙烯酰胺凝膠，在電泳的過程中，蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)，并依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小、蛋白質(zhì)的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。 垂直板電泳槽示意圖垂直板電泳槽示意圖加樣加樣l聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠為載體的一種區(qū)帶電泳。該凝膠由丙烯酰胺Acr和交聯(lián)劑N，N甲叉雙丙烯聚酰胺Bis聚合而成。聚丙烯酰胺凝膠電泳利用電泳和分子篩的雙重作用分離物質(zhì)。lAcr和Bis單獨(dú)存在或混合在一起時(shí)是穩(wěn)定的，但在具有自由基團(tuán)體系時(shí)就能聚合。引發(fā)自由基團(tuán)的方法有化學(xué)法和光化學(xué)法兩種。二、實(shí)訓(xùn)原理二、實(shí)訓(xùn)原理l化學(xué)法的

4、引發(fā)劑是過硫酸胺Ap催化劑是四甲基乙二胺（TEMED）；光化學(xué)法是以光敏感物核黃素來代替過硫酸胺，在紫外光照射下引發(fā)自由基團(tuán)。采用不同濃度的Acr、Bis 、Ap、TEMED使之聚合，產(chǎn)生不同孔徑的凝膠。因此可按分離物質(zhì)的大小，形狀來選擇凝膠濃度。1、試劑l 分離膠緩沖液（TrisTris-HCL-HCL緩沖液 PH8.9）:取1mol/L鹽酸48mL，Tris 36.3g,用無離子水溶解后定容至100mL。l濃縮膠緩沖液（Tris-HCl緩沖液 PH6.7）:取1mol/L鹽酸48mL, Tris 5.98g,用無離子水溶解后定容至100mL。l電泳緩沖液（Tris-甘氨酸緩沖液PH8.3）

5、:稱取Tris 6g, 甘氨酸28.8g, 用無離子水溶解后定容至1L。用時(shí)稀釋10倍。l 30AcrBis貯存液：30g Acr,0.8g Bis, 用無離子水溶解后定容至100mL,不溶物過濾去除后置棕色瓶貯于冰箱。 lTEM10%過硫酸銨（新鮮配制）；25%蔗糖溶液；0.05%溴酚藍(lán)溶液；7%冰乙酸溶液。l染色液：稱取考馬斯亮藍(lán)R250 2.5g，冰乙酸92ml，甲醇454ml，加去離子水454 ml使其完全溶解，過濾ED；后置棕色瓶保存。l脫色液：取甲醇50ml，冰乙酸75ml，加蒸餾水至1000ml。 2、材料 SHMT標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)3、器材： 垂直板型電泳槽、天平、 直流穩(wěn)壓電源、 5

6、0或100l微量注射器、 玻璃板、水浴鍋、 染色槽、 燒杯、吸量管 膠頭滴管1 1、 安裝垂直板電泳槽安裝垂直板電泳槽 （1） 將密封用硅膠框放在平玻璃上，然后將凹型玻璃與平玻璃重疊； （2） 用手將兩塊玻璃板夾住放入電泳槽內(nèi)，玻璃室凹面朝外，插入斜插板； （3) 用蒸餾水試驗(yàn)封口處是否漏水。 2 2、制備凝膠板、制備凝膠板 （1） 分離膠制備： 取Acr-Bis儲(chǔ)備液 5.0mL, Tris-HCl緩沖液 PH8.9 2.5mL, 去離子水12.39mL, TEMED 0.02mL置于小燒杯中混勻，再加入10% 0.1mL過硫酸胺，用磁力攪拌器充分混勻2min。混合后的凝膠溶液，用細(xì)長頭的吸

7、管加至長、短玻璃板間的窄縫內(nèi)，加膠高度距樣品模板梳齒下緣約 1cm。 用吸管在凝膠表面沿短玻璃板邊緣輕輕加一層重蒸餾水（約34cm），用于隔絕空氣，使膠面平整。 分離膠凝固后，可看到水與凝固的膠面有折射率不同的界限。倒掉重蒸水，用濾紙吸去多余的水。 （2） 濃縮膠制備： 取Acr-Bis儲(chǔ)備液1.0mL， Tris-HCl 緩沖液（PH6.7）1.25mL，TEMED 0.01mL, 去離子水7.64mL，10% 過硫酸胺0.1mL，用磁力攪拌器充分混勻。 混合均勻后用細(xì)長頭的吸管將凝膠溶液加到長短玻璃板的窄縫內(nèi)（及分離膠上方），距短玻璃板上緣0.5cm處，輕輕加入樣品槽模板。待濃縮膠凝固后，

8、輕輕取出樣品模槽板。 用手夾住兩塊玻璃板，上提斜插板，使其松開，然后取下玻璃膠室去掉密封用膠框，用1%電泳緩沖液瓊脂膠密封底部，再將玻璃膠室凹面朝里置入電泳槽。 插入斜插板，將電泳緩沖液加至內(nèi)槽玻璃凹口以上，外槽緩沖液加到距平玻璃上沿3mm處。 3、加樣、加樣 （1) 各標(biāo)準(zhǔn)蛋白及待測(cè)蛋白都用樣品溶解液溶解，使?jié)舛葹?.51mg/mL，沸水浴加熱3分鐘，冷卻至室溫備用。 (2) 一般加樣體積為1015L（即210g蛋白質(zhì)）。如樣品較稀，可增加加樣體積。 (3)用微量注射器小心將樣品通過緩沖液加到凝膠凹形樣品槽底部，待所有凹形樣品槽內(nèi)都加了樣品，即可開始電泳4、電泳、電泳 （1）將直流穩(wěn)壓電泳儀

9、開關(guān)打開，開始時(shí)將電流調(diào)至10mA。待樣品進(jìn)入分離較時(shí)，將電流調(diào)至2030mA。 （2）當(dāng)藍(lán)色染料遷移至底部時(shí)，將電流調(diào)回到零，關(guān)閉電源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片輕輕將一塊玻璃撬開移去，在膠板一端切除一角作為標(biāo)記，將膠板移至大培養(yǎng)皿中染色。 5、染色、染色 將凝膠放入考馬斯亮藍(lán)R250染色液中，使染色液沒過膠板，染色30min左右。6、脫色、脫色 棄去染色液，將凝膠置于脫色液中，并經(jīng)常更換脫色液，直至背景藍(lán)色褪去。如用50水浴或脫色搖床，則可縮短脫色時(shí)間。脫色液經(jīng)活性炭脫色后，可反復(fù)使用。(1) Acr和Bis均為神經(jīng)毒劑，對(duì)皮膚有刺激作用，操作時(shí)應(yīng)戴手套和口罩，純化應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。(2) 玻璃板表面應(yīng)光滑潔凈，否則在電泳時(shí)會(huì)造成凝膠板與玻璃板之間產(chǎn)生氣泡。(3) 樣品槽模板梳齒應(yīng)平整光滑。(4) 用瓊脂封底及