細胞工程與食品產業(yè)

1、廣東藥學院食品科學學院廣東藥學院食品科學學院食品生物技術課件E-mail:z_c_ 手機手機鄭 傳傳 進進第六章細胞工程與食品產業(yè)第六章細胞工程與食品產業(yè)主要內容n細胞工程的概念、研究范疇細胞工程的概念、研究范疇n植物細胞培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)n動物細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)n細胞融合技術細胞融合技術n細胞拆合技術細胞拆合技術第一節(jié)、概述第一節(jié)、概述 利用細胞生物學和分子生物學技術，利用細胞生物學和分子生物學技術，應用工程學的方法，在細胞水平上研究改造應用工程學的方法，在細胞水平上研究改造生物遺傳特性和生物學特性，從而獲得特定生物遺傳特性和生物學特性，從而獲得特定的細胞、細胞產品

2、或新生物品種的一門綜合的細胞、細胞產品或新生物品種的一門綜合性科學技術。性科學技術。概念概念1 1 細胞工程的概念及研究范疇細胞工程的概念及研究范疇研究范疇研究范疇動物細胞與組織培養(yǎng)動物細胞與組織培養(yǎng)植物細胞與組織培養(yǎng)植物細胞與組織培養(yǎng)細胞融合細胞融合細胞核移植（細胞拆合）細胞核移植（細胞拆合）染色體工程染色體工程胚胎工程胚胎工程干細胞與組織工程干細胞與組織工程細胞生物反應器細胞生物反應器 1 1）植物細胞和組織培養(yǎng)技術）植物細胞和組織培養(yǎng)技術 2 2）動物細胞和組織培養(yǎng)技術）動物細胞和組織培養(yǎng)技術 3 3）細胞融合技術）細胞融合技術（體細胞雜交技術）（體細胞雜交技術） 4 4） 細胞拆合細胞

3、拆合核核移植技術移植技術5 5）染色體工程技術）染色體工程技術染色體工程是按人們的需要來添加、削減或染色體工程是按人們的需要來添加、削減或替換生物的染色體從而定向改變遺傳特性和選育替換生物的染色體從而定向改變遺傳特性和選育新品種的一種技術。主要分為動物染色體工程和新品種的一種技術。主要分為動物染色體工程和植物染色體工程植物染色體工程6 6）胚胎工程技術）胚胎工程技術7 7）干細胞和組織工程）干細胞和組織工程8 8）細胞培養(yǎng)生物反應器）細胞培養(yǎng)生物反應器2 2、植物細胞工程的應用、植物細胞工程的應用 紫杉醇紫杉醇(taxol)(taxol)是從紅是從紅豆杉屬豆杉屬(Taxus L.)(Taxus

4、 L.)植物中植物中分離出的一個具有獨特抗分離出的一個具有獨特抗腫瘤活性的二萜類化合物，腫瘤活性的二萜類化合物，現已應用于臨床治療卵巢現已應用于臨床治療卵巢癌和乳腺癌。癌和乳腺癌。三、動物細胞工程的應用三、動物細胞工程的應用1.1.在疫苗生在疫苗生產產上的上的應應用用 。 將將乙型肝炎表面抗原基因乙型肝炎表面抗原基因插插入哺乳入哺乳動動物物細細胞胞內內進進行高效表行高效表達達，已生，已生產產出乙型肝炎疫苗。出乙型肝炎疫苗。2. 2. 生生產單產單克隆抗體克隆抗體 單單克隆抗體可以克隆抗體可以檢測檢測出多出多種種病毒中非常病毒中非常細細微的微的株株間間差差異異，鑒鑒定定細細菌的菌的種種型和型和亞

5、種亞種。3.3.繁育繁育優(yōu)優(yōu)良品良品種種。 目前，人工受精、胚胎移植等技目前，人工受精、胚胎移植等技術術已廣泛已廣泛應應用用于畜牧于畜牧業(yè)業(yè)生生產產。4. 4. 在干在干擾擾素生素生產產上的上的應應用用 是指動物、植物和微生物細胞在體外無菌條是指動物、植物和微生物細胞在體外無菌條件下的生長、分裂和繁殖，并在培養(yǎng)過程中不再件下的生長、分裂和繁殖，并在培養(yǎng)過程中不再形成組織的一項技術。形成組織的一項技術。細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)第二節(jié)、植物細胞培養(yǎng)技術第二節(jié)、植物細胞培養(yǎng)技術一、一、 植物細胞工程的發(fā)展植物細胞工程的發(fā)展細胞學說細胞學說的創(chuàng)立：的創(chuàng)立：1838183818391839年間由年間由德國的植物

6、學家施萊登（德國的植物學家施萊登（SchleidenSchleiden）和）和動物學家施旺（動物學家施旺（SchwannSchwann）所提出）所提出, ,直到直到18185858年才較完善。年才較完善。 理論基礎和探索理論基礎和探索19021902年，德國著名植物生理學年，德國著名植物生理學家家Haberlandt, Haberlandt, 提出提出細胞全能性學細胞全能性學說說，并首次進行高等植物的細胞培養(yǎng)，并首次進行高等植物的細胞培養(yǎng)實驗，但細胞未能發(fā)生細胞分裂和增實驗，但細胞未能發(fā)生細胞分裂和增殖。殖。17561756年，年，MonceanMoncean首先發(fā)現植物首先發(fā)現植物在在受傷愈

7、合的組織皮層能產生芽受傷愈合的組織皮層能產生芽，因而預言這一途徑可以成為一種繁因而預言這一途徑可以成為一種繁殖方式殖方式培養(yǎng)技術建立培養(yǎng)技術建立植物細胞培養(yǎng)技術應用發(fā)展植物細胞培養(yǎng)技術應用發(fā)展20世紀世紀40年代：年代：J.Bonner 銀膠菊組織培養(yǎng)生產橡銀膠菊組織培養(yǎng)生產橡膠。膠。20世紀世紀70年代：植物細胞培養(yǎng)生產藥用成份。年代：植物細胞培養(yǎng)生產藥用成份。20世紀世紀80年代：年代：400多種植物，多種植物，600多種代謝產物。多種代謝產物。40多種植物次生代謝產物達到或超過植株產量。多種植物次生代謝產物達到或超過植株產量。20世紀世紀90年代：年代：1000多種植物。多種植物。 1.

8、首先，首先，要取材和除菌要取材和除菌。用一定的化學試劑對。用一定的化學試劑對材料進行嚴格的表面清洗、消毒。有時還要借助某材料進行嚴格的表面清洗、消毒。有時還要借助某些特定的酶，對材料進行預處理，以期得到分散生些特定的酶，對材料進行預處理，以期得到分散生長的細胞。長的細胞。 常用的消毒滅菌劑常用的消毒滅菌劑: :效果較好的有幾種化學試劑，效果較好的有幾種化學試劑，如如次氯酸鈣、次氯酸鈉和氯化汞次氯酸鈣、次氯酸鈉和氯化汞等。等。二、細胞培養(yǎng)一般步驟二、細胞培養(yǎng)一般步驟 2.其次，根據各類細胞的特點，配制細胞培其次，根據各類細胞的特點，配制細胞培養(yǎng)基，對培養(yǎng)基進行滅菌或除菌。采用無菌操作養(yǎng)基，對培養(yǎng)

9、基進行滅菌或除菌。采用無菌操作技術，將技術，將生物材料接種于培養(yǎng)基生物材料接種于培養(yǎng)基中。中。3. 最后，將接種后的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)室或培養(yǎng)箱最后，將接種后的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)室或培養(yǎng)箱中，中，提供各類細胞生長所需的最佳培養(yǎng)條件提供各類細胞生長所需的最佳培養(yǎng)條件。當。當細胞達到一定生物量時應及時收獲或傳代。細胞達到一定生物量時應及時收獲或傳代。 三三. .植物細胞培養(yǎng)基植物細胞培養(yǎng)基植物細胞的培養(yǎng)基植物細胞的培養(yǎng)基: :通常包括通常包括無機鹽、碳源、無機鹽、碳源、維生素、生長調節(jié)素、有機添加劑維生素、生長調節(jié)素、有機添加劑等。等。 用于植物細胞培養(yǎng)的基礎培養(yǎng)基營養(yǎng)成分用于植物細胞培養(yǎng)的基礎培養(yǎng)基營養(yǎng)

10、成分基本上與整個植物的要求一樣，但是用于培養(yǎng)基本上與整個植物的要求一樣，但是用于培養(yǎng)細胞、組織和器官的培養(yǎng)基要滿足各自特殊的細胞、組織和器官的培養(yǎng)基要滿足各自特殊的要求要求無機鹽無機鹽：有不少鹽可用來提供有不少鹽可用來提供“大量元素大量元素”和和“微量元素微量元素”，表中給出了常用培養(yǎng)基中，表中給出了常用培養(yǎng)基中無機鹽的含量。無機鹽的含量。培養(yǎng)中的細胞對培養(yǎng)中的細胞對蔗糖和葡萄糖蔗糖和葡萄糖都能利用，都能利用，果糖的利用效果較差。培養(yǎng)基中的蔗糖可迅果糖的利用效果較差。培養(yǎng)基中的蔗糖可迅速分解成葡萄糖和果糖，葡萄糖首先被利用，速分解成葡萄糖和果糖，葡萄糖首先被利用，然后再利用果糖。也可采用其它糖

11、作能源，然后再利用果糖。也可采用其它糖作能源，但效果不佳。但效果不佳。碳源和能源碳源和能源 培養(yǎng)中的植物細胞都需要培養(yǎng)中的植物細胞都需要硫胺素硫胺素，加入，加入煙煙酸、泛酸、生物素和葉酸酸、泛酸、生物素和葉酸，效果更好。原生，效果更好。原生質體培養(yǎng)通常需要大多數必需維生素。質體培養(yǎng)通常需要大多數必需維生素。維生素維生素雖然植物細胞在培養(yǎng)過程中一般都能合成所需雖然植物細胞在培養(yǎng)過程中一般都能合成所需的氨基酸，但加入的氨基酸，但加入L-L-谷氨酰胺谷氨酰胺或其他氨基酸混合或其他氨基酸混合物是很有好處的。此外，還使用物是很有好處的。此外，還使用蛋白酶解產物蛋白酶解產物，如酪蛋白或酪蛋白水解氨基酸。其

12、它有機添加劑如酪蛋白或酪蛋白水解氨基酸。其它有機添加劑還有如乳蛋白水解物，酵母提取物等還有如乳蛋白水解物，酵母提取物等氨基酸氨基酸激素分為兩類，激素分為兩類，生長素和分裂素生長素和分裂素。生長素促進。生長素促進細胞生長，最有效和最常用的是細胞生長，最有效和最常用的是吲哚乙酸和萘乙吲哚乙酸和萘乙酸酸；分裂素促進細胞分裂，常用的是腺嘌呤衍生；分裂素促進細胞分裂，常用的是腺嘌呤衍生物。使用最多的是物。使用最多的是6-6-芐氨基嘌呤和玉米素芐氨基嘌呤和玉米素，對芽，對芽的誘導具有重要作用。分裂素和生長素通常一起的誘導具有重要作用。分裂素和生長素通常一起使用，來促進細胞的分裂、生長。使用，來促進細胞的分

13、裂、生長。植物生長激素植物生長激素四四. .愈傷組織和懸浮細胞培養(yǎng)技術愈傷組織和懸浮細胞培養(yǎng)技術愈傷組織愈傷組織：是指外植體組織增生的細胞產生的一：是指外植體組織增生的細胞產生的一團不定型的疏散的排列的薄壁細胞，是分化的，團不定型的疏散的排列的薄壁細胞，是分化的，而且還未形成組織的結構。而且還未形成組織的結構。外植體：外植體：是指植物組織培養(yǎng)中用來進行離體培養(yǎng)是指植物組織培養(yǎng)中用來進行離體培養(yǎng)的植物材料。的植物材料。 愈傷組織的誘導愈傷組織的誘導選擇適宜的外植體：幼胚、下胚軸、子葉選擇適宜的外植體：幼胚、下胚軸、子葉選擇適宜的培養(yǎng)基：選擇適宜的培養(yǎng)基：MSMS，B5B5，N6N6較高激素濃度較

14、高激素濃度豐富的有機附加物。豐富的有機附加物。培養(yǎng)基中有較高含量的無機氮源培養(yǎng)基中有較高含量的無機氮源較低的蔗糖濃度較低的蔗糖濃度適當縮短繼代培養(yǎng)的間隔時間有利于疏松易適當縮短繼代培養(yǎng)的間隔時間有利于疏松易碎愈傷組織的形成。碎愈傷組織的形成。要求：松散性好、增殖快、再生能力強。其外觀一般是色要求：松散性好、增殖快、再生能力強。其外觀一般是色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色，呈細小顆粒狀，疏松易碎澤呈鮮艷的乳白或淡黃色，呈細小顆粒狀，疏松易碎適宜懸浮培養(yǎng)適宜懸浮培養(yǎng)適宜再生植株適宜再生植株懸浮系的建立與培養(yǎng)懸浮系的建立與培養(yǎng)callus150250ml flaskcentrifuge isolations

15、ubculture1g/10ml medium100120 rmp culture transfer 1 time/3d80 rpm高表達細胞系的篩選建立高表達細胞系的篩選建立一是懸浮培養(yǎng)物分散性好，外觀疏松、色澤鮮艷一是懸浮培養(yǎng)物分散性好，外觀疏松、色澤鮮艷二是均一性好二是均一性好三是生長速度快、次生代謝產物合成能力強三是生長速度快、次生代謝產物合成能力強五五. .單細胞培養(yǎng)技術單細胞培養(yǎng)技術機械法機械法將葉肉組織研碎，經過濾和離心，收集和凈將葉肉組織研碎，經過濾和離心，收集和凈化細胞。化細胞。優(yōu)點：不受酶的傷害，有利于細胞生理和生優(yōu)點：不受酶的傷害，有利于細胞生理和生化研究。缺點：手工操作

16、難度大，獲得完整的細化研究。缺點：手工操作難度大，獲得完整的細胞數量少。胞數量少。1 1、單細胞分離方法、單細胞分離方法酶法酶法利用利用果膠酶、纖維素酶果膠酶、纖維素酶處理植物葉片或其他處理植物葉片或其他外植物體，使細胞分離。外植物體，使細胞分離。加滲透壓保護劑如加滲透壓保護劑如甘露醇甘露醇以防酶對細胞的損以防酶對細胞的損傷。傷。加加硫酸葡聚糖鉀鹽硫酸葡聚糖鉀鹽可提高游離細胞的產量。可提高游離細胞的產量?；瘜W法化學法 利用利用化學藥劑使細胞分離的方法。利用利用化學藥劑使細胞分離的方法。 草酸鈣草酸鈣處理胡蘿卜懸浮細胞培養(yǎng)物時，可獲處理胡蘿卜懸浮細胞培養(yǎng)物時，可獲得分散細胞。得分散細胞。秋水仙堿

17、、秋水仙堿、2，4D或或LH?？醋o培養(yǎng)看護培養(yǎng)2 2、單細胞培養(yǎng)方法、單細胞培養(yǎng)方法用一塊活躍生長的愈傷組織來促用一塊活躍生長的愈傷組織來促進培養(yǎng)細胞持續(xù)分裂和增殖的方法。進培養(yǎng)細胞持續(xù)分裂和增殖的方法。優(yōu)點：優(yōu)點：簡便易行，效果好。簡便易行，效果好。缺點：缺點：不能在顯微鏡下追蹤細胞分裂、生長過程。不能在顯微鏡下追蹤細胞分裂、生長過程。將懸浮單細胞與融化的瓊脂培養(yǎng)基均勻混將懸浮單細胞與融化的瓊脂培養(yǎng)基均勻混合后平鋪一薄層在培養(yǎng)皿底上的培養(yǎng)法。合后平鋪一薄層在培養(yǎng)皿底上的培養(yǎng)法。平板培養(yǎng)平板培養(yǎng)平板培養(yǎng)平板培養(yǎng)平板培養(yǎng)植板率平板培養(yǎng)植板率優(yōu)點：優(yōu)點：單細胞在培養(yǎng)基中分布均勻，便于在顯單細胞在培

18、養(yǎng)基中分布均勻，便于在顯鏡下對細胞進行定點觀察。篩選效率高、篩鏡下對細胞進行定點觀察。篩選效率高、篩選量大、操作簡便。選量大、操作簡便。缺點：缺點：通氣狀況不好，排泄物質易積累造成通氣狀況不好，排泄物質易積累造成 毒毒害或影響組織吸收。害或影響組織吸收。微室培養(yǎng)微室培養(yǎng)在人工制造的無菌小室中，將一滴懸浮細胞在人工制造的無菌小室中，將一滴懸浮細胞液培養(yǎng)在少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖成細液培養(yǎng)在少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖成細胞團的方法。胞團的方法。置培養(yǎng)皿中置培養(yǎng)皿中2628 恒溫培養(yǎng)恒溫培養(yǎng)優(yōu)點：優(yōu)點：可對培養(yǎng)細胞連續(xù)進行顯微觀察，了解一可對培養(yǎng)細胞連續(xù)進行顯微觀察，了解一個細胞的生長、分裂、分化

19、等過程。個細胞的生長、分裂、分化等過程。缺點：缺點：培養(yǎng)基少，營養(yǎng)和水分難以保持，培養(yǎng)基少，營養(yǎng)和水分難以保持，pH變動變動幅度大，培養(yǎng)細胞僅能短期分裂。幅度大，培養(yǎng)細胞僅能短期分裂。六六. .提高植物細胞次級代謝產物含量的方法提高植物細胞次級代謝產物含量的方法加入前體物或誘導物加入前體物或誘導物前體物：前體物：次生代謝合成途徑中的某一中次生代謝合成途徑中的某一中間化合物或是合成的起始物。間化合物或是合成的起始物。誘導物：誘導物：一類能引起植物細胞代謝強度一類能引起植物細胞代謝強度變化或代謝途徑改變的物質。變化或代謝途徑改變的物質。毛狀根培養(yǎng)毛狀根培養(yǎng)毛狀根毛狀根(hairy roots)是發(fā)

20、根農桿菌是發(fā)根農桿菌(Agrobacterium rhizogenes)感染植物后，其感染植物后，其Ri質粒上的質粒上的TDNA片斷整片斷整合進植物細胞核基因組中誘導產生的一種特殊表現型。合進植物細胞核基因組中誘導產生的一種特殊表現型。 冠癭瘤培養(yǎng)冠癭瘤培養(yǎng)植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)在食品工業(yè)中的應用植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)在食品工業(yè)中的應用（1 1）利用植物細胞工程生產香料）利用植物細胞工程生產香料（2 2）生產食品添加劑）生產食品添加劑（3 3）生產天然食品）生產天然食品 七、植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)七、植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的特點植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的特點植物細胞對剪切力敏感。植物細胞對剪切力敏

21、感。 植物細胞培養(yǎng)通常形成細胞團。植物細胞培養(yǎng)通常形成細胞團。 植物細胞生長速度慢，操作周期長植物細胞生長速度慢，操作周期長 多泡沫。多泡沫。植物細胞在高濃度培養(yǎng)時為假塑性流體。植物細胞在高濃度培養(yǎng)時為假塑性流體。植物細胞的需氧量要比微生物要低的多。植物細胞的需氧量要比微生物要低的多。大多數植物細胞培養(yǎng)需要光照。大多數植物細胞培養(yǎng)需要光照。幾種流體特征幾種流體特征1-賓漢型 2-假塑性 3-牛頓型 4-漲塑性 1-漲塑性 2-牛頓型 3-假塑性 1.1.植物細胞懸浮細胞培養(yǎng)植物細胞懸浮細胞培養(yǎng)懸浮細胞培養(yǎng)技術懸浮細胞培養(yǎng)技術懸浮培養(yǎng)優(yōu)勢懸浮培養(yǎng)優(yōu)勢把離體的植物細胞懸浮在液體培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)

22、把離體的植物細胞懸浮在液體培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)1 1）培養(yǎng)細胞與培養(yǎng)基質接觸面大，傳質效果好。）培養(yǎng)細胞與培養(yǎng)基質接觸面大，傳質效果好。2 2）可帶走有害的代謝產物，避免了有害產物局部）可帶走有害的代謝產物，避免了有害產物局部濃度過高的問題。濃度過高的問題。3 3）能充分保證氧的供給。）能充分保證氧的供給。2.2.植物細胞固定化培養(yǎng)植物細胞固定化培養(yǎng) 植物細胞固定化是將植物細胞包裹于一些多糖植物細胞固定化是將植物細胞包裹于一些多糖或多聚化合物上進行培養(yǎng)，并生產有用代謝物或多聚化合物上進行培養(yǎng)，并生產有用代謝物的技術。的技術。固定化培養(yǎng)技術固定化培養(yǎng)技術（1）有利于次生物質的合成、積累；）有利于

23、次生物質的合成、積累；（2）減弱剪切力損傷；減弱剪切力損傷；（3）有利于連續(xù)培養(yǎng)和產物的收集；）有利于連續(xù)培養(yǎng)和產物的收集；固定化培養(yǎng)優(yōu)勢固定化培養(yǎng)優(yōu)勢1 1）懸浮培養(yǎng)生物反應器）懸浮培養(yǎng)生物反應器 植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的初期（植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的初期（20世紀世紀70年代），主要采用微生物培養(yǎng)用的機械攪拌反年代），主要采用微生物培養(yǎng)用的機械攪拌反應器。應器。 1972年，年，Kato首先用機械攪拌反應器培養(yǎng)首先用機械攪拌反應器培養(yǎng)煙草細胞以獲取煙堿。煙草細胞以獲取煙堿。Fujita利用這種反應器利用這種反應器生產紫草寧。生產紫草寧。3.3.植物細胞培養(yǎng)生物反應器植物細胞培養(yǎng)生物反應器機械攪拌反

24、應器機械攪拌反應器機械攪拌植物細胞反應器機械攪拌植物細胞反應器 機械攪拌反應器的優(yōu)點及存在的問題機械攪拌反應器的優(yōu)點及存在的問題 優(yōu)點：機械攪拌生物反應器最大的優(yōu)點就是獲優(yōu)點：機械攪拌生物反應器最大的優(yōu)點就是獲得得高的溶氧系數高的溶氧系數 (KLa 100h-1)，植物細胞培養(yǎng)一，植物細胞培養(yǎng)一般只需要般只需要KLa在在5-20 h-1之間就夠了；再是反應器的之間就夠了；再是反應器的溫度、溫度、pH值、溶氧及營養(yǎng)物質的濃度較易控制值、溶氧及營養(yǎng)物質的濃度較易控制。 存在的問題：主要問題是存在的問題：主要問題是剪切力問題剪切力問題；對只需；對只需較低較低kLa的植物細胞培養(yǎng)，促進氧傳遞的機械攪的

25、植物細胞培養(yǎng)，促進氧傳遞的機械攪拌，每拌，每單位體積消耗的功率比氣體攪拌要大單位體積消耗的功率比氣體攪拌要大；機；機械攪拌需攪拌軸，由此又帶來了械攪拌需攪拌軸，由此又帶來了無菌密封無菌密封問題。問題。非機械攪拌反應器非機械攪拌反應器 通常為氣體攪拌反應器，是一種利用通入通常為氣體攪拌反應器，是一種利用通入的空氣作通氣和攪拌的生物反應器，主要有的空氣作通氣和攪拌的生物反應器，主要有鼓鼓泡式反應器泡式反應器和和氣升式反應器氣升式反應器，氣升式反應器又，氣升式反應器又可分為外循環(huán)和內循環(huán)式?？煞譃橥庋h(huán)和內循環(huán)式。 我國的劉大陸、查麗杭等發(fā)明了我國的劉大陸、查麗杭等發(fā)明了“氣升內氣升內錯流式錯流式”

26、植物細胞培養(yǎng)反應器用于培養(yǎng)紫草，植物細胞培養(yǎng)反應器用于培養(yǎng)紫草，紫草寧含量達到了干細胞重的紫草寧含量達到了干細胞重的10%，是天然，是天然植株的植株的2-8倍。倍。氣體攪拌反應器的優(yōu)點及存在的問題氣體攪拌反應器的優(yōu)點及存在的問題 優(yōu)點：優(yōu)點：剪切力小剪切力小，對植物細胞損傷??；，對植物細胞損傷??；因沒有攪拌軸而更因沒有攪拌軸而更易保持無菌易保持無菌；操作費用低操作費用低。 不足：因氣體攪拌強度低，不足：因氣體攪拌強度低，高密度培養(yǎng)時混高密度培養(yǎng)時混合不夠均勻合不夠均勻?？看罅康耐廨斎雱恿亢湍芰浚??？看罅康耐廨斎雱恿亢湍芰?，以保證反應器內培養(yǎng)液的良好傳質、傳熱。但保證反應器內培養(yǎng)液的良好傳

27、質、傳熱。但過量過量的通氣易排除培養(yǎng)液中的二氧化碳和乙烯的通氣易排除培養(yǎng)液中的二氧化碳和乙烯，對于，對于細胞生長有阻礙作用。再是細胞生長有阻礙作用。再是過高的溶氧對植物細過高的溶氧對植物細胞合成次級代謝產物不利胞合成次級代謝產物不利。2)2)固定化細胞生物反應器固定化細胞生物反應器固定化細胞：將一定生理功能的生物體用物理或固定化細胞：將一定生理功能的生物體用物理或化學方法使其與適當載體相結合，作為固體催化化學方法使其與適當載體相結合，作為固體催化劑利用。劑利用。優(yōu)點：單位體積細胞多，受剪切力小。優(yōu)點：單位體積細胞多，受剪切力小。缺點：由于其混合效果低，對必要的氧缺點：由于其混合效果低，對必要的

28、氧傳遞，傳遞，pH值、溫度控制和氣體產物值、溫度控制和氣體產物(如如C02)的排除造成了困難。再者支持物顆的排除造成了困難。再者支持物顆粒破碎易堵塞填充床。粒破碎易堵塞填充床。填充床反應器填充床反應器Jones 在填充床反應器中進行了固定化胡蘿在填充床反應器中進行了固定化胡蘿卜的培養(yǎng)，卜的培養(yǎng)，Kargi 采用這種反應器培養(yǎng)長春采用這種反應器培養(yǎng)長春花花流化床反應器流化床反應器優(yōu)點：良好的傳質特性。優(yōu)點：良好的傳質特性。缺點：剪切力和顆粒碰撞會損壞固定缺點：剪切力和顆粒碰撞會損壞固定化細胞，同時，流體動力學的復雜性化細胞，同時，流體動力學的復雜性使之難以放大。使之難以放大。 典型的流化床反應器

29、是利用液體或氣體典型的流化床反應器是利用液體或氣體的流動使支持物顆粒處于懸浮狀態(tài)。的流動使支持物顆粒處于懸浮狀態(tài)。Hamilton 用之培養(yǎng)胡蘿卜細胞，研究了轉化酶活性。用之培養(yǎng)胡蘿卜細胞，研究了轉化酶活性。膜反應器膜反應器優(yōu)點：可以重復使用。另外，流體易控制，優(yōu)點：可以重復使用。另外，流體易控制，易放大，而且能提供更均勻的環(huán)境條件。膜具有易放大，而且能提供更均勻的環(huán)境條件。膜具有選擇性，有利于產品分離。選擇性，有利于產品分離。 缺點是構建膜反應器的成本較高。缺點是構建膜反應器的成本較高。第三節(jié)、動物細胞培養(yǎng)技術第三節(jié)、動物細胞培養(yǎng)技術 1919世紀世紀3030年代，年代，Muller, Sc

30、hwann, VircMuller, Schwann, Virchowhow等相繼在肺結核、天花、水痘、麻疹等病等相繼在肺結核、天花、水痘、麻疹等病理組織中觀察到理組織中觀察到多核細胞多核細胞現象。現象。 1849 1849年年LobingLobing在骨髓中也發(fā)現了多核現象在骨髓中也發(fā)現了多核現象的存在，的存在，18551855年年18581858年，科學家們在肺組織年，科學家們在肺組織和各種正常組織及發(fā)尖和壞死部位都發(fā)現了多和各種正常組織及發(fā)尖和壞死部位都發(fā)現了多核細胞。核細胞。 1 1融合現象的發(fā)現融合現象的發(fā)現一、一、動物物細胞工程的發(fā)展動物物細胞工程的發(fā)展18591859年，年，A.

31、 BarliA. Barli在研究黏蟲的生活史時發(fā)在研究黏蟲的生活史時發(fā)現，某些黏蟲存在著由單個核細胞融合形成多現，某些黏蟲存在著由單個核細胞融合形成多核的原生質團的情況。據此，他認為核的原生質團的情況。據此，他認為多核細胞多核細胞是由單個細胞彼此融合而形成的是由單個細胞彼此融合而形成的。2. 2. 動物組織細胞培養(yǎng)技術的建立動物組織細胞培養(yǎng)技術的建立19071907年，年，R. HarrisonR. Harrison將將蛙的胚神經管區(qū)蛙的胚神經管區(qū)的一片組織的一片組織移植到蛙的淋巴液凝塊中，這片移植到蛙的淋巴液凝塊中，這片組織組織存活了若干星期存活了若干星期，而且還，而且還長出了軸突長出了軸

32、突( (神神經纖維經纖維) )細胞。細胞。Carrel (1911)Carrel (1911)發(fā)現了雞胚浸出液對于某發(fā)現了雞胚浸出液對于某些細胞的生長具有很強的促進效應，把些細胞的生長具有很強的促進效應，把無菌無菌技術引到了組織培養(yǎng)技術中技術引到了組織培養(yǎng)技術中。19141914年，年，ThomsonThomson創(chuàng)立了創(chuàng)立了器官培養(yǎng)法器官培養(yǎng)法，以，以后被后被StrangewaysStrangeways和和FellFell所發(fā)展。所發(fā)展。19401940年，年，EarleEarle建立了建立了小鼠的結締組織細小鼠的結締組織細胞系胞系L L系。系。19511951年，年，GayGay建立了第一

33、個建立了第一個人人體細胞系體細胞系. .3. 3. 細胞融合技術的建立和雜交瘤技術的誕生細胞融合技術的建立和雜交瘤技術的誕生19581958年年, Okada, Okada發(fā)現紫外滅活的發(fā)現紫外滅活的仙臺病毒仙臺病毒可可引起艾氏腹水瘤細胞彼此融合。引起艾氏腹水瘤細胞彼此融合。Harris(1965)Harris(1965)誘導誘導不同的動物體細胞融合不同的動物體細胞融合獲得成功。獲得成功。Lifflefield(1964)Lifflefield(1964)根據親本細胞的酶缺陷根據親本細胞的酶缺陷型，利用選擇性培養(yǎng)基型，利用選擇性培養(yǎng)基篩選異型融合細胞篩選異型融合細胞，并，并能不斷地能不斷地增殖

34、增殖。19751975年，免疫學家年，免疫學家KohlerKohler和和MilsteinMilstein利用利用小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合，選擇到能小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合，選擇到能分泌分泌單一抗體的雜種細胞單一抗體的雜種細胞。4. 4. 動物克隆技術的建立動物克隆技術的建立18911891，HeapeHeape等人首次報道了家等人首次報道了家兔胚胎移植兔胚胎移植成功的結果。成功的結果。2020世紀世紀3030年代以后，先后在羊、豬、牛等年代以后，先后在羊、豬、牛等動物的胚胎移植上獲得成功。動物的胚胎移植上獲得成功。19621962年，英國學者年，英國學者GrudonGrudon把

35、非洲把非洲爪蟾小爪蟾小腸上皮細胞的核腸上皮細胞的核注入同種或異種非洲爪蟾未注入同種或異種非洲爪蟾未受精卵受精卵( (經紫外線照射殺死卵細胞核經紫外線照射殺死卵細胞核) )中，約中，約有有1 1的重組卵發(fā)育成為成熟蛙的重組卵發(fā)育成為成熟蛙。19971997年年2 2月，英國科學家月，英國科學家WilmutWilmut等報道等報道了世界第一只了世界第一只克隆羊克隆羊的誕生。的誕生。1.1.過程過程二、動物細胞培養(yǎng)二、動物細胞培養(yǎng)2.2.幾個概念：幾個概念： 動物細胞培養(yǎng)就是動物細胞培養(yǎng)就是從動物機體中取出相關從動物機體中取出相關的組織的組織, ,將它分散成單個將它分散成單個細胞細胞, ,然后然后,

36、 ,放在適宜的放在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)基中, ,讓這些細胞生讓這些細胞生長和增殖長和增殖, ,并維持結構和并維持結構和功能的一門技術。功能的一門技術。動物細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)將動物組織消化后的初次培養(yǎng)稱為將動物組織消化后的初次培養(yǎng)稱為原原代培養(yǎng)代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)用胰蛋白酶將出現接觸抑制的貼壁細用胰蛋白酶將出現接觸抑制的貼壁細胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來，制成細胞懸液，胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來，制成細胞懸液，分裝到多個培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，這個過程分裝到多個培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，這個過程叫叫傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)。細胞系和細胞株細胞系和細胞株初次培養(yǎng)的細胞經第一次傳代成功后，即稱初次培養(yǎng)的細胞

37、經第一次傳代成功后，即稱之為之為細胞系細胞系。從一個經過生物學鑒定的細胞系用單細胞從一個經過生物學鑒定的細胞系用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選方法，分離培養(yǎng)或通過篩選方法，由單細胞增殖形成由單細胞增殖形成的細胞群的細胞群，稱，稱細胞株細胞株。有限細胞系和無限細胞系有限細胞系和無限細胞系大多數細胞系在大多數細胞系在有限的代數內增殖有限的代數內增殖，當，當超過有限世代后，它們可能有兩種情況，一是超過有限世代后，它們可能有兩種情況，一是衰老死亡，二是發(fā)育成無限細胞系或稱衰老死亡，二是發(fā)育成無限細胞系或稱連續(xù)細連續(xù)細胞系胞系。 有限細胞系轉換成永久細胞系的過度期稱有限細胞系轉換成永久細胞系的過度期稱為轉換期

38、，其轉換過程在動物細胞培養(yǎng)中稱為為轉換期，其轉換過程在動物細胞培養(yǎng)中稱為體外轉化體外轉化。接觸抑制接觸抑制密度抑制密度抑制3.3.動物細胞培養(yǎng)生長的特點動物細胞培養(yǎng)生長的特點貼附生長貼附生長貼附生長貼附生長 粘附型細胞粘附型細胞: :附著在某一固相支持物表面才能生附著在某一固相支持物表面才能生長的細胞。長的細胞。 懸浮型細胞懸浮型細胞: :不必附著于固相支持物表面，而不必附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)下即可生長的細胞。在懸浮狀態(tài)下即可生長的細胞。 絕大多數有機體細胞屬粘附型細胞，只有少數絕大多數有機體細胞屬粘附型細胞，只有少數細胞類型如某些細胞類型如某些腫瘤細胞和白細胞腫瘤細胞和白細胞可在

39、懸浮狀態(tài)下可在懸浮狀態(tài)下生長。生長。 細胞接觸抑制細胞接觸抑制 細胞在貼壁生長過程中，細胞間相互接觸，細細胞在貼壁生長過程中，細胞間相互接觸，細胞分裂和生長停止的現象。胞分裂和生長停止的現象。密度抑制密度抑制細胞培養(yǎng)過程中，細胞密度增大，培養(yǎng)液細胞培養(yǎng)過程中，細胞密度增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產物增多，細胞因營養(yǎng)中營養(yǎng)成分減少，代謝產物增多，細胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響而導致的細胞分裂和生的枯竭和代謝物的影響而導致的細胞分裂和生長停止。長停止。體內：粘附是全方位，外形具有復雜的立體內：粘附是全方位，外形具有復雜的立體特征體特征體外：多數情況，細胞只有一個附著平面，體外：多數情況，細胞只

40、有一個附著平面，外形一般與體內時明顯不同外形一般與體內時明顯不同細胞在體內、外的粘附方式存在差異細胞在體內、外的粘附方式存在差異上皮細胞型上皮細胞型成纖維細胞型成纖維細胞型游走細胞型游走細胞型多型性細胞型多型性細胞型4 4、培養(yǎng)動物細胞形態(tài)、培養(yǎng)動物細胞形態(tài)類似體內的上皮細胞，類似體內的上皮細胞，扁平，不規(guī)則多角形，扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核中有圓形核。彼此緊密相連成鋪石狀薄層；生長時呈。彼此緊密相連成鋪石狀薄層；生長時呈膜狀移動；很少脫離細胞群而單個活動膜狀移動；很少脫離細胞群而單個活動上皮細胞型上皮細胞型胞體胞體梭形或不規(guī)則三角形梭形或不規(guī)則三角形；胞質向外伸出；胞質向外伸出2323個

41、長短不等的個長短不等的細胞突起細胞突起；中有；中有卵圓形核卵圓形核。排列成放射。排列成放射狀，漩渦狀，不連成片。狀，漩渦狀，不連成片。成纖維細胞型成纖維細胞型游走細胞型游走細胞型外形不規(guī)則且不斷外形不規(guī)則且不斷變化變化，細胞內容易出，細胞內容易出現暗的現暗的吞噬性顆粒吞噬性顆粒。生長位置不固定，分生長位置不固定，分散，呈活躍的的游走散，呈活躍的的游走和變形運動。和變形運動。多型性細胞型多型性細胞型外形不規(guī)則，外形不規(guī)則，細胞由略呈細胞由略呈多角形的胞多角形的胞體體和細長的、類似偽足的和細長的、類似偽足的胞突胞突兩部分組成，兩部分組成，胞內容易出現暗的吞噬性顆粒胞內容易出現暗的吞噬性顆粒血清血清

42、：如：如HelaHela細胞系在高血清成纖維細胞樣；細胞系在高血清成纖維細胞樣；低血清上皮樣細胞低血清上皮樣細胞 pHpH：如如HelaHela細胞系，太酸或太堿成纖維細胞樣；細胞系，太酸或太堿成纖維細胞樣；標準標準pHpH上皮樣細胞上皮樣細胞細胞密度細胞密度：3T33T3，低密度成纖維細胞樣；高密度，低密度成纖維細胞樣；高密度上皮樣細胞上皮樣細胞生長狀態(tài)改變生長狀態(tài)改變：懸浮圓形懸??；貼附成纖維：懸浮圓形懸??；貼附成纖維或上皮樣或上皮樣 轉化與否轉化與否 ：未轉化成纖維樣；轉化后可成上皮：未轉化成纖維樣；轉化后可成上皮樣樣 培養(yǎng)細胞形態(tài)變化培養(yǎng)細胞形態(tài)變化三、培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程三、培養(yǎng)

43、細胞的生長和增殖過程1.1.培養(yǎng)細胞生命期培養(yǎng)細胞生命期 所謂培養(yǎng)細胞生命期，是指細胞在培養(yǎng)中所謂培養(yǎng)細胞生命期，是指細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。包括持續(xù)增殖和生長的時間。包括原代培養(yǎng)期、原代培養(yǎng)期、傳代培養(yǎng)期傳代培養(yǎng)期及及衰退期衰退期。正常培養(yǎng)的細胞周期正常培養(yǎng)的細胞周期2.2.體外培養(yǎng)細胞一代生存期體外培養(yǎng)細胞一代生存期- -生長曲線生長曲線潛伏期潛伏期指數增長期指數增長期平衡期平衡期衰退期衰退期 所謂細胞的所謂細胞的“一代一代”是指從細胞接種到分離是指從細胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時間。再培養(yǎng)的一段時間。四、動物細胞培養(yǎng)的基本技術四、動物細胞培養(yǎng)的基本技術1. 1. 無菌、無毒的環(huán)境

44、無菌、無毒的環(huán)境添加一定量的抗生素，定期更換培養(yǎng)液。添加一定量的抗生素，定期更換培養(yǎng)液。2. 2. 溫度和溫度和pHpH溫度溫度pH與體內相近與體內相近 35-377.27.43. 3. 氣體環(huán)境氣體環(huán)境O O2 2COCO2 2細胞代謝所必需細胞代謝所必需維持維持pHpHu COCO2 2培養(yǎng)箱（培養(yǎng)箱（95% 95% 空氣空氣5% CO5% CO2 2 ）5 .5 .平衡鹽溶液平衡鹽溶液BSSBSS人工合成培養(yǎng)基的基礎用液，用來洗滌人工合成培養(yǎng)基的基礎用液，用來洗滌細胞。細胞。Hanks液、液、Earle液和液和PBS液等液等4. 4. 營養(yǎng)物質營養(yǎng)物質 糖、氨基酸、促生長因子、無機鹽、微

45、量糖、氨基酸、促生長因子、無機鹽、微量元素、激素以及動物或人血清等。元素、激素以及動物或人血清等。RPMI-1640 細胞培養(yǎng)基成分細胞培養(yǎng)基成分 （配制時添加碳酸氫鈉（配制時添加碳酸氫鈉2000mg/L）五、動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)五、動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)培養(yǎng)方式分為：培養(yǎng)方式分為： 分批式分批式 流加式流加式 半連續(xù)式半連續(xù)式 連續(xù)式連續(xù)式1.1.動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝方式動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝方式 分批式培養(yǎng)分批式培養(yǎng)分批式培養(yǎng)：指先將細胞和培養(yǎng)液分批式培養(yǎng)：指先將細胞和培養(yǎng)液一次性裝入反應器內進行培養(yǎng)，細胞不一次性裝入反應器內進行培養(yǎng)，細胞不斷生長，產物不斷形成，經一段時間后，斷生長，產物不斷

46、形成，經一段時間后，終止培養(yǎng)。終止培養(yǎng)。特點：特點：分批式培養(yǎng)過程的環(huán)境隨時間變化很大分批式培養(yǎng)過程的環(huán)境隨時間變化很大細胞的生長階段可分為延滯期、對數生長細胞的生長階段可分為延滯期、對數生長期、減速期、平穩(wěn)期和衰退期。期、減速期、平穩(wěn)期和衰退期。流加式培養(yǎng)流加式培養(yǎng) 特點：特點：u可避免某種營養(yǎng)成分的初始濃度過高；可避免某種營養(yǎng)成分的初始濃度過高；u能防止營養(yǎng)成分在培養(yǎng)過程中被耗盡；能防止營養(yǎng)成分在培養(yǎng)過程中被耗盡；u整個過程反應體積是變化的。整個過程反應體積是變化的。 流加式培養(yǎng)是指先將終體積流加式培養(yǎng)是指先將終體積1/31/2的的培養(yǎng)液培養(yǎng)液裝入反應器，接種細胞，進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中，

47、裝入反應器，接種細胞，進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中，隨著細胞對營養(yǎng)物質的不斷消耗，新的營養(yǎng)成分又隨著細胞對營養(yǎng)物質的不斷消耗，新的營養(yǎng)成分又不斷補充至反應器內，使細胞持續(xù)生長代謝，到反不斷補充至反應器內，使細胞持續(xù)生長代謝，到反應終止時取出整個反應系。應終止時取出整個反應系。半連續(xù)式培養(yǎng)半連續(xù)式培養(yǎng) 指在分批式培養(yǎng)的基礎上，將分批培養(yǎng)指在分批式培養(yǎng)的基礎上，將分批培養(yǎng)的培養(yǎng)液部分取出，并補充加入等量的新鮮培的培養(yǎng)液部分取出，并補充加入等量的新鮮培養(yǎng)基，使反應器內培養(yǎng)液的總體積保持不變。養(yǎng)基，使反應器內培養(yǎng)液的總體積保持不變。半連續(xù)培養(yǎng)能夠重復獲得大量均一的培養(yǎng)細胞半連續(xù)培養(yǎng)能夠重復獲得大量均一的培養(yǎng)

48、細胞供進一步利用。供進一步利用。特點：操作簡便、生產效率高，可長期特點：操作簡便、生產效率高，可長期生產，細胞密度和產品產量一直保持在較生產，細胞密度和產品產量一直保持在較高水平。高水平。連續(xù)式培養(yǎng)連續(xù)式培養(yǎng)連續(xù)式培養(yǎng)：指在培養(yǎng)過程中，以不斷抽取連續(xù)式培養(yǎng)：指在培養(yǎng)過程中，以不斷抽取懸浮培養(yǎng)物并注入等量新鮮培養(yǎng)基，使培養(yǎng)物懸浮培養(yǎng)物并注入等量新鮮培養(yǎng)基，使培養(yǎng)物不斷得到養(yǎng)分補充，保持反應條件處于一種恒不斷得到養(yǎng)分補充，保持反應條件處于一種恒定狀態(tài)。定狀態(tài)。特點：特點： （1 1）反應器培養(yǎng)狀態(tài)恒定，保持細胞在優(yōu)化狀）反應器培養(yǎng)狀態(tài)恒定，保持細胞在優(yōu)化狀態(tài)下生長；態(tài)下生長；（2 2）適于大規(guī)模工

49、業(yè)化生產；）適于大規(guī)模工業(yè)化生產； (3) (3)操作復雜、增加污染機會、細胞變異、設操作復雜、增加污染機會、細胞變異、設備儀器要求高備儀器要求高 2 2、動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術、動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)固定化培養(yǎng)固定化培養(yǎng)微載體培養(yǎng)技術微載體培養(yǎng)技術大載體培養(yǎng)技術大載體培養(yǎng)技術多孔載體培養(yǎng)多孔載體培養(yǎng)微囊化培養(yǎng)技術微囊化培養(yǎng)技術中空纖維細胞培養(yǎng)技術中空纖維細胞培養(yǎng)技術第三節(jié)細胞融合技術第三節(jié)細胞融合技術是指在外力的作用下，兩個以是指在外力的作用下，兩個以上的異源（種、屬）細胞或原生質體上的異源（種、屬）細胞或原生質體互相接觸，不經過有性過程而發(fā)生膜互相接觸，不經

50、過有性過程而發(fā)生膜融合、胞質融合和核融合并形成一個融合、胞質融合和核融合并形成一個雜合細胞的現象。雜合細胞的現象。細胞融合（體細胞雜細胞融合（體細胞雜交）交） 植物體細胞融合應用示例植物體細胞融合應用示例雜交的兩個細胞雜交的兩個細胞用纖維素酶、果膠酶處用纖維素酶、果膠酶處理細胞壁理細胞壁原生質體、原生質體、經離心、振經離心、振動、電刺激動、電刺激用聚二乙醇用聚二乙醇（）（）誘導誘導融合后的原生質體融合后的原生質體再生細胞壁再生細胞壁雜種細胞雜種細胞脫分化脫分化細胞分裂細胞分裂愈傷組織愈傷組織雜種植株雜種植株再分化再分化（植物體細胞（植物體細胞融合完成的標融合完成的標志）志）植植物物細細胞胞融融

51、合合植物植物組織組織培養(yǎng)培養(yǎng)細胞在促融因子的作用下，出現細胞在促融因子的作用下，出現凝集凝集現象，現象，然后，細胞之間的然后，細胞之間的質膜發(fā)生粘連質膜發(fā)生粘連，細胞開始，細胞開始細胞細胞質融合質融合，然后在培養(yǎng)過程中，進而發(fā)生，然后在培養(yǎng)過程中，進而發(fā)生核融合核融合，形成雜種細胞。形成雜種細胞。細胞融合的過細胞融合的過程程細胞融合細胞融合一.誘導細胞融合的方法1 1、病毒誘導細胞融合、病毒誘導細胞融合病毒是最早采用的融合劑。常用于誘導病毒是最早采用的融合劑。常用于誘導動物細胞融合的病毒有動物細胞融合的病毒有仙臺病毒、新城雞瘟病仙臺病毒、新城雞瘟病毒、皰疹病毒毒、皰疹病毒等，其中仙臺病毒最常用

52、。等，其中仙臺病毒最常用。用作融合劑的病毒必須事先用用作融合劑的病毒必須事先用紫外線或紫外線或-丙內酯滅活丙內酯滅活，使病毒的感染活性喪失而保，使病毒的感染活性喪失而保留病毒的融合活性。留病毒的融合活性。 兩個原生質體或細兩個原生質體或細胞在胞在病毒黏結作用病毒黏結作用下彼下彼此靠近，使兩個細胞膜、此靠近，使兩個細胞膜、胞質間互相滲透胞質間互相滲透 、細胞、細胞核互相融合，進入正常核互相融合，進入正常的細胞分裂途徑，形成的細胞分裂途徑，形成雜種細胞。雜種細胞。機制機制優(yōu)點：優(yōu)點：融合率較高融合率較高，適宜各種動物細胞適宜各種動物細胞，且仙臺病毒，且仙臺病毒能在雞胚中大量繁殖，能在雞胚中大量繁殖

53、，容易培養(yǎng)容易培養(yǎng)；缺點：仙臺病毒缺點：仙臺病毒不穩(wěn)定不穩(wěn)定，在保存過程中融合活性會降，在保存過程中融合活性會降低，并且低，并且制備過程比較煩瑣制備過程比較煩瑣。此外，病毒引進細胞后，。此外，病毒引進細胞后，可能會可能會對細胞的生命活動產生干擾對細胞的生命活動產生干擾。病毒誘導融合優(yōu)缺點病毒誘導融合優(yōu)缺點常用的病毒：（Sendal virus),又稱稱日本血凝病毒（Hemagglutinating virus of Japan,HVJ） 屬屬于副粘液病毒科，RNA病毒，圓圓球形， 1962年，日本仙臺東東北大學學學學者岡岡田發(fā)現發(fā)現仙臺病毒可誘導細誘導細胞融合。 仙臺病毒仙臺病毒利用化學融合劑

54、，促使原生質體相互靠近、利用化學融合劑，促使原生質體相互靠近、粘連融合的方法。粘連融合的方法。2 2、化學融合劑法、化學融合劑法機制機制：PEG是乙二醇的多聚物是乙二醇的多聚物, 存在不同分子存在不同分子量的多聚體量的多聚體,它可它可改變各類細胞的膜結構改變各類細胞的膜結構, 使兩細使兩細胞相互接觸部位的膜脂雙層中脂類分子發(fā)生疏散胞相互接觸部位的膜脂雙層中脂類分子發(fā)生疏散和重組和重組,此時相互接觸的兩細胞的胞質溝通成為可此時相互接觸的兩細胞的胞質溝通成為可能能,從而造成細胞之間發(fā)生融合從而造成細胞之間發(fā)生融合.。優(yōu)缺點優(yōu)缺點:聚乙二醇是化學試劑，聚乙二醇是化學試劑，使用起來很方使用起來很方便便

55、，誘導細胞融合的頻率比較高誘導細胞融合的頻率比較高，但是它有一定，但是它有一定毒性毒性，對有些細胞，對有些細胞(如卵細胞如卵細胞)不適用。不適用。聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）誘導融合）誘導融合 機制機制：一般認為是：一般認為是NaNa+ +造成了膜電位的改變。造成了膜電位的改變。存在的缺陷存在的缺陷：就是融合頻率低，而且對于來源：就是融合頻率低，而且對于來源于葉肉的高度液泡化的原生質體有害。于葉肉的高度液泡化的原生質體有害。由由NaNONaNO3 3誘導的可重復、可控制的離體原生質體誘導的可重復、可控制的離體原生質體融合是由融合是由PowerPower等（等（19701970）報道的。利

56、用這一融合劑，）報道的。利用這一融合劑，CarlsonCarlson等（等（19721972）在植物中獲得了第一個體細胞雜）在植物中獲得了第一個體細胞雜種，種，NaNONaNO3 3處理誘發(fā)融合處理誘發(fā)融合高高CaCa2+2+高高pHpH誘發(fā)融合的機制尚不很清楚，一誘發(fā)融合的機制尚不很清楚，一般認為是改變了膜位及膜的物理結構。般認為是改變了膜位及膜的物理結構。煙草葉肉原生質體煙草葉肉原生質體在高在高CaCa2+2+（0.05M CaCl0.05M CaCl2 2）和高和高pHpH（10.510.5）條件下能很快誘發(fā)融合（）條件下能很快誘發(fā)融合（3737），），但融合頻率不很高，高但融合頻率不很

57、高，高pHpH也影響原生質體的存活率，也影響原生質體的存活率，且易誘發(fā)多個原生質體融合。且易誘發(fā)多個原生質體融合。 高高pHpH高濃度鈣離子處理高濃度鈣離子處理 19811981年，年，ScheurichScheurich和和ZimmermannZimmermann發(fā)明了電誘發(fā)明了電誘導細胞融合。導細胞融合。 采用直流電脈沖的誘導，可改變原采用直流電脈沖的誘導，可改變原生質體質膜表面的電荷，使異種原生質體粘合，生質體質膜表面的電荷，使異種原生質體粘合，并使原生質膜瞬間破裂，相鄰的原生質體連接、并使原生質膜瞬間破裂，相鄰的原生質體連接、閉合、產生融合體。閉合、產生融合體。3 3、電誘導細胞融合法

58、、電誘導細胞融合法細細胞電電融合原理：懸于大小不同的兩平行懸于大小不同的兩平行電極間的低導電率溶液中的電極間的低導電率溶液中的細胞，在交流電場中（細胞，在交流電場中（1101100MHz0MHz和和1001000V/cm1001000V/cm ），），會向小電極移動，并會向小電極移動，并極化成極化成偶極子偶極子，并沿電場方向排列，并沿電場方向排列成串，此時再加上適當強度成串，此時再加上適當強度和持續(xù)時間的高壓電脈沖，和持續(xù)時間的高壓電脈沖，即可使相鄰細胞膜的接觸區(qū)即可使相鄰細胞膜的接觸區(qū)產生可逆電降解，從而觸發(fā)產生可逆電降解，從而觸發(fā)細胞融合。細胞融合。+-+-+-+-+偶極子偶極子電誘導法原

59、理電誘導法原理+-+ 電泳：在電極的作用下，原生質體電泳：在電極的作用下，原生質體泳到一起，建立一個膜接觸狀態(tài)，形成念泳到一起，建立一個膜接觸狀態(tài)，形成念珠鏈。珠鏈。 融合：由于膜的可逆性電激穿，使融合：由于膜的可逆性電激穿，使原生質體發(fā)生融合。原生質體發(fā)生融合。電融合包括兩個步驟：電融合包括兩個步驟：原生質質體電電融合過過程1 1）在高頻電流電場下的相互接觸。）在高頻電流電場下的相互接觸。2 2）脈沖刺激后）脈沖刺激后30s30s3)503)50秒后秒后4 4）1.51.5分鐘后分鐘后5 5）6 6分鐘后分鐘后6 6）1515分鐘后，原生質體融合完成。分鐘后，原生質體融合完成。優(yōu)點：優(yōu)點：融

60、合率高，達融合率高，達70708080，甚至，甚至100100可在顯微鏡下定向誘導細胞融合可在顯微鏡下定向誘導細胞融合可直接挑選雜種細胞可直接挑選雜種細胞重復性強、對原生質體傷害?。谎b置精巧、方便簡重復性強、對原生質體傷害??；裝置精巧、方便簡單；免去單；免去PEGPEG誘導后的洗滌過程、誘導過程可控制性誘導后的洗滌過程、誘導過程可控制性強等。強等。缺點缺點：必須購置專用的細胞電融合設備。：必須購置專用的細胞電融合設備。電融合儀電融合儀激光誘導細胞融合激光誘導細胞融合光鑷的原理光鑷的原理光鑷牽拉單細胞運動光鑷牽拉單細胞運動光鑷輔助細胞融合光鑷輔助細胞融合離子束誘導細胞融合離子束誘導細胞融合在離子