第三章細(xì)胞破碎與蛋白質(zhì)復(fù)性

1、第三章第三章 細(xì)胞破碎與蛋白質(zhì)復(fù)性細(xì)胞破碎與蛋白質(zhì)復(fù)性2022-6-26By liyun2CONTENT 細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu) 細(xì)胞破碎的方法 包含體的分離和蛋白質(zhì)的復(fù)性 Questions 為什么需要進(jìn)行細(xì)胞破碎？ 細(xì)胞破碎的方法？各自的原理？ 何為包含體？ 為什么需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的復(fù)性？蛋白質(zhì)復(fù)性的原理？問題1 為什么需要進(jìn)行細(xì)胞破碎？2022-6-26By liyun4細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎 微生物的代謝產(chǎn)物有的分泌在細(xì)胞外，也微生物的代謝產(chǎn)物有的分泌在細(xì)胞外，也有許多是存在于細(xì)胞內(nèi)部，例如大腸桿菌有許多是存在于細(xì)胞內(nèi)部，例如大腸桿菌表達(dá)的基因工程產(chǎn)物、某些酶制劑表達(dá)的基因工程產(chǎn)物、某些酶制劑(

2、(如青霉如青霉素酰化酶，堿性磷酸酯酶等素酰化酶，堿性磷酸酯酶等) )。 動物細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)物大多分泌在細(xì)胞外培動物細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)物大多分泌在細(xì)胞外培養(yǎng)液中。養(yǎng)液中。 植物細(xì)胞產(chǎn)物，多為胞內(nèi)物質(zhì)。植物細(xì)胞產(chǎn)物，多為胞內(nèi)物質(zhì)。2022-6-26By liyun5 對于胞外產(chǎn)物只需直接將發(fā)酵液預(yù)處理及對于胞外產(chǎn)物只需直接將發(fā)酵液預(yù)處理及過濾，獲得澄清的濾液，作為進(jìn)一步純化過濾，獲得澄清的濾液，作為進(jìn)一步純化的出發(fā)原液。的出發(fā)原液。 對于胞內(nèi)產(chǎn)物對于胞內(nèi)產(chǎn)物，則需首先收集菌體，然后，則需首先收集菌體，然后采用一定的方法，在一定程度上破壞細(xì)胞采用一定的方法，在一定程度上破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，設(shè)法使胞內(nèi)產(chǎn)物最大

3、程度地壁和細(xì)胞膜，設(shè)法使胞內(nèi)產(chǎn)物最大程度地釋放到液相中，破碎后的細(xì)胞漿液經(jīng)固液釋放到液相中，破碎后的細(xì)胞漿液經(jīng)固液分離除去細(xì)胞碎片后，再采用不同的分離分離除去細(xì)胞碎片后，再采用不同的分離手段進(jìn)一步純化。手段進(jìn)一步純化。 細(xì)胞破碎的細(xì)胞破碎的主要阻力來自于細(xì)胞壁主要阻力來自于細(xì)胞壁。破碎細(xì)胞意義提取其中的各種物質(zhì)，分析細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，遺傳物質(zhì)的研究，細(xì)胞破碎定義:細(xì)胞破碎就是采用一定的方法,在一定程度上破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜,設(shè)法使胞內(nèi)產(chǎn)物最大程度地釋放到液相中 問題2 細(xì)胞破碎容易嗎2022-6-26By liyun8細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu) 幾乎所有細(xì)菌的細(xì)胞壁都是由堅(jiān)固的骨架堅(jiān)固的骨架肽肽聚糖聚糖組成，是

4、聚糖鏈借短肽交聯(lián)而成借短肽交聯(lián)而成，使細(xì)胞具有一定的形狀和強(qiáng)度形狀和強(qiáng)度。 革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁較厚（1550 nm），肽聚糖占40一90，其余是多糖和磷壁酸 革蘭氏陰性菌的肽聚糖層較?。?.52.0nm），最外面還有一較厚的外壁層（810 nm），外壁層主要由脂蛋白，脂多糖組成。2022-6-26By liyun92022-6-26By liyun10細(xì)菌的細(xì)胞壁 破碎細(xì)菌的主要阻力是來自于肽聚糖的網(wǎng)肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)狀結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)結(jié)構(gòu)的致密程度和強(qiáng)度致密程度和強(qiáng)度取決于聚糖鏈上所存在的膚鍵的數(shù)量和其交聯(lián)膚鍵的數(shù)量和其交聯(lián)的程度的程度，如果交聯(lián)程度大，則網(wǎng)結(jié)構(gòu)就致密。 因此，革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁

5、比革蘭氏陰性菌堅(jiān)固，較難破碎2022-6-26By liyun11酵母的細(xì)胞壁 與細(xì)菌不同，酵母細(xì)胞壁的主要成分為葡聚糖與甘露聚糖以及蛋白質(zhì)等，比革蘭氏陽性菌稍厚。 面包酵母的細(xì)胞壁厚度約為70 nm，而且其厚度隨菌齡增加而增加。 與細(xì)菌細(xì)胞壁一樣，破碎酵母細(xì)胞壁的阻力主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和厚度2022-6-26By liyun122022-6-26By liyun13真菌的細(xì)胞壁 大多數(shù)真菌的多糖壁是由幾丁質(zhì)和葡聚糖構(gòu)成。主要存在三種聚合物，葡聚糖、幾丁質(zhì)以及糖蛋白。 與酵母和細(xì)菌的細(xì)胞壁一樣，真菌細(xì)胞壁的強(qiáng)度和聚合物的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有關(guān)，不僅如此，它還含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)，所

6、以強(qiáng)度有所提高。2022-6-26By liyun14，葡聚糖的混合物葡聚糖的混合物糖蛋白的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，將葡聚糖與糖蛋白的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，將葡聚糖與糖蛋白結(jié)合起來，糖蛋白結(jié)合起來，主要是蛋白質(zhì)主要是蛋白質(zhì)主要是幾丁質(zhì)，幾丁質(zhì)的微纖維主要是幾丁質(zhì)，幾丁質(zhì)的微纖維嵌入蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中。嵌入蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中。細(xì)菌幾乎所有細(xì)菌的細(xì)胞壁都是由肽聚糖（peptidoglycan）組成，它是難溶性的聚糖鏈（glycan chain），借助短肽交聯(lián)而成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，包圍在細(xì)胞周圍，使細(xì)胞具有一定的形狀和強(qiáng)度。短肽一般由四或五個胺基酸組成。而且短肽中常有D-胺基酸與二氨基庚二酸存在。 破碎細(xì)菌的主要阻力是來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，

7、其網(wǎng)結(jié)構(gòu)的致密程度和強(qiáng)度取決于聚糖鏈上所存在的肽鍵的數(shù)量和其交聯(lián)的程度，如果交聯(lián)程度大，則網(wǎng)結(jié)構(gòu)就致密。 酵母菌 酵母細(xì)胞壁的最里層是由葡聚糖的細(xì)纖維組成，它構(gòu)成了細(xì)胞壁的剛性骨架，使細(xì)胞具有一定的形狀，覆蓋在細(xì)纖維上面的是一層糖蛋白，最外層是甘露聚糖，由1,6一磷酸二酯鍵共價連接，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在該層的內(nèi)部，有甘露聚糖-酶的復(fù)合物，它可以共價連接到網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上，也可以不連接。與細(xì)菌細(xì)胞壁一樣，破碎酵母細(xì)胞壁的阻力主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度。 真菌 霉菌的細(xì)胞壁主要存在三種聚合物，葡聚糖，幾丁質(zhì)（以微纖維狀態(tài)存在）以及糖蛋白。最外層是-和-葡聚糖的混合物，第2層是糖蛋白的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，

8、葡聚糖與糖蛋白結(jié)合起來，第3層主要是蛋白質(zhì)，最內(nèi)層主要是幾丁質(zhì)，幾丁質(zhì)的微纖維嵌入蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中。與酵母和細(xì)菌的細(xì)胞壁一樣，真菌細(xì)胞壁的強(qiáng)度和聚合物的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有關(guān)，不僅如此，它還含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)，所以強(qiáng)度有所提高。 植物細(xì)胞 對于已生長結(jié)束的植物細(xì)胞壁可分為初生壁和次生壁兩部分。 在次生壁中，纖維素和半纖維素含量比初生壁增加很多，因此次生壁的形成提高了細(xì)胞壁的堅(jiān)硬性，使植物細(xì)胞具有很高的機(jī)械強(qiáng)度。目前已發(fā)展了多種細(xì)胞破碎方法，以便適應(yīng)不同用途和不同類型的細(xì)胞壁破碎。 破碎方法可規(guī)納為機(jī)械法和非機(jī)械法兩大類。 問題3 細(xì)胞破碎方法簡單嗎有目的的破碎不容易問題4 細(xì)胞破碎方法有哪些嗎2

9、022-6-26By liyun18機(jī)械法機(jī)械法非機(jī)械法非機(jī)械法破碎方法破碎方法高壓勻漿高壓勻漿珠磨法珠磨法超聲破碎超聲破碎滲透滲透干燥處理干燥處理酶溶法酶溶法化學(xué)法化學(xué)法凍結(jié)融化法凍結(jié)融化法細(xì)胞破碎技術(shù)2022-6-26By liyun192022-6-26By liyun20機(jī)械法 機(jī)械法主要運(yùn)用高壓高壓、研磨研磨或超聲波超聲波等手段在細(xì)胞壁上產(chǎn)生的剪切力達(dá)到破碎目的。 機(jī)械法處理量大，破碎速度較快。采用這些方法，細(xì)胞受到由高壓產(chǎn)生的高剪切力，但在大多數(shù)情況下要采取冷卻措施，以便除去由于消耗機(jī)械能而產(chǎn)生的過多熱量，防止生化物質(zhì)破壞。2022-6-26By liyun21球蘑機(jī)的粉碎球和機(jī)器

10、勻漿機(jī)組織粉碎機(jī)2022-6-26By liyun22球（珠）磨 研磨是常用的一種方法，它將細(xì)胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁一起快速攪拌或研磨，使達(dá)到細(xì)胞的某種程度破碎。 這些裝置的主要缺點(diǎn)是在破碎期間樣品溫度迅速升高，通過用二氧化碳來冷卻容器可得到部分解決。 珠體的大小應(yīng)根據(jù)細(xì)胞大小和濃度以及在連續(xù)流動的操作過程中不使珠體帶出來選擇， 珠體在磨室中的裝量影響破碎程度和所需能量，破碎面包酵母菌適宜的珠體裝量為80，珠體量的增加使熱擴(kuò)散性能降低而引起溫度升高。2022-6-26By liyun232022-6-26By liyun242022-6-26By liyun25高壓勻漿 利用高壓迫

11、使細(xì)胞懸浮液通過針形閥，由于突然減壓和高速沖擊撞擊環(huán)造成細(xì)胞破裂 高壓勻漿器是常用的設(shè)備，它由可產(chǎn)生高壓的正向排代泵和排出閥組成，排出閥具有狹窄的小孔，其大小可以調(diào)節(jié)。 細(xì)胞漿液通過止逆閥進(jìn)入泵體內(nèi)，在高壓下迫使其在排出閥的小孔中高速沖出，并射向撞擊環(huán)上，由于突然減壓和高速沖擊，使細(xì)胞受到高的液相剪切力而破碎。2022-6-26By liyun262022-6-26By liyun27 在操作方式上，可以采用單次通過勻漿器或多次循環(huán)通過等方式，也可連續(xù)操作。 為了控制溫度的升高，可在進(jìn)口處用干冰調(diào)節(jié)溫度，使出口溫度調(diào)節(jié)在20左右。 適用范圍：適用于酵母菌、大腸桿菌、巨大芽孢桿菌和黑曲霉等。不適

12、用于高度分枝的微生物。 如在工業(yè)規(guī)模的細(xì)胞破碎中，對于酵母等難破碎的及濃度高或處于生長靜止期的細(xì)胞，常采用多次循環(huán)的操作方法。2022-6-26By liyun28超聲波法 超聲波對細(xì)胞的破碎作用與液體中空穴的形成有關(guān)。當(dāng)超聲波在液體中傳播時，液體中的某一小區(qū)域交替重復(fù)地產(chǎn)生巨大的壓力和拉力；由于拉力的作用，產(chǎn)生一個極為強(qiáng)烈的沖擊波壓力，由它引起的黏滯性漩渦在懸浮細(xì)胞上造成了剪切應(yīng)力，促使其內(nèi)部液體發(fā)生流動，而使細(xì)胞破碎。 超聲波處理細(xì)胞懸浮液時，破碎作用受許多因素的影響，通常聲強(qiáng)和振幅影響很大，但強(qiáng)度太高易使蛋白質(zhì)變性，頻率的變化影響不明顯：此外介質(zhì)的離子強(qiáng)度、pH值、菌體的種類和濃度也有很

13、大的影響。2022-6-26By liyun29 桿菌比球菌易破碎，革蘭氏陰性菌細(xì)胞比革桿菌比球菌易破碎，革蘭氏陰性菌細(xì)胞比革蘭氏陽性菌易破碎，酵母菌效果較差。菌體蘭氏陽性菌易破碎，酵母菌效果較差。菌體濃度太高或介質(zhì)黏度高，均不利于超聲波破濃度太高或介質(zhì)黏度高，均不利于超聲波破碎。碎。 超聲波振蕩過程遇到的最大問題就是產(chǎn)生超聲波振蕩過程遇到的最大問題就是產(chǎn)生的熱量不容易驅(qū)散所以影響了它在大規(guī)模的熱量不容易驅(qū)散所以影響了它在大規(guī)模工業(yè)上的應(yīng)用，但在實(shí)驗(yàn)室和小規(guī)模生產(chǎn)中工業(yè)上的應(yīng)用，但在實(shí)驗(yàn)室和小規(guī)模生產(chǎn)中仍是一種很好的方法。仍是一種很好的方法。2022-6-26By liyun30非機(jī)械法非機(jī)械

14、法 非機(jī)械方法很多，包括非機(jī)械方法很多，包括 酶解、酶解、 滲透壓沖擊、滲透壓沖擊、 凍結(jié)和融化、凍結(jié)和融化、 干燥法和干燥法和 化學(xué)法溶胞等，化學(xué)法溶胞等， 其中酶法和化學(xué)法溶胞應(yīng)用最廣。其中酶法和化學(xué)法溶胞應(yīng)用最廣。2022-6-26By liyun31 1 1、酶解法、酶解法 酶解法是利用酶反應(yīng)，分解破壞細(xì)胞壁上持殊酶解法是利用酶反應(yīng)，分解破壞細(xì)胞壁上持殊的鍵，從而達(dá)到破碎目的。的鍵，從而達(dá)到破碎目的。 酶解的方法可以在細(xì)胞懸浮液中加入特定的酶，酶解的方法可以在細(xì)胞懸浮液中加入特定的酶，也可以采用自溶作用。也可以采用自溶作用。 酶解作用需要選擇適宜的酶和酶系統(tǒng)，并要控酶解作用需要選擇適宜

15、的酶和酶系統(tǒng)，并要控制特定的反應(yīng)條件，如溫度和制特定的反應(yīng)條件，如溫度和pHpH。某些微生物。某些微生物體可能僅在生長的某一階段或生長處于特定的體可能僅在生長的某一階段或生長處于特定的情況下，對酶解才是靈敏的。有時還需附加其情況下，對酶解才是靈敏的。有時還需附加其他的處理，如輻射、滲透壓沖擊、反復(fù)凍融或他的處理，如輻射、滲透壓沖擊、反復(fù)凍融或加金屬螯合劑加金屬螯合劑EDTAEDTA等，或者利用生物因素促使等，或者利用生物因素促使酶解作用敏感以獲得一定的效果。酶解作用敏感以獲得一定的效果。2022-6-26By liyun32 酶解法的優(yōu)點(diǎn)是發(fā)生酶解的條件溫和、能酶解法的優(yōu)點(diǎn)是發(fā)生酶解的條件溫和

16、、能選擇性地釋放產(chǎn)物、胞內(nèi)核酸等泄出量少、選擇性地釋放產(chǎn)物、胞內(nèi)核酸等泄出量少、細(xì)胞外形較完整、便于后步分離等；但酶細(xì)胞外形較完整、便于后步分離等；但酶水解價格高，故小規(guī)模應(yīng)用較廣。水解價格高，故小規(guī)模應(yīng)用較廣。2022-6-26By liyun33 2 2、自溶法、自溶法 利用生物體自身產(chǎn)生的酶來溶胞，而不需外加其利用生物體自身產(chǎn)生的酶來溶胞，而不需外加其他的酶。他的酶。 在微生物代謝過程中大多數(shù)都能產(chǎn)生一種能水解在微生物代謝過程中大多數(shù)都能產(chǎn)生一種能水解細(xì)胞壁上聚合物的酶，以便生長過程繼續(xù)下去，細(xì)胞壁上聚合物的酶，以便生長過程繼續(xù)下去，改變其生長環(huán)境，可誘發(fā)產(chǎn)生過剩的這種酶或激改變其生長環(huán)

17、境，可誘發(fā)產(chǎn)生過剩的這種酶或激發(fā)產(chǎn)生其他的自溶酶，以達(dá)到自溶目的。發(fā)產(chǎn)生其他的自溶酶，以達(dá)到自溶目的。 微生物細(xì)胞的自溶常采用微生物細(xì)胞的自溶常采用加熱法或干燥法。加熱法或干燥法。例如，例如，酵母細(xì)胞的自溶需在酵母細(xì)胞的自溶需在45455050溫度下保持溫度下保持121224h24h： 自溶法在一定程度上能用于工業(yè)規(guī)模，但對不穩(wěn)自溶法在一定程度上能用于工業(yè)規(guī)模，但對不穩(wěn)定的微生物容易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后定的微生物容易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后的細(xì)胞培養(yǎng)液過濾速度也會降低。的細(xì)胞培養(yǎng)液過濾速度也會降低。 2022-6-26By liyun34 采用抑制細(xì)胞壁合成的方法能導(dǎo)致類似于采用抑

18、制細(xì)胞壁合成的方法能導(dǎo)致類似于酶解的結(jié)果，某些抗生素如青霉素或環(huán)絲酶解的結(jié)果，某些抗生素如青霉素或環(huán)絲氨酸，能阻止新細(xì)胞壁物質(zhì)的合成。氨酸，能阻止新細(xì)胞壁物質(zhì)的合成。 抑制劑應(yīng)在發(fā)酵過程中細(xì)胞生長的后期加抑制劑應(yīng)在發(fā)酵過程中細(xì)胞生長的后期加入，只有當(dāng)抑制劑加入后，生物合成和再入，只有當(dāng)抑制劑加入后，生物合成和再生還在繼續(xù)進(jìn)行，溶胞的條件才是有利的。生還在繼續(xù)進(jìn)行，溶胞的條件才是有利的。這樣在細(xì)胞分裂階段，細(xì)胞壁就造成缺陷，這樣在細(xì)胞分裂階段，細(xì)胞壁就造成缺陷，即達(dá)到溶胞作用。但此法費(fèi)用很貴。即達(dá)到溶胞作用。但此法費(fèi)用很貴。2022-6-26By liyun35 3 3、滲透壓沖擊法、滲透壓沖擊

19、法 滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，將細(xì)胞放滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，將細(xì)胞放在高滲透壓的溶液中在高滲透壓的溶液中( (如一定濃度的甘油或蔗糖溶如一定濃度的甘油或蔗糖溶液液) )，由于滲透壓的作用，細(xì)胞內(nèi)水分便向外滲，由于滲透壓的作用，細(xì)胞內(nèi)水分便向外滲出細(xì)胞發(fā)生收縮，達(dá)到平衡后，將介質(zhì)快速稀出細(xì)胞發(fā)生收縮，達(dá)到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突釋或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，胞外的水迅速滲入胞內(nèi)，引起細(xì)胞快速然變化，胞外的水迅速滲入胞內(nèi)，引起細(xì)胞快速膨脹而破裂。膨脹而破裂。 滲透壓沖擊的方法僅對較脆弱的細(xì)腦壁，或者細(xì)滲透壓沖擊的方法僅對

20、較脆弱的細(xì)腦壁，或者細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理、或胞壁合成受抑制、強(qiáng)度減胞壁預(yù)先用酶處理、或胞壁合成受抑制、強(qiáng)度減弱時才是合適的。弱時才是合適的。2022-6-26By liyun36 4 4、凍結(jié)、凍結(jié)- -融化法融化法 將細(xì)胞放在低溫下冷凍將細(xì)胞放在低溫下冷凍( (約約-15)-15)，然后在，然后在室溫中融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。室溫中融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。 由于冷凍，一方面能使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)由于冷凍，一方面能使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加細(xì)胞的親水性能：另一方面破裂，從而增加細(xì)胞的親水性能：另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，形成冰晶粒，引起細(xì)胞膨脹而胞內(nèi)水結(jié)晶，形成冰晶粒，引起細(xì)胞膨脹而

21、破裂。破裂。 對于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，可采用此法。但對于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，可采用此法。但通常破碎率很低，即使反復(fù)多次也不能提高通常破碎率很低，即使反復(fù)多次也不能提高收率。另外，還可能引起對凍融敏感的某些收率。另外，還可能引起對凍融敏感的某些蛋白質(zhì)的變性。蛋白質(zhì)的變性。2022-6-26By liyun37 5 5、干燥法、干燥法 經(jīng)干燥后的細(xì)胞，其細(xì)胞膜的滲透性發(fā)生變經(jīng)干燥后的細(xì)胞，其細(xì)胞膜的滲透性發(fā)生變化，同時部分菌體會產(chǎn)生自溶然后用丙酮、化，同時部分菌體會產(chǎn)生自溶然后用丙酮、丁醇或緩沖液等溶劑處理時，胞內(nèi)物質(zhì)就會被丁醇或緩沖液等溶劑處理時，胞內(nèi)物質(zhì)就會被抽提出來。抽提出來。 干燥法的操作

22、可分空氣干燥，真空干燥，噴霧干燥法的操作可分空氣干燥，真空干燥，噴霧干燥和冷凍干燥等。干燥和冷凍干燥等。 干燥法條件變化較劇烈，容易引起蛋白質(zhì)或其干燥法條件變化較劇烈，容易引起蛋白質(zhì)或其他組織變性。他組織變性。2022-6-26By liyun38 空氣干燥主要適用于酵母菌，一般在空氣干燥主要適用于酵母菌，一般在25253030的熱氣流中映干，然后用水、緩沖液的熱氣流中映干，然后用水、緩沖液或其他溶劑抽提?？諝飧稍飼r，部分酵母或其他溶劑抽提。空氣干燥時，部分酵母可能產(chǎn)生自溶，所以較冷凍干燥、噴霧干可能產(chǎn)生自溶，所以較冷凍干燥、噴霧干燥容易抽提。燥容易抽提。 真空干燥適用于細(xì)菌的干燥，把干燥成塊

23、真空干燥適用于細(xì)菌的干燥，把干燥成塊的菌體磨碎再進(jìn)行抽提。的菌體磨碎再進(jìn)行抽提。 冷凍干燥適用于不穩(wěn)定的生化物質(zhì)，在冷冷凍干燥適用于不穩(wěn)定的生化物質(zhì)，在冷凍條件下磨成粉，再用緩沖液抽提。凍條件下磨成粉，再用緩沖液抽提。2022-6-26By liyun39 6 6、化學(xué)法、化學(xué)法 常用酸、堿、表面活性劑和有機(jī)溶劑等化常用酸、堿、表面活性劑和有機(jī)溶劑等化學(xué)試劑。學(xué)試劑。 酸處理可以使蛋白質(zhì)水解成氨基酸，通常酸處理可以使蛋白質(zhì)水解成氨基酸，通常采用采用6mol6molL HClL HCl。 堿和表面活性劑能溶解細(xì)胞壁上脂類物質(zhì)堿和表面活性劑能溶解細(xì)胞壁上脂類物質(zhì)或使某些組分從細(xì)胞內(nèi)滲漏出來。或使某

24、些組分從細(xì)胞內(nèi)滲漏出來。 天然的表面活性劑有膽酸鹽和磷脂等。合天然的表面活性劑有膽酸鹽和磷脂等。合成的表面活性劑可分離子型和非離子型，成的表面活性劑可分離子型和非離子型，離子型如十二烷基硫酸鈉離子型如十二烷基硫酸鈉(SDS(SDS，陰離子型，陰離子型) )；十六烷基三甲基溴化銨十六烷基三甲基溴化銨( (陽離子型陽離子型) ) 。在一。在一定條件下，表面活性劑能與脂蛋白結(jié)定條件下，表面活性劑能與脂蛋白結(jié)合形成微泡，使膜的通透性增加或使其合形成微泡，使膜的通透性增加或使其溶解。溶解。2022-6-26By liyun40 天然的表面活性劑有膽酸鹽和磷脂等。天然的表面活性劑有膽酸鹽和磷脂等。合成的表

25、面活性劑可分離子型和非離合成的表面活性劑可分離子型和非離子型，離子型如十二烷基硫酸鈉子型，離子型如十二烷基硫酸鈉(SDS(SDS，陰離子型陰離子型) )；十六烷基三甲基溴化銨；十六烷基三甲基溴化銨( (陽離子型陽離子型) ) 。在一定條件下，表面活。在一定條件下，表面活性劑能與脂蛋白結(jié)合形成微泡，使性劑能與脂蛋白結(jié)合形成微泡，使膜的通透性增加或使其溶解。膜的通透性增加或使其溶解。 有機(jī)溶劑可采用丁酸、丁酵、丙酮、氯仿有機(jī)溶劑可采用丁酸、丁酵、丙酮、氯仿和甲苯等。這些脂溶性有機(jī)溶劑能溶解細(xì)和甲苯等。這些脂溶性有機(jī)溶劑能溶解細(xì)胞壁的磷脂層，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞。胞壁的磷脂層，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞。 2022-

26、6-26By liyun41 化學(xué)法和酶法一樣也存在對產(chǎn)物的釋出選擇性好，化學(xué)法和酶法一樣也存在對產(chǎn)物的釋出選擇性好，細(xì)胞外形較完整、碎片少、核酸等胞內(nèi)雜質(zhì)釋放細(xì)胞外形較完整、碎片少、核酸等胞內(nèi)雜質(zhì)釋放少，便于后步分離等優(yōu)點(diǎn)，故使用較多。少，便于后步分離等優(yōu)點(diǎn)，故使用較多。但該法但該法容易引起活性物質(zhì)失活破壞，因此根據(jù)生化物質(zhì)容易引起活性物質(zhì)失活破壞，因此根據(jù)生化物質(zhì)的穩(wěn)定性來選擇合適的化學(xué)試劑和操作條件是非的穩(wěn)定性來選擇合適的化學(xué)試劑和操作條件是非常重要的。常重要的。 另外，化學(xué)試劑的加入，常會給隨后產(chǎn)物的純化另外，化學(xué)試劑的加入，常會給隨后產(chǎn)物的純化帶來困難，并影響最終產(chǎn)物純度。如表面活性

27、劑帶來困難，并影響最終產(chǎn)物純度。如表面活性劑存在常會影響鹽析中蛋白質(zhì)的沉淀和疏水層析，存在常會影響鹽析中蛋白質(zhì)的沉淀和疏水層析，因此必須注意除去。因此必須注意除去。問題5 各個方法那個好？2022-6-26By liyun43 高壓勻漿和珠磨兩種機(jī)械破碎方法，處理量大，高壓勻漿和珠磨兩種機(jī)械破碎方法，處理量大，速度非?？欤壳霸诠I(yè)生長上應(yīng)用最廣泛。但速度非常快，目前在工業(yè)生長上應(yīng)用最廣泛。但在機(jī)械法破碎過程中，容易產(chǎn)生大量的熱量，使在機(jī)械法破碎過程中，容易產(chǎn)生大量的熱量，使料液溫度升高，而易造成生化物質(zhì)的破壞，特別料液溫度升高，而易造成生化物質(zhì)的破壞，特別是在超聲波處理時。因此，超聲波振蕩法

28、主要適是在超聲波處理時。因此，超聲波振蕩法主要適用于實(shí)驗(yàn)室或小規(guī)模的細(xì)胞破碎。用于實(shí)驗(yàn)室或小規(guī)模的細(xì)胞破碎。 非機(jī)械法一般僅適用于小規(guī)模應(yīng)用。滲透壓沖擊非機(jī)械法一般僅適用于小規(guī)模應(yīng)用。滲透壓沖擊和凍結(jié)融解法都屬于較溫和的方法，但破碎作和凍結(jié)融解法都屬于較溫和的方法，但破碎作用較弱。它們常與酶解法結(jié)合起來使用，提高破用較弱。它們常與酶解法結(jié)合起來使用，提高破碎效果。碎效果。干燥法屬于較激烈干燥法屬于較激烈的一種破碎方法，容的一種破碎方法，容易引起蛋白質(zhì)或其它組分變性易引起蛋白質(zhì)或其它組分變性. . 2022-6-26By liyun442022-6-26By liyun45選擇破碎方法的依據(jù)選擇

29、破碎方法的依據(jù) 機(jī)械法依靠專用設(shè)備，利用機(jī)械力的作用將細(xì)胞機(jī)械法依靠專用設(shè)備，利用機(jī)械力的作用將細(xì)胞切碎，所以細(xì)胞碎片細(xì)小、胞內(nèi)物質(zhì)一般都全部切碎，所以細(xì)胞碎片細(xì)小、胞內(nèi)物質(zhì)一般都全部釋放，故細(xì)胞漿液中核酸、雜蛋內(nèi)等含量高，料釋放，故細(xì)胞漿液中核酸、雜蛋內(nèi)等含量高，料液黏度大，給固液分離帶來較大困難；但也具有液黏度大，給固液分離帶來較大困難；但也具有很多優(yōu)點(diǎn)，如設(shè)備通用性強(qiáng)，破碎效率高，操作很多優(yōu)點(diǎn)，如設(shè)備通用性強(qiáng)，破碎效率高，操作時間短，成本低，大多數(shù)方法都適合時間短，成本低，大多數(shù)方法都適合大規(guī)模工業(yè)大規(guī)模工業(yè)化化等。等。 非機(jī)械法是利用化學(xué)試劑或物理因素等來破壞局非機(jī)械法是利用化學(xué)試劑或

30、物理因素等來破壞局部的細(xì)胞壁或提高壁的通透性，故細(xì)胞破碎率低，部的細(xì)胞壁或提高壁的通透性，故細(xì)胞破碎率低，胞內(nèi)物質(zhì)釋放的胞內(nèi)物質(zhì)釋放的選擇性好選擇性好，固液分離容易。但往，固液分離容易。但往往破碎率較低，耗費(fèi)時間長，某些方法成本高，往破碎率較低，耗費(fèi)時間長，某些方法成本高，一般僅適合小規(guī)模一般僅適合小規(guī)模。2022-6-26By liyun46 1 1、細(xì)胞的處理量細(xì)胞的處理量：若具大規(guī)模應(yīng)用前景的，則采：若具大規(guī)模應(yīng)用前景的，則采用機(jī)械法。若僅需實(shí)驗(yàn)室規(guī)模則選非機(jī)械法。用機(jī)械法。若僅需實(shí)驗(yàn)室規(guī)模則選非機(jī)械法。 2 2、細(xì)胞壁的強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)、細(xì)胞壁的強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)：細(xì)胞壁的強(qiáng)度除取決于：細(xì)胞壁的強(qiáng)度

31、除取決于網(wǎng)狀高聚物結(jié)構(gòu)的交聯(lián)程度外，還取決于構(gòu)成壁網(wǎng)狀高聚物結(jié)構(gòu)的交聯(lián)程度外，還取決于構(gòu)成壁的聚合物種類和壁的厚度，如酵母和真菌的細(xì)胞的聚合物種類和壁的厚度，如酵母和真菌的細(xì)胞壁與細(xì)菌相比，含纖維素和幾丁質(zhì)強(qiáng)度較高，壁與細(xì)菌相比，含纖維素和幾丁質(zhì)強(qiáng)度較高，故在選用高壓勻漿法時，后者就比較容易破碎。故在選用高壓勻漿法時，后者就比較容易破碎。某些植物細(xì)胞纖維化程度大、纖維層厚、強(qiáng)度很某些植物細(xì)胞纖維化程度大、纖維層厚、強(qiáng)度很高，破碎也較因難。高，破碎也較因難。 在機(jī)械法破碎中，破碎的難易程度還與細(xì)胞的形在機(jī)械法破碎中，破碎的難易程度還與細(xì)胞的形狀和大小有關(guān)，如高壓勻漿法對酵母菌、大腸桿狀和大小有關(guān)

32、，如高壓勻漿法對酵母菌、大腸桿菌、巨大芽孢桿菌和黑曲霉等微生物細(xì)胞都能很菌、巨大芽孢桿菌和黑曲霉等微生物細(xì)胞都能很好適用，但對某些高度分枝的微生物，由于會堵好適用，但對某些高度分枝的微生物，由于會堵塞勻漿器閥而不能適用。塞勻漿器閥而不能適用。2022-6-26By liyun47 在采用化學(xué)法和酶法破碎時更應(yīng)根據(jù)細(xì)胞的結(jié)在采用化學(xué)法和酶法破碎時更應(yīng)根據(jù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和組成選擇不同的化學(xué)試劑或酶，這主要是因構(gòu)和組成選擇不同的化學(xué)試劑或酶，這主要是因?yàn)樗鼈冏饔玫膶Ｒ恍院軓?qiáng)。為它們作用的專一性很強(qiáng)。 3 3、目標(biāo)產(chǎn)物對破碎條件的敏感性：、目標(biāo)產(chǎn)物對破碎條件的敏感性： 生化物質(zhì)通常穩(wěn)定性較差，在決定破碎條

33、件時，生化物質(zhì)通常穩(wěn)定性較差，在決定破碎條件時，既要有高的釋放率，又必須確保其穩(wěn)定。例如在既要有高的釋放率，又必須確保其穩(wěn)定。例如在采用機(jī)械法破碎時，要考慮剪切力的影響；在選采用機(jī)械法破碎時，要考慮剪切力的影響；在選擇酶解法時，應(yīng)考慮酶對目標(biāo)產(chǎn)物是否具有降解擇酶解法時，應(yīng)考慮酶對目標(biāo)產(chǎn)物是否具有降解作用；在選擇有機(jī)溶劑或表面活性劑時，要考慮作用；在選擇有機(jī)溶劑或表面活性劑時，要考慮不能使蛋白質(zhì)變性。此外，破碎過程中溶液的不能使蛋白質(zhì)變性。此外，破碎過程中溶液的pHpH、溫度、作用時間等都是重要的影響因素。溫度、作用時間等都是重要的影響因素。2022-6-26By liyun48 4 4、破碎程

34、度：細(xì)胞破碎后的固液分離往往、破碎程度：細(xì)胞破碎后的固液分離往往是一個突出要解決的問題，機(jī)械法破碎是一個突出要解決的問題，機(jī)械法破碎( (如如 高壓勻漿法高壓勻漿法) )常會使細(xì)胞碎片變得很細(xì)小，常會使細(xì)胞碎片變得很細(xì)小，固液分離就困難，因此操作條件的控制很固液分離就困難，因此操作條件的控制很重要。重要。 適宜的操作條件應(yīng)從高的產(chǎn)物釋放率，低適宜的操作條件應(yīng)從高的產(chǎn)物釋放率，低的能耗和便于后步提取這三方面進(jìn)行權(quán)衡。的能耗和便于后步提取這三方面進(jìn)行權(quán)衡。包含體的分離與蛋白質(zhì)復(fù)性2022-6-26By liyun50問題1 包含體為何？ 包含體包含體（inclusion bodies） 是無定形的

35、蛋白質(zhì)的聚集，不被任何膜所包圍。細(xì)胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致密，低速離心就可以沉淀。包含體難溶于水中，在變性劑溶液（如鹽酸胍、脲）中才能溶解。在這些溶液中，溶解的蛋白質(zhì)呈變性狀態(tài)，即所有的氫鍵、疏水疏水鍵鍵全被破壞，疏水側(cè)鏈完全暴露，但一級結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)和共價鍵不被破壞。因此當(dāng)除去變性劑時，一部分蛋白質(zhì)可以自動折疊成具有活性的正確構(gòu)型構(gòu)型，這一折疊過程稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性。 折疊構(gòu)造的破壞包含體主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中大多是基因表達(dá)產(chǎn)物。這些基因表達(dá)產(chǎn)物沒有生物活性。為此，欲獲得天然活性態(tài)的目標(biāo)產(chǎn)物，必需分離包含體后，溶解包含體并使其中的目標(biāo)蛋白恢復(fù)應(yīng)有的天然活性。所以，包含體的出現(xiàn)不僅增加了生化工

36、程師生物分離設(shè)計的難度，也為生物化學(xué)家的蛋白質(zhì)折疊（protein folding）機(jī)理研究提出了新的課題。問題2 包含體有何用？2022-6-26By liyun52包含體的分離與蛋白質(zhì)復(fù)性 重組DNA技術(shù)為大規(guī)模生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)提供了嶄新的途徑，開辟了現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展的新紀(jì)元。 基因工程技術(shù)為大規(guī)模生產(chǎn)目標(biāo)蛋白提供了新途徑。但是，分離純化基因工程產(chǎn)品經(jīng)常會遇到產(chǎn)生包含體的問題。 很多利用大腸桿菌為宿主細(xì)胞的外源基因表達(dá)產(chǎn)物（如尿激酶、人胰島素、人生長激素、白細(xì)胞介素、人干擾素等）不僅不能分泌到細(xì)胞外、而且在細(xì)胞內(nèi)凝聚成沒有生物活性的固體顆粒包含體（ inclusion bodies IBs)

37、2022-6-26By liyun532022-6-26By liyun54 包含體主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成包含體主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中大部分是基因表達(dá)產(chǎn)物，其中大部分是基因表達(dá)產(chǎn)物，其一級結(jié)構(gòu)正確，立體結(jié)構(gòu)錯誤，非活性。含有微量的質(zhì)其一級結(jié)構(gòu)正確，立體結(jié)構(gòu)錯誤，非活性。含有微量的質(zhì)粒、粒、rRNA和和RNA聚合酶，包含體顆粒直徑約聚合酶，包含體顆粒直徑約0130m，隨表達(dá)產(chǎn)物而異。，隨表達(dá)產(chǎn)物而異。 一般說來包含體顆粒包裹的并不一定都是表達(dá)產(chǎn)物，也可一般說來包含體顆粒包裹的并不一定都是表達(dá)產(chǎn)物，也可能含有其它雜質(zhì)，如核酸、脂類、雜蛋白等，這主要取決能含有其它雜質(zhì)，如核酸、脂類、雜蛋白等，這主要取決于

38、表達(dá)體系。于表達(dá)體系。2022-6-26By liyun55 包含體中大多是基因表達(dá)產(chǎn)物。這些 基因表達(dá)產(chǎn)物的一級結(jié)構(gòu)是正確的，但立體結(jié)構(gòu)是錯誤的，所以沒有生物活性。為此，欲獲得天然活性態(tài)的目標(biāo)產(chǎn)物，必需分離包含體后，溶解包含體并使其中的目標(biāo)蛋白恢復(fù)應(yīng)有的天然活性。 大腸桿菌的包含體是圓柱型，比較堅(jiān)硬，一般水溶液很難將其溶解，只有在變性溶液（鹽酸胍、脲）中才能溶解，并使蛋白呈變性狀態(tài)，所有氫鍵、疏水鍵被破壞）疏水側(cè)鏈完全暴露，但一級結(jié)構(gòu)和共價鍵未破壞。2022-6-26By liyun56 包含體形成機(jī)理 Mitriki &King認(rèn)為包含體的形成是外源蛋白質(zhì)在產(chǎn)生的過程中，由于周圍的

39、物理環(huán)境（如溫度）不適或者缺少某種協(xié)助因子，難以連續(xù)形成次級鍵，由中間產(chǎn)物相互凝聚而積累成包含體。 大多數(shù)情況下，包含體的形成是蛋白質(zhì)過量表達(dá)的結(jié)果，而與蛋白質(zhì)種類和表達(dá)系統(tǒng)無關(guān)。2022-6-26By liyun57外源蛋白在大腸桿菌中的積累2022-6-26By liyun58 以包含體表達(dá)重組蛋白的優(yōu)勢以包含體表達(dá)重組蛋白的優(yōu)勢 1、包含體蛋白質(zhì)主要在以大腸桿菌為宿主細(xì)胞的原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中形成，而大腸桿菌生長速度快，易于高密度培養(yǎng)，有利于大規(guī)模生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì) 2、包含體是在過表達(dá)的情況下產(chǎn)生的，因此一般包含體蛋白質(zhì)的表達(dá)量都很高。 3、包含體富含母的基因表達(dá)產(chǎn)物，有利于后續(xù)的分離純化

40、4、沉積于包含體內(nèi)的目標(biāo)蛋白質(zhì)不易被蛋白酶水解 5、對于那些對宿主細(xì)胞有毒害作用或殺傷作用的目的基因表達(dá)產(chǎn)物，以包含體形式表達(dá)是最可取的表達(dá)生產(chǎn)途徑問題3 包含體如何成為可用之物蛋白質(zhì)的復(fù)性分離包含體并復(fù)性蛋白質(zhì)此的操作步驟并不復(fù)雜，從破碎細(xì)胞開始，然后將細(xì)胞勻漿離心，回收包含體后，加入變性劑溶解包含體，使之成為可溶性伸展態(tài)，再除去變性劑使表達(dá)產(chǎn)物折疊恢復(fù)天然構(gòu)象及活性。 膠原蛋白2022-6-26By liyun61蛋白質(zhì)的復(fù)性 包含體難溶于水中，在變性劑溶液（如鹽酸胍、脲）中才能溶解。 在這些溶液中，溶解的蛋白質(zhì)呈變性狀態(tài)，即所有的氫鍵、疏水鍵全被破壞，疏水側(cè)鏈完全暴露，但一級結(jié)構(gòu)和共價鍵

41、不被破壞。因此當(dāng)除去變性劑時，一部分蛋白質(zhì)可以自動折疊成具有活性的正確構(gòu)型，這一折疊過程稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性。2022-6-26By liyun62包含體分離和蛋白質(zhì)復(fù)性方法包含體分離和蛋白質(zhì)復(fù)性方法 包含體的分離從細(xì)胞破碎開始。 除去變性劑使表達(dá)產(chǎn)物再折疊成正確構(gòu)型，恢復(fù)天然構(gòu)型，這一折疊稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性蛋白質(zhì)的復(fù)性。 要分離出有活性的蛋白，一般要經(jīng)歷下列步驟：細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎離心分離離心分離包含體包含體溶解包含體溶解包含體目標(biāo)產(chǎn)物的目標(biāo)產(chǎn)物的構(gòu)型復(fù)性構(gòu)型復(fù)性2022-6-26By liyun63幾種常見的工藝路線（一）機(jī)械破碎機(jī)械破碎( (高壓勻漿、高速珠磨）高壓勻漿、高速珠磨）離心提取出包含

42、體離心提取出包含體加變性劑溶解加變性劑溶解除變性劑復(fù)性除變性劑復(fù)性包含體分離工藝比較復(fù)雜，其中包含一系列的固液分離過程。采用的工藝有：2022-6-26By liyun64 特點(diǎn): 利用了包含體與細(xì)胞碎片的密度差，用離心法將包含體與細(xì)胞碎片和可溶性蛋白質(zhì)分開，獲得比較純的包含體，再對包含體溶解復(fù)性。（利于純化后處理） 優(yōu)點(diǎn)： 目標(biāo)產(chǎn)物不含大量的雜蛋白、核酸、熱源、內(nèi)毒素等雜質(zhì)，使后面分離純化簡單。 缺點(diǎn)：要經(jīng)過幾次離心才能除去大部分細(xì)胞碎片，加工時間長。2022-6-26By liyun65幾種常見的工藝路線（二）機(jī)械破碎機(jī)械破碎膜分離除可溶性蛋白膜分離除可溶性蛋白加變性劑溶解包含體加變性劑溶

43、解包含體除變性劑復(fù)性除變性劑復(fù)性2022-6-26By liyun66 特點(diǎn)： 應(yīng)用了膜分離技術(shù)，用微孔膜除去可溶性蛋白質(zhì)，但細(xì)胞碎片卻和包含體一起被膜擋住，難以分開；而且膜的堵塞和濃差極化常常導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)的滯留，因此這條路線的問題比較多。優(yōu)點(diǎn)：膜分離的優(yōu)點(diǎn)是封閉式操作，不污染環(huán)境也不受環(huán)境污染，能量消耗也比離心法少。缺點(diǎn)：細(xì)胞碎片和包含體難以分開； 膜的堵塞和濃縮極化常常導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)的滯留。2022-6-26By liyun67幾種常見的工藝路線（三）化學(xué)破碎（加變性劑）離心除細(xì)胞碎片）離心除細(xì)胞碎片）除變性劑復(fù)性除變性劑復(fù)性2022-6-26By liyun68 化學(xué)破碎、溶解包含體(加變性劑) 離心除細(xì)胞碎片 除去變性劑復(fù)性 特點(diǎn)： 采用化學(xué)法破碎細(xì)胞，所采用的變性劑既可以破碎細(xì)胞又可以溶解包含體，將兩道工序合為一道，節(jié)省設(shè)備和時間，比較適于實(shí)驗(yàn)室操作。 缺點(diǎn)是所有的可溶性雜質(zhì)都未被除去，混于目標(biāo)產(chǎn)物中，后續(xù)分離困難。2022-6-26By liyun69蛋白質(zhì)的最常用的復(fù)性方法 1.稀釋復(fù)性與透析復(fù)性 溶液