生物農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)教案2011

1、生物農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)金晨鐘主編譚顯勝湖南人文科技學(xué)院生命科學(xué)系農(nóng)學(xué)教研室2011年9月前言 生物農(nóng)藥（biopesticides），按照Copping和Menn的定義包含活體微生物（病毒、細(xì)菌、真菌），昆蟲(chóng)致病線蟲(chóng)，植物源農(nóng)藥，微生物農(nóng)藥，微生物次生代謝物質(zhì)（抗生素），昆蟲(chóng)信息素，用于表達(dá)抗蟲(chóng)、抗病、抗病毒、耐除草劑的基因以及昆蟲(chóng)天敵。生物農(nóng)藥的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)是對(duì)人類(lèi)健康威脅小，對(duì)環(huán)境安全。這正是全社會(huì)最關(guān)心的問(wèn)題之一。進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，各國(guó)政府和民眾更加重視生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，生物農(nóng)藥在整個(gè)農(nóng)藥市場(chǎng)的份額正在逐年上升。我國(guó)的天然藥物資源十分豐富，為了發(fā)現(xiàn)新的活性成分，尋找新的藥物，就必須首先從復(fù)雜

2、的藥物成分中提取出有活性的單體成分，以期為新農(nóng)藥合成提供先導(dǎo)化合物。因此，正確掌握提取分離的實(shí)驗(yàn)操作以及熟悉快速、有效的新的提取分離技術(shù)在分離目的化合物中就顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)書(shū)共分三部分。第一部分是有效成分的提取。內(nèi)容主要包括溶劑提取法（回流提取、索氏提?。┖退魵庹麴s法，重點(diǎn)介紹了溶劑提取法的原理和如何選擇溶劑，要求掌握回流提取、索氏提取裝置和水流氣蒸餾裝置的正確應(yīng)用。第二部分主要介紹有效成分的初步分離及其化學(xué)成分預(yù)測(cè)試。內(nèi)容主要包括薄層層析分離法和有效成分化學(xué)預(yù)試驗(yàn)方法，要求掌握薄層層析板的制備和正確應(yīng)用各種分離方法。第三部分是有效成分的生物測(cè)定。內(nèi)容包括生物殺蟲(chóng)劑的生物測(cè)定方法（

3、為了突出與化學(xué)農(nóng)藥的區(qū)別，這里主要介紹驅(qū)避、拒食等作用方式的測(cè)定方法）、生物農(nóng)藥殺菌劑生物測(cè)定方法（孢子萌發(fā)法和生長(zhǎng)速率測(cè)定法）、生物農(nóng)藥抗植物病毒劑（以抗煙草花葉病毒TMV為例）和生物農(nóng)藥除草劑生物測(cè)定方法。生物農(nóng)藥是一門(mén)專業(yè)性很強(qiáng)的學(xué)科交叉課程，學(xué)好生物農(nóng)藥，需要同時(shí)具備農(nóng)學(xué)、生物學(xué)和化學(xué)等方面的知識(shí)。根據(jù)此門(mén)課程的特點(diǎn)，結(jié)合本科生教學(xué)特點(diǎn)的需要，我們編寫(xiě)了此實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)。編者2011年9月實(shí)驗(yàn)須知一、牢固樹(shù)立“安全第一”的思想1、實(shí)驗(yàn)前應(yīng)充分預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，了解實(shí)驗(yàn)所用藥品的性能及危害和注意事項(xiàng)。2、實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)應(yīng)該注意儀器是否完好無(wú)損，裝置力求正確穩(wěn)妥，嚴(yán)格遵守操作規(guī)程及實(shí)驗(yàn)條件，未經(jīng)指導(dǎo)老

4、師允許不得擅自改變。3、保持臺(tái)面整齊清潔，不得將與實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)的儀器、書(shū)籍、雜物等堆放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。4、禁止在實(shí)驗(yàn)室吸煙、飲水或吃東西。不得在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中看其它書(shū)籍、聽(tīng)廣播、玩手機(jī)、大聲說(shuō)笑、會(huì)客等與實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)的活動(dòng)。5、易燃、易揮發(fā)物品不得放在敞口容器中加熱。6、實(shí)驗(yàn)進(jìn)行當(dāng)中不得擅自離開(kāi)操作臺(tái)，如必須暫時(shí)離開(kāi)，應(yīng)托付他人照看。7、廢酸、廢渣、廢紙等均應(yīng)倒入廢液缸中，不得倒入水槽。8、要熟悉安全用具如滅火器、砂桶等的放置地點(diǎn)及使用方法。9、最后離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室者應(yīng)負(fù)責(zé)檢查實(shí)驗(yàn)室的水、電、門(mén)、窗、通風(fēng)設(shè)備是否關(guān)好。二、事故的預(yù)防和急救1、爆炸和火災(zāi)（1）易燃?xì)怏w或易燃溶劑的蒸汽在空氣中混合到一定比例時(shí)，遇到明火

5、、電火花、靜電摩擦都會(huì)引起爆炸。因此，實(shí)驗(yàn)中要有良好的通風(fēng)；傾倒和量取易燃液體均應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行，遠(yuǎn)離火源；不得用敞口容器加熱、盛裝、或蒸除有機(jī)溶劑；冷凝水要保持暢通；或進(jìn)行攪拌或加入沸。（2）儀器內(nèi)壓力過(guò)高造成爆炸。常壓操作時(shí)，應(yīng)使全套裝置通大氣，切勿造成密閉體系；減壓蒸餾時(shí)，要用圓底燒瓶作接受器，不可用錐形瓶。如一旦發(fā)生火災(zāi)，切不可驚慌失措，應(yīng)保持冷靜，采取措施滅火立即報(bào)告指導(dǎo)教師，切斷電源，選擇適當(dāng)?shù)臏缁鹌鞑摹?、中毒許多化學(xué)溶劑都有不同程度的毒性，濺入口中立即用大量水沖洗。腐蝕性毒物：對(duì)于強(qiáng)酸，先用大量水沖洗，然后服用氫氧化鈉鋁膏、雞蛋白；對(duì)于強(qiáng)堿也應(yīng)先用大量的水，然后服用醋、酸果汁、

6、雞蛋白。刺激性及神經(jīng)性毒物：先給牛奶或雞蛋白沖淡，再給如硫酸鎂催吐，立即送醫(yī)院。3、外傷與急救割傷：發(fā)生原因通常都是因玻璃折斷所傷。一旦割傷，用蒸餾水洗凈傷口，貼上創(chuàng)可貼或涂上紅藥水。燙傷或被火燒傷：輕傷可用苦味酸飽和溶液洗滌后涂以硼酸、凡士林或燙傷膏。化學(xué)試劑灼傷：皮膚被酸或堿灼傷，先用大量水沖洗，然后分別用3%碳酸氫鈉或硼酸溶液洗滌。4、安全用電使用電器時(shí)，應(yīng)防止人體和電器導(dǎo)電部位接觸，不能用濕手接觸電源插頭；如發(fā)現(xiàn)儀器有漏電，打火花等現(xiàn)象時(shí)，立即斷開(kāi)電源進(jìn)行檢修。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)及時(shí)斷開(kāi)電源。目 錄實(shí)驗(yàn)一 生物農(nóng)藥中有效成分提取之溶劑提取法索氏提取.2實(shí)驗(yàn)二 生物農(nóng)藥中有效成分提取之溶劑提

7、取法回流提取.4實(shí)驗(yàn)三 生物農(nóng)藥中有效成分的提取方法水蒸氣蒸餾法.6實(shí)驗(yàn)四 生物農(nóng)藥有效成分的分離萃取法（LLE）.9實(shí)驗(yàn)五 生物農(nóng)藥有效成分的分離薄層層析法（TLC）.11實(shí)驗(yàn)六 植物提取物化學(xué)成分預(yù)試驗(yàn).13實(shí)驗(yàn)七 用薄層層析法測(cè)定蔬菜中生物農(nóng)藥的殘留量.16實(shí)驗(yàn)八 生物殺蟲(chóng)劑對(duì)小菜蛾的毒力測(cè)定.20實(shí)驗(yàn)九 生物殺蟲(chóng)劑對(duì)韭菜遲眼蕈蚊幼蟲(chóng)的毒力測(cè)定.22實(shí)驗(yàn)十 生物殺蟲(chóng)劑對(duì)害蟲(chóng)的取食忌避和非選擇性拒食作用測(cè)定.23實(shí)驗(yàn)十一 生物殺菌劑的生物測(cè)定孢子萌發(fā)法.24實(shí)驗(yàn)十二 生物殺菌劑生物測(cè)定生長(zhǎng)速率法.26實(shí)驗(yàn)十三 生物農(nóng)藥抗煙草花葉病毒（TMV）活性測(cè)定. .29實(shí)驗(yàn)十四 生物除草劑對(duì)黃瓜種苗

8、的活性測(cè)定.32附錄1 有效成分鑒別常用顯色劑及其配制.33附錄2 生物農(nóng)藥課程相關(guān)的主要參考書(shū)目.45附錄3 學(xué)習(xí)農(nóng)藥專業(yè)知識(shí)的相關(guān)期刊、數(shù)據(jù)庫(kù)和網(wǎng)站.47實(shí)驗(yàn)一 植物源農(nóng)藥細(xì)辛提取物的提取及藥效觀察隨著人們環(huán)保意識(shí)逐漸提高，對(duì)無(wú)公害蔬菜的需求越來(lái)越大。植物中含有很多天然的化學(xué)成分，我國(guó)利用植物材料治療人類(lèi)疾病已經(jīng)有幾千年的歷史了。依據(jù)中醫(yī)藥研究的成果，在低毒或無(wú)毒的植物材料中篩選對(duì)植物病原真菌具有抑制或殺滅作用的材料為尋找新的化學(xué)結(jié)構(gòu)提供了一條新的線索。1、目的要求掌握植物源農(nóng)藥細(xì)辛提取物的提取原理、加工工藝以及測(cè)試方法。2、方法原理乙醇作為對(duì)細(xì)辛的適宜提取溶劑，利用恒溫振蕩提取法提取。主

9、要實(shí)驗(yàn)儀器及材料細(xì)辛 200g手提式中藥粉碎機(jī) 1臺(tái)恒溫振蕩儀 1臺(tái)80%的乙醇 500mL50%的乙醇 500mL離心機(jī) 1臺(tái)烘箱 1臺(tái)試管 5根燒杯 4個(gè)玻璃棒 2根紗布 1卷電子天平 1臺(tái)冰箱 1臺(tái)培養(yǎng)箱 1臺(tái)4、掌握要點(diǎn)細(xì)辛的前期處理工作及提取工藝、測(cè)試程序。5、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容5.1細(xì)辛提取物的制備取經(jīng)粉碎的植物材料20g，加80乙醇100 mL，30，l50 rmin恒溫振蕩提取2d。三層紗布過(guò)濾，濾液經(jīng)4500 rmin離心20 min。取上清液45下減壓濃縮。 殘余物用50乙醇重新溶解并定容到20 mL，4下保存。5.2殺菌活性驗(yàn)證將細(xì)辛提取物配置成5個(gè)濃度備用（0.25g/L, 0.

10、50g/L, 1.00g/L, 2.00g/L, 4.00g/L）制備濃度為100個(gè)左右/L鐮刀菌孢子懸浮液備用將5個(gè)濃度的細(xì)辛藥液各取1ml分別與鐮刀菌孢子懸浮液混勻吸取一滴置于凹玻片中，放在保濕器培養(yǎng)（25-28）8h后觀察孢子萌發(fā)情況6、注意事項(xiàng)、結(jié)果計(jì)算與分析實(shí)驗(yàn)二 植物源農(nóng)藥黃連中生物堿的提取及藥效觀察黃連是著名的中藥，其根、莖味極苦，苦味在于其所含的多種生物堿。黃連中生物堿具有瀉火、 燥濕、解毒、殺蟲(chóng)等作用，多用于治療細(xì)菌性痢疾、肺結(jié)核等疾病，對(duì)猩紅熱、急性扁桃腺炎和呼吸道、婦科及外科感染也有一定療效。1、目的要求掌握植物源農(nóng)藥黃連中生物堿的提取工藝。2、方法原理微波輔助提?。豪?/p>

11、微波的反射、穿透、吸收、熱效應(yīng)和滲透速度快等特點(diǎn)，將藥物組織和細(xì)胞中的生理活性物質(zhì)提取出來(lái)，微波輔助提取可以顯著提高目標(biāo)成分的提取量，減少對(duì)提取溶劑的限制，達(dá)到強(qiáng)化與優(yōu)化傳熱傳質(zhì)的目的。3、主要實(shí)驗(yàn)儀器及材料黃連 200g手提式中藥粉碎機(jī) 1臺(tái)微波爐 1臺(tái)稀硫酸（0.092 molL） 500mL40目的篩子 1個(gè)電子天平 1臺(tái)紗布 1卷試管 5根燒杯 4個(gè)玻璃棒 2根冰箱 1臺(tái)培養(yǎng)箱 1臺(tái)4、掌握要點(diǎn)黃連的微波處理提取工藝及提取物活性測(cè)試方法。5、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容5.1稱取黃連20g，采用中藥粉碎機(jī)粉碎，過(guò)4O目篩，稱取黃連粉1.0g，加人90mL 0015molL的硫酸溶液浸濕，在微波中采用中低火

12、條件下，間歇加熱5min后，三層紗布過(guò)濾，烘干，備用。5.2殺蟲(chóng)活性測(cè)試將生物堿提取物配置成3個(gè)濃度（稀釋100倍，500倍，1000倍）并設(shè)置空白對(duì)照備用選取齡期一致的蚜蟲(chóng)30頭放置于寄主植物葉片上，置于塑料培養(yǎng)皿內(nèi)，準(zhǔn)備4次重復(fù)將葉片分別置于生物堿藥液及空白對(duì)照液中充分浸潤(rùn)5s后，將葉片置于棉花上自然晾干24h后觀察蟲(chóng)體存活情況。6、注意事項(xiàng)、結(jié)果計(jì)算與分析試驗(yàn)三 蔬菜葉片中農(nóng)藥殘留量的測(cè)定目前有機(jī)磷、氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥是我國(guó)大量使用的殺蟲(chóng)劑，雖然這類(lèi)農(nóng)藥與過(guò)去使用的有機(jī)氯農(nóng)藥相比，降解速度較快，但在果蔬中的殘留仍然較為嚴(yán)重。由于該類(lèi)農(nóng)藥能抑制人體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的生理活性，神經(jīng)傳導(dǎo)因此受阻，

13、引起神經(jīng)麻痹乃至死亡，對(duì)人類(lèi)健康造成極大危害。對(duì)于果蔬中的農(nóng)藥通常采用氣相色譜等方法進(jìn)行分析，但分析時(shí)間長(zhǎng)，操作步驟煩瑣，適用于實(shí)驗(yàn)室分析。長(zhǎng)期以來(lái)在大部分果蔬市場(chǎng)中，通常采用乙酰膽堿酯酶抑制法進(jìn)行快速檢測(cè)，即以乙酰膽堿酯酶作為檢測(cè)試劑，采用農(nóng)藥殘留檢測(cè)儀，根據(jù)乙酰膽堿酯酶活性變化的程度來(lái)測(cè)定果蔬樣品中的殘留農(nóng)藥。1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.1了解果蔬中殘留農(nóng)藥的分析方法；1.2掌握酶抑制分析方法的原理及操作方法；1.3理解農(nóng)藥殘留性評(píng)價(jià)的意義。2、實(shí)驗(yàn)原理有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥能抑制昆蟲(chóng)中樞和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿酯酶的活性，造成神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)乙酰膽堿的積累，影響正常傳導(dǎo)，使昆蟲(chóng)中毒致死，酶抑制法就是根

14、據(jù)這一昆蟲(chóng)毒理學(xué)原理，對(duì)農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測(cè)。以乙酰膽堿為底物，在乙酰膽堿酯酶（ACHE）的作用下，乙酰膽堿水解成膽堿和乙酸，膽堿和二硫雙對(duì)硝基苯甲酸（DNTB）產(chǎn)生顯色反應(yīng)，使反應(yīng)液呈黃色（于410nm處有最大吸收峰）。根據(jù)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)原理，在沒(méi)有有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥存在時(shí)，底物在酶的催化作用下發(fā)生水解，反應(yīng)速率可以用吸光度值隨時(shí)間的變化率K0來(lái)表示。當(dāng)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥加入到酶的顯色體系中時(shí)，農(nóng)藥抑制了酶的活性，影響顯色體系的反應(yīng)速度，此時(shí)體系吸光度隨時(shí)間的變化率為Kt，則有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥對(duì)酶的活性的抑制率Y的計(jì)算公式如下：。采用乙酰膽堿酯酶測(cè)定殘留農(nóng)藥時(shí)，當(dāng)酶完全水解底物

15、乙酰膽堿時(shí)，溶液顯黃色，其抑制率為0，當(dāng)酶活性被農(nóng)藥抑制而部分水解乙酰膽堿，測(cè)定溶液顯淡黃色，出現(xiàn)相應(yīng)的抑制率，當(dāng)酶完全被農(nóng)藥抑制，測(cè)定溶液顯無(wú)色，抑制率為100%，這樣就可以建立起農(nóng)藥殘留量與酶活性抑制率之間的關(guān)系。因而可以通過(guò)測(cè)定抑制率的大小來(lái)顯示農(nóng)藥殘留的毒性程度。樣品的毒性等級(jí)分為：安全、低毒和高毒。3、儀器和試劑3.1儀器CL-BIII四通道殘留農(nóng)藥測(cè)定儀 1臺(tái)天平（0.01g） 1臺(tái)一次性手套 1雙金屬鑷子 1支1000ml玻璃瓶 1個(gè)移液槍（50-250L） 1套剪刀 1把3.2試劑提取液：把提取液甲乙粉末倒入大玻璃瓶中，并加510ml蒸餾水溶解。酶試劑(乙酰膽堿酯酶)：用移液槍

16、取3.1ml提取液，加入酶試劑瓶中。顯色劑(二硫代硝基苯甲酸)：用移液槍取20ml提取液，加入顯色劑瓶，溶解后倒入棕色瓶中。底物(乙酰膽堿)：用移液槍取3.1ml蒸餾水，加入底物瓶中。4、實(shí)驗(yàn)步驟4.1 儀器連接將CL-BIII四通道殘留農(nóng)藥測(cè)定儀連接電源，把RS232/RS485的轉(zhuǎn)換器接入電腦主機(jī)背后的COM口（串口）上，然后把數(shù)據(jù)信號(hào)線與轉(zhuǎn)換器連接上，這樣就完成了儀器與電腦的硬件連接。4.2檢測(cè)操作把“農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)軟件”光盤(pán)放入電腦光驅(qū)中，等自動(dòng)讀取或在光盤(pán)目錄下找到并雙擊“setup”后，按提示點(diǎn)擊“下一步”安裝。安裝完成以后，桌面上會(huì)出現(xiàn)“食品質(zhì)量安全檢測(cè)平臺(tái)”的圖標(biāo)。首先按儀

17、器“設(shè)置”鍵，選擇為“受控”。然后再打開(kāi)檢測(cè)軟件，檢測(cè)軟件的用戶名默認(rèn)為“管理員”，密碼是“111111”。這樣檢測(cè)軟件對(duì)檢測(cè)儀器進(jìn)行控制了。4.3 操作步驟整個(gè)的實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程可以分為三個(gè)大部分：調(diào)0、調(diào)100，空白對(duì)照，樣品分析。4.3.1 調(diào)0/100（注：以下是一個(gè)檢測(cè)窗口的步驟，其他三個(gè)窗口都是如此。）等待10-15秒按“確定”放入黑塊等待10-15秒按“確定”拿出黑塊按“ ”鍵按“ ”鍵按“ ”鍵按“ ”鍵4.3.2 空白對(duì)照用大移液槍抽取2.5ml提取液放入試管中，用小移液槍取0.1ml酶試劑加入試管中，用小移液槍取0.1ml顯色劑加入試管中，用小移液槍取0.1ml底物加入試管中，迅速搖勻并倒入比色皿，放入比色池，按“開(kāi)始對(duì)照分析”鍵，等待對(duì)照結(jié)束。4.3.3 裝入對(duì)照按“裝入對(duì)照分析”鍵，選擇所需對(duì)照，選擇需要裝入對(duì)照的通道號(hào)（在通道號(hào)碼前打），“讀取”鍵完成裝入工作。4.3.4 裝入標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照庫(kù)按“裝入對(duì)照分析”鍵，選擇所需的空白對(duì)照和相應(yīng)的樣品修正值，選擇需要裝入對(duì)照的通道號(hào)（在通道號(hào)碼前），按“讀取”鍵完成裝入工作。4.3.5 樣品檢測(cè)用天平稱取1克果蔬，剪成2cm見(jiàn)方，放入燒杯中，用大移液槍抽取5ml提取液加入到燒杯中，靜置15分鐘（或震蕩1分鐘），用大移液槍從燒杯中抽取2.