武漢大學(xué)基因工程李立家

1、基因工程學(xué)：分離基因以及工程基因過程、方法和相應(yīng)的原理的一門學(xué)科?；蚬こ叹褪窃诜肿铀缴希萌斯し椒ㄌ崛。ɑ蚝铣桑┎煌锏倪z傳物質(zhì)，在體外切割，再和載體拼接重組。然后把重組的DNA分子引入細(xì)胞或生物體內(nèi)，使外源DNA在受體細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制與表達(dá)。按人們的需要生產(chǎn)不同的產(chǎn)物或定向地創(chuàng)造生物的新形狀，并使之穩(wěn)定地遺傳給下代?，F(xiàn)代基因工程學(xué)是和基因組學(xué)，蛋白質(zhì)組學(xué)和計算機(jī)相結(jié)合的產(chǎn)物?；蚬こ讨饕寺『捅磉_(dá)，其基本過程如下：（1）外源DNA制備及限制性核酸內(nèi)切酶切割；（2）載體DNA制備及相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶切割；（3）用DNA連接酶連接外源DNA和載體DNA；（4）通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染方法將上述

2、重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì) 胞中；（5）篩選和鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞；（6）表達(dá)目的基因和應(yīng)用?；蚬こ倘笠兀狠d體，工具酶，受體（細(xì)胞）-細(xì)菌、植物和動物加上DNA轉(zhuǎn)移手段基因工程載體：用于承載、克隆、轉(zhuǎn)移目的基因(也叫外源基因，DNA片段)，能自我復(fù)制的DNA分子。常用基因工程載體有：細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體；柯斯質(zhì)粒；穿梭質(zhì)粒；細(xì)菌人工染色體；酵母人工染色體；Ti質(zhì)粒及其衍生載體載體的要求：A、復(fù)制：具有能在受體細(xì)胞中復(fù)制的復(fù)制起點；B、選擇性標(biāo)記：一般情況下，所要擴(kuò)增的基因不便于選擇，所以作為載體要求具有選擇標(biāo)記；C、限制性酶切位點：對于某一種限制性酶，它的切點數(shù)要求是單一的。現(xiàn)在已發(fā)展了許多具有多種單一的

3、限制性酶識別位點的載體；D、載體的大?。涸瓌t上要求載體越小越好；E、外源基因的性狀表達(dá)：結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)需要啟動子；F、載體的安全性：要求載體不能隨便轉(zhuǎn)移。質(zhì)粒的改造：A、刪除不必要的DNA區(qū)域。盡量縮小質(zhì)粒的分子量，以提高外源DNA片段的裝載量。B、減少限制性酶切點。缺失突變，限制性酶、核酸外切酶核連接酶的共同作用，機(jī)械破碎和質(zhì)粒之間的重組等方法。C、加入易于識別的選擇性標(biāo)記，便于檢測含有重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞。通過質(zhì)粒之間的重組，可以使質(zhì)粒帶有合適的選擇性標(biāo)記。D、關(guān)于質(zhì)粒安全性能的改造。滅活質(zhì)粒在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移的mob基因。常用的生化遺傳標(biāo)記基因：1.-半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZ：-半

4、乳糖苷酶基因產(chǎn)物不具酶活性，裝配為四聚體后才有酶活。該蛋白質(zhì)可分為兩部分：鏈和鏈。前者負(fù)責(zé)四聚體裝配，后者具-半乳糖苷酶活性；只有當(dāng)兩者都存在時，才會表現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為-互補(bǔ)作用。這兩個部分可獨立存在，分別由兩個基因編碼。為鏈編碼的基因稱之為lacZ(編碼145 AAs)。這兩個基因（LacZ和LacZ）均可作為標(biāo)記基因。 -半乳糖苷酶基因的優(yōu)點: a.酶催化X-Gal水解為蘭色產(chǎn)物，檢測直觀； b. lacZ編碼5-端可容許很大的變化而不影響酶活性；c. lacZ和鏈基因的分別表達(dá)可使載體小而容量大。2.葡萄糖苷酸酶基因（GUS）：該基因編碼一種可分解各種-葡萄糖苷酸及其衍生物的水解

5、酶。該標(biāo)記基因除具有上述lacZ基因的優(yōu)點外，它的適用范圍十分廣泛，因為許多生物中沒有這種基因。3.熒光素酶基因：熒光素酶或由螢火蟲產(chǎn)生的可催化蜜蜂熒光素氧化的酶，并產(chǎn)生熒光，若在反應(yīng)中加入CoA，可使靈敏度提高10倍；或由發(fā)光細(xì)菌（Photobacterium fischeri）產(chǎn)生的熒光素酶，它與FMN-氧化還原酶聯(lián)用，通過NAD(P)H的變化測定酶活。4.發(fā)光蛋白質(zhì)基因(GFP)：發(fā)光蛋白是由水母產(chǎn)生的一種可發(fā)光的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可使大腸桿菌菌落發(fā)綠色熒光。質(zhì)粒載體的分類及用途：A、克隆載體。用于克隆和擴(kuò)增外源基因，它們或者含有能為氯霉素擴(kuò)增的松弛型復(fù)制子結(jié)構(gòu)，如pBR系列；或者復(fù)制子經(jīng)

6、過人工誘變，解除對質(zhì)?？截悢?shù)的負(fù)調(diào)控作用，使質(zhì)粒在每個細(xì)胞中可達(dá)數(shù)千個復(fù)制拷貝。B、測序載體。這類載體通常高拷貝復(fù)制，并含有Polylinker,便于各種DNA片段的克隆與擴(kuò)增。在Polylinker的兩端含有兩個不同的引物序列（T3/T5），使得重組質(zhì)粒經(jīng)堿變性后即可進(jìn)行DNA測序反應(yīng)，如pUC18/pUC19系列。另一種測序質(zhì)粒是M13噬菌體DNA與質(zhì)粒DNA的雜合分子，如M13mp系列，它們在受體細(xì)胞中復(fù)制后，可以特定的單鏈DNA形式分泌到細(xì)胞外，克隆在這種質(zhì)粒上的外源基因無需變性即可直接用于測序反應(yīng)。C、穿梭載體。這種載體分子上含有兩個親緣關(guān)系不同的復(fù)制子結(jié)構(gòu)以及相應(yīng)的選擇性標(biāo)記基因，

7、因此能在兩種不同種屬的受體細(xì)胞種復(fù)制并檢測，如大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒、大腸桿菌-酵母菌穿梭質(zhì)粒等。D、探針載體。這類載體被用來篩選克隆基因的表達(dá)調(diào)控元件，如啟動子和終止子等。它通常裝有一個可以定量檢測其表達(dá)程度的報告基因（如抗生素的抗性基因），但缺少相應(yīng)的啟動子或終止子，因此載體分子本身不能表達(dá)報告基因，只有當(dāng)含有啟動子或終止子的外源DNA片段插入到載體合適的位點上，報告基因才能表達(dá)，而且其表達(dá)量的大小直接反映了被克隆的基因表達(dá)調(diào)控元件的強(qiáng)弱。E、表達(dá)載體。這類載體在Polylinker的上游和下游分別裝有轉(zhuǎn)錄效率較高的啟動子、合適的核糖體結(jié)合位點（SD-序列）以及強(qiáng)有力的終止子結(jié)構(gòu)，使得克

8、隆的外源基因均能在受體細(xì)胞中高效表達(dá)，如pSPORT系列和pSP系列。 噬菌體或病毒的DNA能被開發(fā)成為基因工程的有用載體，因為：1.高效率的感染性能使外源基因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞；2.自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增。噬菌體的改造和構(gòu)建:(1)縮短長度；(2)刪除重復(fù)的酶切位點增加一些單一的酶切位點； (3)加裝選擇標(biāo)記；(4)構(gòu)建琥珀密碼子的突變體，琥珀型突變（amber mutation)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突變,抑制基因（sup）可以抑制這種突變。-DNA作為載體的優(yōu)點:1.-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌。2.-DNA載體的裝載能

9、力為25 kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量。3.重組-DNA分子的篩選較為方便。M13噬菌體載體作為克隆載體的優(yōu)越性在于能象質(zhì)粒那樣轉(zhuǎn)化進(jìn)入受體細(xì)胞，也可以使用類似于質(zhì)粒分離純化方法制備M13 DNA分子，同時又可以采用類似于噬菌體分離純化方法制備單鏈M13 DNA，單鏈DNA在序列測定及定位誘變等中極為有用?？滤官|(zhì)粒（Cosmids):它是由噬菌體的cos（cohesive）末端及質(zhì)粒（plasmid）重組而成的載體?？滤官|(zhì)粒的優(yōu)點：1.具有噬菌體的特性(體外包裝，高效感染進(jìn)入受體細(xì)胞)；2.具有質(zhì)粒載體的特性(易于克隆操作、也能轉(zhuǎn)化進(jìn)入受體細(xì)胞、選擇及高拷貝等)；3.具有較高容量（45 kb）的

10、克隆能力；4.排斥非重組子；5.不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細(xì)胞，不形成噬菌體顆粒，因而不形成噬菌斑。噬菌粒載體(phagemids):由絲狀噬菌體DNA和質(zhì)粒組成的雜合分子。 它具有質(zhì)粒的復(fù)制起點、選擇性標(biāo)記、多克隆位點等，方便DNA的操作，可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在；又具有單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制起點，在輔助噬菌體的存在下，可進(jìn)行噬菌體的繁殖，產(chǎn)生單鏈的子代噬菌體。優(yōu)點：A、具有質(zhì)粒性質(zhì)，便于外源DNA的克隆及重組子的篩選；B、提高裝載量；C、較穩(wěn)定。人工染色體載體酵母人工染色體YAC(Yeast artificial chromosome):包含一個染色體在酵母中繁殖所需的三個序列成分：A、 酵母染色體的復(fù)

11、制起點；B、一個著絲粒，保證染色體分離進(jìn)入后代細(xì)胞中；C、端粒，染色體末端封合。細(xì)菌人工染色體BAC (Bacterial artificial chromosome)以F1質(zhì)粒衍生而來，能克隆約100kb-350kb的外源DNA片段，可以通過轉(zhuǎn)化進(jìn)入受體細(xì)胞，象一般質(zhì)粒制備原理分離?；蚬こ坦ぞ呙?.1限制性核酸內(nèi)切酶(Restriction Endonuclease, RE):在研究寄主細(xì)胞對噬菌體的限制-修飾系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，它能在DNA特異位點上催化雙鏈DNA分子的斷裂，產(chǎn)生相應(yīng)的限制性片段?；咎卣?識別序列為4、5或6個堿基對且具有180旋轉(zhuǎn)對稱的回文結(jié)構(gòu) 同位酶：識別相同的序列但切點不

12、同。 一般來說，識別序列的堿基對越多，則這種酶在DNA上出現(xiàn)的頻率越低；不同生物堿基含量不同，酶識別位點的分布及頻率也不同。 切開的DNA末端有平頭末端和粘性末端（雙鏈DNA的一條鏈突出，如5或 3突出末端，在適當(dāng)?shù)臏囟认?，兩個互補(bǔ)粘性末端能退火形成雙鏈分子。2.2 DNA 連接酶:DNA連接酶廣泛存在于各種生物體內(nèi)，其催化的基本反應(yīng)形式是將DNA雙鏈上相鄰的3羥基和5磷酸基團(tuán)共價結(jié)合形成3-5磷酸二酯鍵，使原來斷開的DNA缺口重新連接起來，因此它在DNA復(fù)制，修復(fù)以及體內(nèi)體外重組過程中起著重要作用。2.3 DNA聚合酶和Klenow大片段酶:DNA聚合酶以一條DNA為模板通過聚合作用把脫氧核

13、苷酸加到雙鏈DNA分子的3-OH端而合成新的DNA。2.4 堿性磷酸酶:細(xì)菌的堿性磷酸酶（BAP）和牛小腸的堿性磷酸酶（CIP）均能催化DNA，RNA，核苷酸的5端除磷反應(yīng)，因此在DNA重組實驗中，該酶用于載體DNA的5末端除磷操作以防止載體自身連接，提高重組效率；用于末端標(biāo)記。2.5 末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（TdT):該酶來源于小牛胸腺，它是一種不需要模板的DNA聚合酶，其合適的底物形式為帶有3游離羥基的雙鏈DNA分子,當(dāng)?shù)孜餅?端突出的雙鏈DNA時，TdT在Mg2+的存在下，即可將脫氧核苷酸隨機(jī)聚合在兩條鏈的3端，對于平頭或3凹端DNA底物，則需要Co激活，但聚合反應(yīng)仍不按模板要求進(jìn)行.Td

14、T在人工粘性末端的構(gòu)建中極為有用。2.6 S1核酸酶(S1,Nuclease):該酶來源于米曲霉茵，催化反應(yīng)通常由Zn 2+激活，并在酸性pH（4.0-4.5）條件下進(jìn)行，其特征是：（1）降解單鏈DNA或RNA，包括不能形成雙鏈的區(qū)域（如發(fā)夾結(jié)構(gòu)中的環(huán)狀部分），但降解DNA的速度大于降解RNA的速度；（2）降解反應(yīng)的方式為內(nèi)切和外切；(3)酶量過大時會伴有雙鏈核酸的降解。因為該酶的雙鏈降解活性比單鏈低7.5萬倍，因此在DNA重組及分子生物學(xué)研究中，S1核酸酶常用來切平突出的單鏈末端以及制作S1圖譜。用途：(1)測定真核基因中間隔子序列位置；(2)去除DNA片段中突出的單鏈尾巴；(3)打開cDN

15、A合成時形成的發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。2.7 影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素（1）DNA的純度：一個限制性核酸內(nèi)切酶單位u：在最佳緩沖系統(tǒng)中，在37下反應(yīng)1小時完全降解1gDNA所需的酶量。（2）溫度：大部分限制性核酸內(nèi)切酶最適反應(yīng)溫度為37，但也有例外，如Sma的反應(yīng)溫度為25, SfiI為50 。降低最適反應(yīng)溫度，會導(dǎo)致只產(chǎn)生切口，而不是切斷雙鏈DNA。(3)鹽離子濃度：不同的核酸限制性內(nèi)切酶對鹽離子強(qiáng)度（Na+）有不同的要求，一般按離子強(qiáng)度不同分為低(0-50 mM) 、中(100mM)、高鹽(150mM)三類。Mg2+也是限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)所需(4)緩沖體系：核酸限制性內(nèi)切酶要求有穩(wěn)定的pH值環(huán)

16、境，這通常由Tris-HCl緩沖體系來完成。(5)反應(yīng)體積和甘油濃度：商品化的限制性內(nèi)切酶均加50%甘油作為保護(hù)劑，一般在-20下貯藏。在進(jìn)行酶切反應(yīng)時，加酶的體積一般不超過總反應(yīng)的10%，若加酶的體積太大，甘油濃度過高，則會影響酶切反應(yīng)。(6)限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的時間：通常為1小時，但大多數(shù)酶活性可維持很長的時間，進(jìn)行大量DNA酶解反應(yīng)時，一般讓酶解過夜。(7)限制性內(nèi)切酶星號活性：限制性核酸內(nèi)切酶有特異性識別序列和切割位點，但當(dāng)酶解條件發(fā)生變化時，酶切反應(yīng)的專一性可能會降低，導(dǎo)致同種酶識別多種識別位點，這種現(xiàn)象稱為星號活性。31凝膠電泳技術(shù)：以淀粉膠、瓊脂或瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等作為支

17、持介質(zhì)的區(qū)帶電泳法稱為凝膠電泳，其中聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyzcrylamide gel electrophoresis,PAGE）瓊脂糖凝膠電泳的條件影響：DNA分子的遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系。隨著電場的增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍縮小，即分辨率降低。DNA分子在TAE和TBE等緩沖液中帶負(fù)電荷，在電場中向正 極移動。瓊脂糖濃度。采用不同的凝膠能分辨不同分子量的DNA分子, 瓊脂糖的濃度決定凝膠的空隙。濃度高,空隙小?？障缎?，分辨率高：小分子較易通過，而大分子難通過；空隙大，分辨率低：大小分子幾乎以同等速率通過。電場方向。電場方向改變，DNA分子被迫改變路徑，DNA分子越大，

18、為適應(yīng)新的電場方向而重新排列所需的時間就越長。因此可以通過脈沖電場凝膠電泳來分辨極大的DNA分子。32 核酸的分子雜交技術(shù)探針與探針標(biāo)記：帶有能檢測的標(biāo)記物的DNA或RNA叫探針。使DNA或RNA帶有可檢測的標(biāo)記物的過程叫探針標(biāo)記。切口平移（Nick translation)：DNA聚合酶I把一個帶有標(biāo)記物的dNTP就加在這引物的3-OH末端，而它的5-3的核酸外切酶活性將切除5-單核苷酸，同時依次添加新的核苷酸到3一側(cè)，其結(jié)果使切口沿著DNA平移，這就叫切口平移（Nick translation)隨機(jī)引物：能與任何DNA配對互補(bǔ)的一小段DNA序列叫隨機(jī)引物。Southern雜交技術(shù)：待分析的

19、基因組DNA或其它DNA首先用一種或幾種限制性核酸內(nèi)切酶消化，消化后的DNA片段通過瓊脂糖凝膠電泳按照分子量的大小進(jìn)行分離，凝膠經(jīng)堿變性處理，將DNA分子變性成單鏈，經(jīng)毛細(xì)管作用或物理方法將凝膠中的單鏈DNA分子從膠上轉(zhuǎn)移到固相支持物上（一般使用的是尼龍膜和纖維素膜）。然后用標(biāo)記的DNA或RNA探針對附著于膜上的DNA進(jìn)行雜交來檢測這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段，與探針有同源性的DNA片段在膜上的位置可以通過特定的檢測方法如放射自顯影或顯色而顯示。Northern 雜交是將RNA樣品通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，再轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，用同位素或生物素標(biāo)記的DNA或RNA 特異探針針對固定于膜上的mR

20、NA 進(jìn)行雜交，洗脫除去非特異性雜交信號，對雜交信號進(jìn)行分析，以確定目的基因的是否轉(zhuǎn)錄，是檢測RNA（主要是mRNA）的方法。1、基本原理和基本過程與Southern blot基本相同2、鑒別RNA3、探針可用DNA或RNA片段4、待測樣品為總RNA或mRNAWestern blot：將通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后與能特異性識別待檢蛋白的抗體進(jìn)行反應(yīng)，洗滌去除沒有結(jié)合的特異性抗體后，加入標(biāo)記的、能識別特異性抗體的種屬特異性抗體，反應(yīng)一段時間后再次洗滌去除非特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體，加入適合標(biāo)記物的檢測試劑進(jìn)行顯色或發(fā)光等，觀察有無特異性蛋白條帶的出現(xiàn)，也可通過條帶的

21、密度大小來進(jìn)行特異性蛋白的半定量。操作過程：蛋白質(zhì)樣品制備 SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)膜（PVDF或硝酸纖維素膜）封閉一抗洗滌 酶標(biāo)二抗反應(yīng)洗滌顯色或化學(xué)發(fā)光顯影Northern印跡與Southern 印跡的不同點：1、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時加變性劑保持RNA處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳中不變性2、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理,Southern印跡時，DNA轉(zhuǎn)膜前需進(jìn)行堿變性及中和處理3、靶核酸為RNA，不需限制酶消化基因文庫（gene library)或DNA文庫：在細(xì)菌中增殖來自某一生物的染色體基因組DNA（或來自所有不同的mRNA種的每一種cDNA分子）所形成的的全部

22、DNA片段之集合體。有基因組DNA文庫(克隆)和cDNA文庫(克隆)。cDNA克隆文庫：來自某一生物的某種組織的所有不同的mRNA合成的cDNA分子再將cDNA重組到載體上，導(dǎo)入大腸肝菌細(xì)胞增殖?；蚪MDNA文庫構(gòu)建載體DNA片段的制備：DNA分離純化限制酶切 脫磷酸化反應(yīng)；供體DNA片段的制備：總DNA分離純化物理切割法或機(jī)械攪拌或限制性核酸內(nèi)切酶酶切法（內(nèi)切酶Sau3A進(jìn)行局部消化，可得到10-30kb的隨機(jī)片段）分離特定大小DNA片段； DNA片段大小分離和富集：瓊脂糖凝膠電泳和蔗糖梯度離心技術(shù)；載體與基因組DNA大片段的連接。轉(zhuǎn)化（transformation): 感受態(tài)的大腸桿菌捕獲

23、和表達(dá)外源質(zhì)粒DNA分子的過程；轉(zhuǎn)染（transfection):感受態(tài)的大腸桿菌捕獲和表達(dá)外源噬菌體DNA分子的過程。感受態(tài)：細(xì)菌吸收轉(zhuǎn)化因子的生理狀態(tài)。一個理想的基因組DNA文庫應(yīng)具備下列條件：重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力。載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分隔克隆?？寺∨c克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域，以利克隆排序。克隆片段易于從載體分子上完整卸下。重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選。cDNA文庫優(yōu)越性：A、一些RNA病毒基因克隆的唯一手段。B、比基因組DNA文庫小很多，容易構(gòu)建,篩選較簡單。C、假陽性幾率低。D、生產(chǎn)表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)。E、功能研究,不含內(nèi)含子序列,

24、可以在細(xì)菌中直接表達(dá)（一般選 用的載體都是表達(dá)型的）。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）：能在體外特異快速擴(kuò)增DNA片段。組成：DNA單鏈模板、引物和DNA聚合酶（包括緩沖液）。A、Taq DNA聚合酶；B、引物：引物是保證PCR特異性的關(guān)鍵因素，一般使用兩個引物來擴(kuò)增專性序列。C、反應(yīng)緩沖液：Mg2+: 可顯著影響PCR的產(chǎn)量及產(chǎn)物特異性，一般用量為1.5mM。 過高則出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，過低則酶活性顯著下降。D、dNTP：dATP, dGTP, CTP 和 dTTP貯備液濃度均為5mM，保存于-20，使用濃度為200mM。過低則反應(yīng)速度下降，過高則特異性下降。E、反應(yīng)條件：變性溫度和時間：保證模板DNA解

25、鏈完全是保證整個PCR擴(kuò) 增成功的關(guān)鍵。復(fù)性溫度和時間：PCR反應(yīng)的特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板的結(jié)合，一般為40-60.越高, 產(chǎn)物的特異性也越高。時間一般為30-60s。延伸溫度和時間：一般位于Taq酶最適作用溫度70-75之間。小于1kb的片段一般1-2min就足夠了, 而更大片段需延長時間。循環(huán)數(shù)：在25-30個循環(huán)內(nèi), 擴(kuò)增DNA增加明顯, 以指數(shù)方式增加，后進(jìn)入相對穩(wěn)定狀態(tài), 此時, 引物和 dNTP下降；Taq酶活性下降；擴(kuò)增產(chǎn)物（焦磷酸鹽和DNA）的阻礙作用；高濃度的產(chǎn)物可能降低Taq酶的延伸和加工能力。所以一味增加循環(huán)次數(shù)只會增加非特異擴(kuò)增。PCR技術(shù)的應(yīng)用：A、基因組D

26、NA PCR克隆和cDNA的RT-PCR克隆B、基因組的RAPD（隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA分析，random amplified polymorphic DNA)標(biāo)記分析。使用隨機(jī)的短核苷酸引物，在低的退火溫度下進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳所呈顯的帶型，反映著用作擴(kuò)增模板的DNA分子的總體結(jié)構(gòu)特征。C、臨床診斷和法醫(yī)鑒定 如男女性別鑒定，病毒性感染病的診斷，對單根毛發(fā)或單個 精子作遺傳學(xué)鑒定等。D、基因表達(dá)定量分析DNA測序：Sanger雙脫氧鏈終止法和Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法。目的基因的克隆策略是是建立在基因的分子生物學(xué)的基礎(chǔ)上綜合利用各種基因工程技術(shù)手段和理論建立發(fā)展起來的。目前主

27、要有如下幾種策略：PCR或雜交分離、圖位克隆、轉(zhuǎn)座子示蹤等。A.PCR或雜交分離；B. mRNA差別顯示技術(shù)（Differential Display of Reverse Transcriptional PCR, DDRT-PCR）；C. 差別雜交 (differential hybridization)；D. 基因圖位克?。╩ap-based cloning)用于分離其編碼產(chǎn)物尚不知道的目的基因的一種有效方法。RFLP（restriction fragment length polymorphism), 即DNA限制片段長度多態(tài)性，它是指應(yīng)用特定的核酸限制性內(nèi)切酶切割有關(guān)的DNA分子，所產(chǎn)

28、生出來的DNA片段在長度上的簡單變化。分子(DNA)標(biāo)記(molecular marker)： 分子標(biāo)記是在所有生物學(xué)標(biāo)記中用途最為廣泛的標(biāo)記。分子標(biāo)記是一個用作遺傳分析的DNA路標(biāo)，它反映的是不同生物個體DNA序列水平的差異。分子標(biāo)記的特點：直接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物體的各個組織、各個發(fā)育階段均可檢測到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達(dá)與否等問題；數(shù)量極多，遍布整個基因組，可檢測座位幾乎無限；多態(tài)性高，自然界存在許多等位變異，無須人為創(chuàng)造；表現(xiàn)為中性，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)；許多標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性的特點，能區(qū)別純合體和雜合體。染色體步移（chromosome walking)：根據(jù)高密度的分子

29、標(biāo)記遺傳圖譜，利用在目的基因的兩側(cè)最緊密連鎖的一個或一對分子標(biāo)記作探針，通過篩選基因組文庫分離出陽性克隆，以陽性克隆的末端單拷貝序列為探針再篩選基因組文庫分離出陽性克隆，并通過DNA指紋分析將分離出的基因組克隆重疊連接在一起形成重疊群。如此重復(fù)多次直到克隆重疊群覆蓋目的基因。這種技術(shù)稱為染色體步移。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)缺點優(yōu)越性: (1) 結(jié)構(gòu)簡單，生理生化和遺傳背景知識，尤其是其基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制有了清楚的了解；(2)易于大規(guī)模培養(yǎng)，成本低廉；（3）經(jīng)過了遺傳改造，已發(fā)展為一種安全的基因工程實驗系統(tǒng)，擁有各種不同的菌株和載體系列。不足之處（表達(dá)真核基因的障礙）:（1) 真核基因具有內(nèi)含子，所以只

30、能用其cDNA；（2）許多真核生物基因僅在大腸桿菌中合成無特異性空間結(jié)構(gòu)的多肽鏈；（3）許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，都要經(jīng)受翻譯后的加工修飾，而大腸桿菌缺乏蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)；（4）大腸桿菌內(nèi)源性蛋白酶易降解外來的真核生物基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)分子；（5）大腸桿菌細(xì)胞膜間隙中含有大量的內(nèi)毒素，痕量的內(nèi)毒素即可導(dǎo)致人體熱原反應(yīng)。外源基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)原理涉及三個方面：（1）強(qiáng)化蛋白質(zhì)的生物合成（重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)，轉(zhuǎn)錄水平和翻譯速率）；（2）抑制蛋白質(zhì)產(chǎn)物降解；（3) 恢復(fù)維持蛋白質(zhì)特異性空間結(jié)構(gòu)。1.啟動子影響表達(dá)效率的主要因素之一是啟動子的強(qiáng)度，（1）啟動子本身的序列，尤其是-10區(qū)（TATAA

31、T）和-35區(qū)（TTGACA）兩個六聚體盒的堿基組成；（2）-10區(qū)和-35區(qū)的間隔距離，接近于17個堿基對，啟動子活性強(qiáng)度也就越強(qiáng)，若大于17，則啟動子活性強(qiáng)度也就越弱；（3）與啟動子和外源基因轉(zhuǎn)錄起始位點之間的距離有很大關(guān)系。高水平表達(dá)的最佳啟動子必須具備的條件：（1）它必須是一種強(qiáng)啟動子，能夠使克隆基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達(dá)量占細(xì)胞總蛋白的10-30；（2）這種啟動子應(yīng)該是誘導(dǎo)型的，能通過簡單的方式使用廉價的誘導(dǎo)物而得以誘導(dǎo)。2.終止子：有效的轉(zhuǎn)錄終止子的必要性：（1）轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長，所需時間就多，外源基因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降；（2）轉(zhuǎn)錄通讀進(jìn)入質(zhì)粒功能區(qū)，可能干擾質(zhì)粒的復(fù)制和其他生物功能，甚至

32、導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性；（3）轉(zhuǎn)錄終止子能增強(qiáng)mRNA分子的穩(wěn)定從而大大提高了蛋白質(zhì)產(chǎn)物的水平；（4）轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物過長影響翻譯效率。3 .SD序列：外源基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關(guān)。大腸桿菌mRNA的翻譯起始效率主要由其5端的結(jié)構(gòu)序列所決定，即核糖體結(jié)合位點（RBS），它包括4個結(jié)構(gòu)要素：（1）起始密碼子上游的6-8個核苷酸序列UAAGGAGG,即Shine-Dalgarno(SD)序列；（2）起始密碼子AUG；（3）SD與起始密碼子之間的距離及堿基組成；（4）基因編碼區(qū)5端若干密碼子的堿基序列，至少這一序列不能與mRNA的5

33、端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，否則便會嚴(yán)重干擾mRNA在核糖體上的準(zhǔn)確定位。4 .密碼子： 由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有不同程度的差異性，因此，外源基因尤其是哺乳動物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個重要因素是密碼子的正確選擇。一般而言，有兩種策略可以使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細(xì)胞中獲得最佳表達(dá)：首先，采用外源基因全合成的方法，按照大腸桿菌密碼子偏愛性規(guī)律，設(shè)計更換外源基因中不適宜的相應(yīng)簡并密碼子，重組人胰島素，干擾素以及生長激素在大腸肝菌中的高效表達(dá)均采用了這種方法；其次，對于那些含有不和諧密碼子種類單一，出現(xiàn)頻率較高而本身分子量又較大的外源基因而言，則選擇相關(guān)tRNA編碼基

34、因同步克隆表達(dá)的策略較為有利。5.質(zhì)?？截悢?shù)：提高產(chǎn)量除了使用強(qiáng)啟動子以提高轉(zhuǎn)錄效率外，還可以增加質(zhì)?？截悢?shù)以增加基因的劑量，這可以通過構(gòu)建高拷貝載體而實現(xiàn)。質(zhì)粒的穩(wěn)定性對工程菌株高效表達(dá)產(chǎn)物非常重要。在寄主細(xì)胞快速生長期間質(zhì)粒易于丟失，出現(xiàn)無質(zhì)粒細(xì)胞。減少質(zhì)粒丟失的措施：（1）保持抗生素的選擇壓力；（2）在載體中保留或連接質(zhì)粒分配功能區(qū)bar；（3）避免質(zhì)粒多體的形成；（4）將重組質(zhì)粒的擴(kuò)增納入可控制軌道。(5)對于分子量較小的蛋白或多肽可采用將多拷貝的外源基因克隆在一個低拷貝質(zhì)粒上，以取代單拷貝外源基因克隆在高拷貝載體上表達(dá)的策略。6.減輕宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷：合理地調(diào)節(jié)代謝負(fù)荷與外源基因高

35、效表達(dá)的關(guān)系。7 .防止被宿主的酶降解：1）設(shè)計成融合蛋白這是避免被降解的最好措施。2） 使用突變菌株，保護(hù)外源蛋白不被降解減少宿主菌本身的蛋白酶的表達(dá)。3）表達(dá)分泌蛋白包涵體是由一群不溶性蛋白質(zhì)聚集在一起形成的晶體結(jié)構(gòu)物，被膜包裹或無膜裸露。大腸桿菌形成的包涵體大部分存在于細(xì)胞質(zhì)中。外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成包涵體，1.以包涵體形式表達(dá)異源蛋白的優(yōu)點： （1）易于分離；（2）蛋白質(zhì)受到保護(hù)而免受胞內(nèi)蛋白酶的降解；（3）蛋白質(zhì)沒有生物活性，對寄主細(xì)胞沒有影響。不足的地方： （1）分離時易丟失（終產(chǎn)量偏低）；（2）復(fù)性較復(fù)雜困難。2.分泌型異源蛋白的表達(dá)：這種蛋白質(zhì)分泌定位于細(xì)胞

36、周質(zhì)，或分泌到胞外培養(yǎng)基中。優(yōu)點: (1) 易于純化，因為周質(zhì)和胞外的蛋白質(zhì)種類較少；（2）蛋白酶活性較低，蛋白質(zhì)較穩(wěn)定；（3）N端甲硫氨酸殘基被切除。不足：（1）外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進(jìn)行分泌型表達(dá)；（2）表達(dá)率較低，分泌到胞外培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)濃度相當(dāng)稀。3.融合型異源蛋白的表達(dá)：將外源基因和受體菌自身蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起，作為一個閱讀框架進(jìn)行表達(dá)，這種雜合基因表達(dá)出的蛋白質(zhì)稱為融合蛋白質(zhì)。真核生物基因表達(dá)與調(diào)控的特點：1. 轉(zhuǎn)錄與翻譯不偶聯(lián)；2. 調(diào)控是多層次的；3. 具有組織和細(xì)胞類型特異性；4. 對信號分子反應(yīng)不同。二、真核生物基因表達(dá)載體的組成特征 1. 原核DNA序列

37、；2. 啟動子：組成型啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、組織特異性啟動子、雜合啟動子3. 增強(qiáng)子；4. 終止子；5. 內(nèi)含子；6. polyA加尾信號；7. 選擇標(biāo)記基因和報告基因。1. 酵母表達(dá)系統(tǒng)：酵母是一種單細(xì)胞低等真核生物，培養(yǎng)條件普通，生長繁殖速度迅速，能夠耐受較高的流體靜壓，用于表達(dá)基因工程產(chǎn)品時，可以大規(guī)模生產(chǎn)，有效降低了生產(chǎn)成本。2.昆蟲表達(dá)系統(tǒng)：是一類應(yīng)用廣泛的真核表達(dá)系統(tǒng)，它具有同大多數(shù)高等真核生物相似的翻譯后修飾、加工以及轉(zhuǎn)移外源蛋白的能力。是建立在對果蠅等昆蟲細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)之上的，在穩(wěn)定性和表達(dá)效率方面有著更為突出的優(yōu)點。昆蟲表達(dá)系統(tǒng)的缺點：1. 載體大量復(fù)制，最終導(dǎo)致宿主

38、細(xì)胞或幼蟲死亡，不能連續(xù)生產(chǎn)外源蛋白。2. 昆蟲細(xì)胞對蛋白產(chǎn)物的糖基化方式與哺乳動物有所差異，可能影響到產(chǎn)物蛋白的活性和免疫原性。3. 昆蟲細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)費用大。3. 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)：哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢在于能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊，提供復(fù)雜的糖基化和準(zhǔn)確的糖基化等多種翻譯后加工功能，因而表達(dá)產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然的高等生物蛋白質(zhì)分子。根據(jù)目的蛋白表達(dá)的時空差異，可將表達(dá)系統(tǒng)分為瞬時、穩(wěn)定和誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。4. 植物表達(dá)系統(tǒng)：以植物個體、果實或器官作為生物反應(yīng)器,將目標(biāo)基因與植物病毒或特定的植物調(diào)控元件構(gòu)建融合基因，以此制造轉(zhuǎn)基因植物,目標(biāo)基因?qū)⒃陬A(yù)定

39、時期和部位表達(dá)。6.1植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基本路線1）分離能夠編碼所需產(chǎn)物的DNA片段（目的基因）。2）將目的基因克隆到適當(dāng)?shù)妮d體DNA中形成重組DNA，并且 連接了一個控制目的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的啟動子和一個控制目的基因轉(zhuǎn)錄終止終止子，還連接了一個編碼特殊性質(zhì)的蛋白質(zhì)（如熒光蛋白）標(biāo)記基因。3）利用細(xì)菌繁殖擴(kuò)增重組DNA。4）利用基因槍、農(nóng)桿菌等方法將連接了啟動子和終止子的目的基因?qū)氲侥繕?biāo)植物的細(xì)胞中。5）篩選含有外源基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并誘導(dǎo)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株。6）轉(zhuǎn)基因植株大規(guī)模種植。 外源基因?qū)胫参锏姆椒ㄍ庠椿驅(qū)胫参锛?xì)胞的方法可分為DNA直接轉(zhuǎn)化（naked DNA transfer）和以載體為

40、媒介的基因轉(zhuǎn)化（vector mediated gene transfer）。A. DNA直接轉(zhuǎn)移法：DNA的直接轉(zhuǎn)移是通過物理化學(xué)法將外源基因轉(zhuǎn)入受體植物細(xì)胞的技術(shù)。1. 化學(xué)刺激法：它的主要原理是植物細(xì)胞的原生質(zhì)體經(jīng)過某些化學(xué)藥品（PEG、PNA、磷酸鈣、氯化鈣）處理后，能夠捕獲外源DNA。2. 電擊法：電擊法是一種直接轉(zhuǎn)移外源基因進(jìn)入受體植物細(xì)胞的方法，這種方法可適用于單子葉植物及雙子葉植物細(xì)胞原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化。3. 顯微注射法：微針注射是一種經(jīng)典的物理轉(zhuǎn)基因技術(shù)，它是借助顯微注射儀，將外源DNA或mRNA通過機(jī)械方法直接注射到受體細(xì)胞。4. 脂質(zhì)體介導(dǎo)法： 當(dāng)脂質(zhì)體與植物原生質(zhì)共溫育時，

41、脂質(zhì)體與原生質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)之間發(fā)生相互作用，脂質(zhì)體內(nèi)的外源DNA通過融合或吞噬作用高效率地轉(zhuǎn)運到原生質(zhì)體細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)。5. 基因槍法：基因槍技術(shù)（biolistics）也稱微粒轟擊法（mcroprojectile bombardment），是一種快速有效的植物DNA轉(zhuǎn)移系統(tǒng)之一。其基本原理是利用帶有外源DNA的金粉或鎢粉微粒經(jīng)過放電或機(jī)械加速后對細(xì)胞射擊。6. 微激光束法：這種方法的原理是利用激光微束脈沖引起細(xì)胞膜可逆性穿孔，從而將外源DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。7. 花粉通道法（Pollen-tube pathway）：該法是將外源DNA片段在自花授粉后的特定時期注入柱頭或花柱，外源DNA沿花粉管通

42、道或傳遞組織通過珠心進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化不具備正常細(xì)胞壁的受精卵、合子及早期的胚體細(xì)胞。分子生物學(xué)檢測方法：1.酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay 簡稱ELISA）檢測。ELISA檢測是利用抗原與抗體反應(yīng)的特異性，當(dāng)抗原與抗體結(jié)合時，通過結(jié)合在抗體上的酶作用于特定的底物后發(fā)生顯色反應(yīng)，借助于比色鑒定轉(zhuǎn)基因植物。2. PCR技術(shù)檢測：根據(jù)轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的特點，設(shè)計并合成相應(yīng)的引物，以轉(zhuǎn)基因植物DNA為模板在PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。與Southern分析相比，PCR檢測DNA用量少，操作簡單，成本低，不需同位素即可完成。但PCR檢測的假陽性高，從

43、而造成檢測結(jié)果的誤差。與ELISA檢測法相比，PCR檢測不僅具有快速、靈敏、特異性強(qiáng)等特點，而且可應(yīng)用于豆腐和油炸豆腐等食品的檢測。從應(yīng)用范圍看，PCR檢測應(yīng)用較ELISA法更加普遍。3. 分子雜交：Southern雜交可以確定外源基因在植物中的組織結(jié)構(gòu)、外源DNA整和的位置及拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)基因植株F1世代外源基因的穩(wěn)定性。Northern雜交用于檢測轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)，與Southern雜交相比，更接近于性狀表現(xiàn)，更有現(xiàn)實意義，被廣泛用于轉(zhuǎn)基因植株的檢測。Western雜交檢測目的基因在翻譯水平的表達(dá)結(jié)果，能直接顯示目的基因在轉(zhuǎn)化體中是否經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯最終合成蛋白而影響植株的性狀表現(xiàn)。植物

44、作為制備基因工程疫苗生物反應(yīng)器的優(yōu)勢 ：微生物發(fā)酵系統(tǒng)不能對真核蛋白質(zhì)疫苗進(jìn)行正確的翻譯后 加工，有時導(dǎo)致其免疫原性變?nèi)?。而植物與動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，可對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)譯后加工，保持了自然狀態(tài)下的免疫原性。細(xì)菌在發(fā)酵過程中常產(chǎn)生一些不溶性聚合物，其要重新溶解并折疊成天然蛋白質(zhì)則需要很高的成本，且發(fā)酵需要龐大設(shè)備投資。動物細(xì)胞生產(chǎn)基因工程疫苗，常用動物病毒作為載體導(dǎo)入抗原基因，在生產(chǎn)過程中也可能污染動物病毒。轉(zhuǎn)基因植物中的外源基因可通過植物雜交的方法進(jìn)行基因重組而達(dá)到在植物體內(nèi)積累多基因的目的。 植物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的疫苗可以直接儲存在植物種子和果實中，無需冷連系統(tǒng)設(shè)備進(jìn)行儲藏運輸，故易于長距離運輸和

45、普及推廣。不僅降低了成本且方便，可隨時長期給藥。疫苗抗原基因轉(zhuǎn)入可食用的植物后，可供人直接服用或飼喂動物，不需要分離提純。這樣可節(jié)約許多儀器設(shè)備，降低生產(chǎn)成本，使用方便。粘膜免疫是病毒性腹瀉的免疫保護(hù)機(jī)制，但在啟動粘膜免疫方面尚屬難題。轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞是可以啟動粘膜免疫的有效途徑。提供營養(yǎng)。通過轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的口服疫苗，不僅提供了疫苗，而且提供了營養(yǎng)。 轉(zhuǎn)基因動物（transgenic animal）是指用DNA重組技術(shù)將人們所需要的目的基因?qū)雱游锏氖芫鸦蛟缙谂咛?nèi)，使外源目的基因隨細(xì)胞的分裂而增殖并在體內(nèi)表達(dá)，且能穩(wěn)定地遺傳給后代的動物。轉(zhuǎn)基因動物的關(guān)鍵技術(shù)包括：(1)外源目的基因的分離

46、(基因的克隆及重組DNA的制備等)；(2)外源目的基因與專性基因表達(dá)起動子、增強(qiáng)子、報告基因等構(gòu)件的拼接重組；(3)外源目的基因重組DNA導(dǎo)入生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞；(4)胚胎移植技術(shù) (Embryo Transfer，ET)；(5)轉(zhuǎn)基因胚胎發(fā)育生長鑒定及篩選轉(zhuǎn)基因動物品系；（6）目的基因整合率及表達(dá)效率的檢測。在這些程序中最重要的方法是成功地把外源目的基因轉(zhuǎn)入動物早期胚胎細(xì)胞中。顯微注射法：在顯微操作儀下用極細(xì)的微吸管將在體外構(gòu)建的外源目的基因注射到處于原核時期的受精卵的原核中，外源基因在受精卵繁殖過程中通過DNA的復(fù)制而整合到動物基因組中，再通過胚胎移植技術(shù)將整合有外源基因的受精卵移植到受體的子宮內(nèi)繼續(xù)發(fā)育，進(jìn)而得到轉(zhuǎn)基因動物。顯微注射法的不足之處有(1)外源基因整合的效率低（尤其是大家畜）； (2)不能控制轉(zhuǎn)基因的整合位點；