衍生化技術(shù)-hplc培訓(xùn)資料

1、衍生化技術(shù)-HPLC化學(xué)衍生化的目的化學(xué)衍生化的目的:通過(guò)合適的化學(xué)反應(yīng),生成特殊衍生化物，1. 改變待測(cè)物的色譜色譜保留特性以改善分離度；2. 改變待測(cè)物的檢測(cè)特性，以增加其對(duì)檢測(cè)器的響 應(yīng)（例：紫外標(biāo)記、熒光標(biāo)記、電化學(xué)標(biāo)記） ；3. 生成穩(wěn)定的衍生化物，改善待測(cè)物的不穩(wěn)定性（例：-SH基團(tuán)易氧化的問(wèn)題可通過(guò)?；瘉?lái)解決）。HPLC化學(xué)衍生化分類 在線化學(xué)衍生化 是否與HPLC系統(tǒng)聯(lián)機(jī) 離線化學(xué)衍生化 柱前衍生化 發(fā)生衍生化發(fā)應(yīng)的先后 柱后衍生化柱前衍生化 在色譜分離前，預(yù)先將樣品制成適當(dāng)?shù)难苌?，然后再進(jìn)入色譜柱進(jìn)行分離檢測(cè)。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：（1）對(duì)用作流動(dòng)相的溶劑體系沒(méi)有限制；（2）反應(yīng)條件

2、，反應(yīng)速率不受限制； （3）通過(guò)選擇合適的試劑以及萃取方法，可以 消除許多干擾；（4）過(guò)量溶劑、試劑容易除去；（5）轉(zhuǎn)變成合適的衍生物，可使分離度改進(jìn)。缺點(diǎn)缺點(diǎn):（1）操作過(guò)程繁瑣，容易影響定量準(zhǔn)確性。（2）當(dāng)一個(gè)復(fù)雜組分樣品經(jīng)過(guò)衍生化反應(yīng) 后，有可能產(chǎn)生多種衍生化產(chǎn)物給色 譜分離帶來(lái)困難。 柱后衍生化 將樣品先注入色譜柱，按選定的色譜條件使樣品組分得以分離，當(dāng)各個(gè)組分從色譜柱流出后，分別與衍生化試劑相遇，在一定的反應(yīng)條件下，生成具有某種檢測(cè)特性的衍生化產(chǎn)物再進(jìn)入檢測(cè)器。 要求：要求：（1）對(duì)流動(dòng)相的選擇更嚴(yán)格，必須考慮衍生化 試劑、反應(yīng)產(chǎn)物的溶解度，以及它們與流 動(dòng)相可能發(fā)生的副反應(yīng)；（2）

3、由于在高效液相色譜中采用高流速，因此 反應(yīng)速率必須很快（小于30s）；（3）檢測(cè)器對(duì)衍生化試劑不能有響應(yīng)。 柱后衍生流程圖柱后衍生流程圖如下： 紫外衍生化 熒光衍生化 電化學(xué)衍生化 手性衍生化 固定化酶反應(yīng)器（IMER）一、一、紫外衍生反應(yīng)紫外衍生反應(yīng) 在液相色譜法中，紫外吸收檢測(cè)器是最常見(jiàn)的一種高靈敏度檢測(cè)器。但很多化合物在紫外可見(jiàn)光譜區(qū)無(wú)吸收，而不能被檢測(cè)。將它們與帶有紫外吸收基團(tuán)的衍生試劑在在一定條件下發(fā)生反應(yīng)，由于反應(yīng)產(chǎn)物帶有發(fā)色基團(tuán)而能被檢測(cè)。 苯甲酰氯及其衍生物可與胺類化合物反應(yīng)生成強(qiáng)紫外吸收的苯甲酸酯類衍生物。 反應(yīng)式： 二、熒光衍生反應(yīng)熒光衍生反應(yīng) 在液相色譜法中，熒光檢測(cè)器是

4、一種高靈敏度、高選擇性的檢測(cè)器，比紫外檢測(cè)器的靈敏度要高10到1000倍，因此，為了檢測(cè)痕量非熒光物質(zhì)，常將它與熒光衍生化試劑反應(yīng)，生成熒光物質(zhì)，然后用熒光檢測(cè)器檢測(cè) 例、福多司坦血藥濃度測(cè)定方法的建立例、福多司坦血藥濃度測(cè)定方法的建立福多司坦的藥理作用福多司坦的藥理作用 福多司坦福多司坦(S-（3羥基丙基）羥基丙基）-L-半胱氨酸半胱氨酸, Fudosteine) 為新的具有粘液活性的半胱氨酸衍生物，祛痰效果極強(qiáng)為新的具有粘液活性的半胱氨酸衍生物，祛痰效果極強(qiáng)，而毒副作用極小（，而毒副作用極?。?對(duì)大鼠和小鼠對(duì)大鼠和小鼠LD5010g/kg），化），化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。 獲準(zhǔn)的適應(yīng)癥：

5、獲準(zhǔn)的適應(yīng)癥：咳嗽，慢性支氣管炎，支氣管擴(kuò)張癥，塵肺病，咳嗽，慢性支氣管炎，支氣管擴(kuò)張癥，塵肺病，肺氣腫，非定型抗酸菌癥等疾患的祛痰。肺氣腫，非定型抗酸菌癥等疾患的祛痰。 例、福多司坦血藥濃度測(cè)定方法的建立例、福多司坦血藥濃度測(cè)定方法的建立 2 2、半胱氨酸結(jié)構(gòu)式：半胱氨酸結(jié)構(gòu)式：1、福多司坦結(jié)構(gòu)式、福多司坦結(jié)構(gòu)式: : 結(jié)結(jié) 構(gòu)構(gòu) 特特 點(diǎn)點(diǎn)HOCH2CH2CH2SCH2CHCOOHNH2 HSCH2CHCOOHNH2 3、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 為半胱氨酸衍生物；為半胱氨酸衍生物； 沒(méi)有強(qiáng)的紫外吸收，沒(méi)有強(qiáng)的紫外吸收， 沒(méi)有熒光；沒(méi)有熒光； 分子量小，極性大。分子量小，極性大。例、福多司坦

6、血藥濃度測(cè)定方法的建立例、福多司坦血藥濃度測(cè)定方法的建立福多司坦結(jié)構(gòu)式福多司坦結(jié)構(gòu)式: :HOCH2CH2CH2SCH2CHCOOHNH2 伯氨基伯氨基羧基羧基 參考氨基酸的測(cè)定方法，選擇合適的衍參考氨基酸的測(cè)定方法，選擇合適的衍生化試劑衍生化后測(cè)定。生化試劑衍生化后測(cè)定。在流動(dòng)相中掃描福多司坦衍生化在流動(dòng)相中掃描福多司坦衍生化產(chǎn)物的激發(fā)波長(zhǎng)為產(chǎn)物的激發(fā)波長(zhǎng)為338 nm，發(fā)，發(fā)射波長(zhǎng)為射波長(zhǎng)為450 nm；例、福多司坦血藥濃度測(cè)定方法的建立例、福多司坦血藥濃度測(cè)定方法的建立 HHOOHOCH2CH2CH2SCH2CHCOOHNH2OHCH2CH2SHNSCH2CH2OHCHCOOHCH2SC

7、H2CH2CH2OHPH+10.4反應(yīng)過(guò)程：反應(yīng)過(guò)程：取代基熒光團(tuán)（試劑分子母體）反應(yīng)基團(tuán)膽磺酰肼 DNS-H熒光衍生化試劑的分類：（四）羧酸類化合物的衍生試劑鄰苯二甲醛鄰苯二甲醛 OPA4-氯氯-7-硝基硝基-2,1,3-苯并惡二唑苯并惡二唑 NBD-Cl熒光素異硫氰酸酯熒光素異硫氰酸酯FITCFMOC芴代甲氧基酰氯芴代甲氧基酰氯 6-氨喹啉基琥珀酰亞胺碳酸酯氨喹啉基琥珀酰亞胺碳酸酯AQC羰基氯類： FMOC, CEOC磺酰氯類: DNs-Cl鹵代三嗪類: EDTN 1-乙氧基-4-(二氯-三嗪)萘（EDTN） 肼類肼類 DNs-H CEOC-HDNs-H CEOC-H 氨基類氨基類 氨基甲

8、基芘氨基甲基芘 （四）羧酸類化合物的衍生試劑: 溴甲基類 BrMMC 哌嗪基類 DBD-Pz 重氮甲烷基類 ADAM 其它類 9-(2-羥乙基)-吖啶酮 HEA4-氨甲基-6，7-二甲基香豆素 (ADMC)7-N-哌嗪-4-二甲氨基苯并呋喃9-蒽重氮甲烷9-蒽重氮甲烷(4-溴甲基-7-甲氧基香豆素)三、三、電化學(xué)衍生反應(yīng)電化學(xué)衍生反應(yīng) 指樣品與某些試劑反應(yīng)，生成具有電化學(xué)活性的衍生物，以便在電化學(xué)檢測(cè)器上有較高的響應(yīng)。環(huán)境介質(zhì)對(duì)電化學(xué)反應(yīng)有很大影響，如離子強(qiáng)度、pH值和溶劑組成等 。常用的電化學(xué)衍生化試劑常用的電化學(xué)衍生化試劑 ： 還原衍生試劑 最常用的還原衍生試劑是帶硝基的芳香化合物。 這些帶硝基的衍生物能分別與羥基、氨基、羧基、羰基化合物反應(yīng)生成具有電化學(xué)活性的衍生物。盡管這些衍生物都可用紫外檢測(cè)器，但電化學(xué)檢測(cè)的靈敏度高，選擇性更好。氧化衍生試劑 氧化衍生基團(tuán)有芳氨基、酚羥基等。氧化衍生反應(yīng)時(shí)，氧不干擾測(cè)定。許多紫外和熒光衍生試劑同樣可用于電化學(xué)衍生。 四、手性衍生化手性衍生化 用手性試劑與外消旋體反應(yīng)，在分子內(nèi)導(dǎo)入另一手性中心，柱前衍生反應(yīng)生成一對(duì)非對(duì)映異構(gòu)體，兩者間無(wú)鏡相關(guān)系，物理化學(xué)性質(zhì)不同，可用常規(guī)的色譜分離條件進(jìn)行分離。 選用該法分離通?；谝韵略颍哼x用該法分離通?；谝韵略颍?不宜直接拆分，如游離胺類