課題3　血紅蛋白的提取和分離

1、血紅蛋白的提取與分離血紅蛋白的提取與分離郫都二中 王青松蛋白質(zhì)分離的原理：根據(jù)蛋白質(zhì)根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性各種特性的差異，如的差異，如分子的分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對其他分子的親和力度、吸附性質(zhì)和對其他分子的親和力等等，等等，可以用來分離不同種類的蛋白質(zhì)。可以用來分離不同種類的蛋白質(zhì)。一、基礎(chǔ)知識一、基礎(chǔ)知識（一）（一） 凝膠色譜法凝膠色譜法2.凝膠：大多數(shù)凝膠是由大多數(shù)凝膠是由多糖類化合物多糖類化合物（如（如葡聚糖葡聚糖或或瓊脂糖瓊脂糖）構(gòu)成的多孔小球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道。構(gòu)成的多孔小球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道。根據(jù)被分

2、離物質(zhì)的蛋白質(zhì)根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量相對分子質(zhì)量的大小，的大小，利用具有利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，來進行分離。的凝膠，來進行分離。1.概念：（分配色譜法分配色譜法）3.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的具體過程4.凝膠色譜法的原理相對分子量較小的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部的通道，相對分子量較小的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長，移動速度較慢路程較長，移動速度較慢; ;相對分子量較大的蛋白質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的通道，相對分子量較大的蛋白質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。

3、相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。進行體外實驗時，如何保證蛋白質(zhì)不會發(fā)生變性呢？進行體外實驗時，如何保證蛋白質(zhì)不會發(fā)生變性呢？（二）緩沖溶液（二）緩沖溶液 能夠抵制能夠抵制外界的酸和堿外界的酸和堿對溶液對溶液PH值值的影的影響，維持響，維持PH基本不變?；静蛔儭?.作用作用:2.緩沖溶液的配制緩沖溶液的配制:通常由通常由12 種緩沖劑種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的緩沖劑的使用比例使用比例就可以制得在就可以制得在不同不同PH范圍內(nèi)范圍內(nèi)使使用的緩沖液。用的緩沖液。3. 在本課題中使用的緩沖液是在本課題中使用的緩沖液是:磷酸緩沖液磷酸緩沖液,成分：磷酸二

4、氫鈉與磷酸氫二鈉成分：磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉 如何證明凝膠色譜法獲得的蛋白質(zhì)是目的蛋白？如何證明凝膠色譜法獲得的蛋白質(zhì)是目的蛋白？1.概念：帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。2.原理： 許多重要的生物大分子，如多肽、許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團，在一定的核酸等都具有可解離的基團，在一定的PHPH下，這下，這些基團會帶上正電或負電。些基團會帶上正電或負電。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。帶電荷相反的電極移動。電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的電泳利用了待分離

5、樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使帶電差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。分子的分離。3.類型:瓊脂糖瓊脂糖凝膠電泳、凝膠電泳、聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠電泳。凝膠電泳。 在測定蛋白質(zhì)分子量時常用在測定蛋白質(zhì)分子量時常用十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉（SDSSDS）聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,NN,N- -亞甲基雙丙烯亞甲基雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具酰胺在引

6、發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。N,N-亞甲基雙丙烯酰胺（形成交聯(lián)）亞甲基雙丙烯酰胺（形成交聯(lián)）丙烯酰胺和交聯(lián)劑丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚反應(yīng)亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚反應(yīng)蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。1.原理： SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復合體在成的蛋白質(zhì)復合體在SDS的作用下會解聚成單條的作用下會解聚成單條肽鏈，因此測定的結(jié)果只是單條肽

7、鏈的分子量。肽鏈，因此測定的結(jié)果只是單條肽鏈的分子量。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)SDS復合物，復合物，SDS所帶負電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有所帶負電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差的電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。2. SDS作用機理:用用SDS SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量的方法分子量的方法 使用使用SDSSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)的測定蛋白質(zhì)的分子量時，可選用一組分子

8、量時，可選用一組已知分子量的標準蛋白已知分子量的標準蛋白同同時進行電泳，根據(jù)已知分子量的標準蛋白的時進行電泳，根據(jù)已知分子量的標準蛋白的電泳電泳區(qū)帶位置區(qū)帶位置，可以測定，可以測定未知蛋白質(zhì)未知蛋白質(zhì)的分子量。的分子量。市場市場上有高分子量、次高分子量及低分子量的標準蛋上有高分子量、次高分子量及低分子量的標準蛋白試劑出售。白試劑出售。樣品處理樣品處理粗分離粗分離純化純化純度鑒定純度鑒定蛋白質(zhì)提取和分離步驟血血液液血漿血漿水水 分分固體物質(zhì)：固體物質(zhì)：血漿蛋白、血漿蛋白、無機鹽、磷無機鹽、磷脂、葡萄糖等脂、葡萄糖等血細血細 胞胞白細胞白細胞血小板血小板紅細胞紅細胞（最多）（最多）血紅蛋白血紅蛋白

9、（9090）兩個兩個肽鏈肽鏈兩個兩個一肽鏈一肽鏈四個亞鐵紅素基團四個亞鐵紅素基團血液有哪些成分？血液有哪些成分？（一）血紅蛋白（一）血紅蛋白血紅血紅蛋白蛋白兩個兩個肽鏈肽鏈兩個兩個一肽鏈一肽鏈四個亞鐵血紅素基團四個亞鐵血紅素基團每個肽鏈環(huán)繞一個每個肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素亞鐵血紅素基團，基團，此基團可攜帶此基團可攜帶一分子氧一分子氧或一分子二氧化碳，或一分子二氧化碳，血紅蛋白血紅蛋白因含有因含有血紅素血紅素而呈而呈紅色紅色。（一）血紅蛋白（一）血紅蛋白 用雞的紅細胞提取用雞的紅細胞提取DNA，用豬、牛、羊，用豬、牛、羊的紅細胞提取血紅蛋白的原因是什么？的紅細胞提取血紅蛋白的原因是什么？ 雞的紅細

10、胞具有細胞核，含有雞的紅細胞具有細胞核，含有DNA，便，便于進行于進行DNA的提??；人的紅細胞無細胞核，的提?。蝗说募t細胞無細胞核，結(jié)構(gòu)簡單，血紅蛋白含量豐富，便于提取結(jié)構(gòu)簡單，血紅蛋白含量豐富，便于提取血紅蛋白。血紅蛋白。樣品處理樣品處理粗分離粗分離純化純化純度鑒定純度鑒定蛋白質(zhì)提取和分離步驟（二）操作過程（二）操作過程(1)紅細胞的洗滌紅細胞的洗滌:洗滌目的洗滌目的: 去除雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的去除雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化。分離純化。洗滌操作：洗滌操作：1、采集血樣。、采集血樣。2、低速短時間離心。低速短時間離心。3、吸取血漿：上層透明的黃色血漿。、吸取血漿：上層透明的黃

11、色血漿。4、鹽水洗滌：用五倍體積的質(zhì)量分數(shù)為、鹽水洗滌：用五倍體積的質(zhì)量分數(shù)為0.9的氯的氯化鈉溶液洗滌?；c溶液洗滌。5、低速短時間離心。低速短時間離心。6、重復重復4、5步驟三次步驟三次，直至上清液中已沒有黃色，直至上清液中已沒有黃色，表明洗滌干凈。表明洗滌干凈。1.樣品處理樣品處理（二）操作過程（二）操作過程 洗滌次數(shù)過少洗滌次數(shù)過少，無法除去血漿蛋白；，無法除去血漿蛋白； 離心速度過高、時間過長離心速度過高、時間過長會使白細會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀，達不到胞和淋巴細胞等一同沉淀，達不到分離的效果。分離的效果。注意：注意：(2)血紅蛋白的釋放血紅蛋白的釋放：加蒸餾水到原血液體積，再

12、加：加蒸餾水到原血液體積，再加40體積的甲苯體積的甲苯 ，置于磁力攪拌器上充分攪拌，置于磁力攪拌器上充分攪拌10分分鐘（加速細胞破裂）鐘（加速細胞破裂）,細胞破裂釋放出血紅蛋白。細胞破裂釋放出血紅蛋白。將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心的速度離心10 min。第第1層（最上層）：甲苯層（無色透明）；層（最上層）：甲苯層（無色透明）；第第2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色）；層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色）；第第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色)；第第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅

13、色）。層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）。用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。(4)透透 析：析： 取取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為的物質(zhì)的量濃度為20mmol/l的的磷酸緩沖液磷酸緩沖液中（中（pH為為7.0），透析），透析12小時。小時。 除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)。除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)。2. 粗分離粗分離2.凝膠色譜操作凝膠色譜操作（1 1）凝膠色譜柱的制作：）凝膠色譜柱的

14、制作：取長取長4040厘米，內(nèi)徑厘米，內(nèi)徑1.61.6厘米的玻璃管，厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。兩端需用砂紙磨平。底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔挖出凹穴挖出凹穴安裝移液管頭部安裝移液管頭部覆蓋尼覆蓋尼龍網(wǎng)，再用龍網(wǎng)，再用100100目尼龍紗包好，插到玻璃管的目尼龍紗包好，插到玻璃管的一一端端。：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實尼龍網(wǎng)，還會導致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。則難以鋪實尼龍網(wǎng)，還會導致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。頂塞的制作：頂塞的制作：打孔打孔安裝玻璃管安裝玻璃管。組裝：。組裝：將上述三者按將上述

15、三者按相應(yīng)位置組裝成一個整體相應(yīng)位置組裝成一個整體。安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。凝膠的選擇凝膠的選擇：A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。B、代表意義：“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍。75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5克。凝膠的前處理凝膠的前處理：配置凝膠懸浮液：計算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。（2）凝膠色譜柱的裝填）凝膠色譜柱的裝填凝膠色譜柱的裝填凝膠色譜柱的裝填：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi)，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。1、凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝

16、膠顆粒之間的空隙。 2、裝填凝膠柱時不得有氣泡存在：因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。（2）凝膠色譜柱的裝填）凝膠色譜柱的裝填洗滌平衡洗滌平衡：裝填完畢后，：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用高的操作壓下，用300ml的的20mmol/l的磷酸緩沖液的磷酸緩沖液（pH為為7.0）充分洗滌平衡）充分洗滌平衡12小時。小時。注意：注意：（2）凝膠色譜柱的裝填）凝膠色譜柱的裝填1、液面不要低于凝膠表面，、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動與最終生液體在柱內(nèi)的流動與最終生物大分子物質(zhì)的

17、分離效果。物大分子物質(zhì)的分離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干，露、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象出凝膠顆粒的現(xiàn)象。（3）樣品加入與洗脫）樣品加入與洗脫調(diào)節(jié)緩沖液面：調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。面平齊，關(guān)閉出口。滴加透析樣品：滴加透析樣品：吸管吸吸管吸1ml樣品樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時，加到色譜柱的頂端，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面。同時注意不要破壞凝膠面。 樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進入凝膠

18、層后，關(guān)閉下端出口洗脫：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進行洗脫。 收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。正確的加樣操作是：正確的加樣操作是：1 1、不要觸及并破壞凝膠、不要觸及并破壞凝膠面面。2 2、貼壁加樣。、貼壁加樣。3 3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。在分離過程中，如果在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制移動，說明色譜柱制作成功。作成功。注意：注意：（三）（三）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（選做）聚丙烯酰胺凝膠電泳（選做）鑒定血紅