Chapter3_酶的提取與分離純化(上)

1、Chapter 3 酶的提取與分離純化酶的提取與分離純化酶的提取與分離純化是酶的生產(chǎn)中最早采用并一直沿用至今的生產(chǎn)方法，在采用其他方法進行酶的生產(chǎn)過程中，也必須進行酶的提取和分離純化。酶的提取與分離純化酶的提取與分離純化將酶從細胞或其他含酶的原料中提取出來，再于雜質(zhì)分開，而得到所要求的酶制品的技術。酶的提取與分離純化酶的提取與分離純化許多酶存在于細胞內(nèi)。許多酶存在于細胞內(nèi)。為了提取這些胞內(nèi)酶，為了提取這些胞內(nèi)酶，首先需要對細胞進行破首先需要對細胞進行破碎處理。碎處理。 機械破碎機械破碎 物理破碎物理破碎 化學破碎化學破碎 酶解破碎酶解破碎JY92-II D超聲波細胞粉碎機細胞破碎珠高壓細胞破碎

2、機DY89-I型 電動玻璃勻漿機3.1 細胞破碎細胞破碎機械破碎機械破碎搗碎法研磨法勻漿法 物理破碎物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法 化學破碎化學破碎有機溶劑：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性劑：Triton、Tween酶促破碎酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過機械運動產(chǎn)生的剪切通過機械運動產(chǎn)生的剪切力，使組織、細胞破碎。力，使組織、細胞破碎。通過各種物理因素的作用，通過各種物理因素的作用，使組織、細胞的外層結構破使組織、細胞的外層結構破壞，而使細胞破碎。壞，而使細胞破碎。通過各種化學試劑對細胞通過各種化學試劑對細胞膜的作用，而使細胞破碎膜的作用，而使細胞破碎通過細胞本身的酶系或外通過細胞

3、本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使加酶制劑的催化作用，使細胞外層結構受到破壞，細胞外層結構受到破壞，而達到細胞破碎而達到細胞破碎 細胞破碎方法及其原理細胞破碎方法及其原理酶的提取酶的提取: :指在一定的條件下，用適當?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過程，也稱為酶的抽提。3.2 酶的提取酶的提取溶劑選擇溶劑選擇：首先應根據(jù)酶的結構酶的結構和和溶解性質(zhì)溶解性質(zhì)，選擇適當?shù)娜軇?。極性物質(zhì)易溶于極性溶劑中，非極性物質(zhì)易溶于非極性的有機溶劑中，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中。大部分酶都能溶解于水，通?？捎盟蛳∷?、稀堿、稀鹽溶液水或稀酸、稀堿、稀鹽溶液等等進行

4、提??；進行提?。挥行┟概c脂質(zhì)結合或含有較多的非極性基團，則可用有機有機溶劑溶劑提取。 提高溫度降低溶液粘度增加擴散面積縮短擴散距離增大濃度差等 防止酶的變性失活防止酶的變性失活注意控制好溫度、pH值等提取條件。3.2 酶的提取酶的提取提高酶分子的擴散速度 提高提取效率提高提取效率： 酶的主要提取方法酶的主要提取方法提取方法提取方法使用溶劑使用溶劑/溶液溶液提取對象提取對象鹽溶液鹽溶液0.020.5mol/L的鹽溶液 在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液酸溶液PH26的水溶液在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液堿溶液PH812的水溶液在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶有機溶劑有機溶劑可

5、與水混溶的有機溶劑與脂質(zhì)結合牢固或含有較多非極性基團的酶 大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，而且在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這稱為鹽溶現(xiàn)象鹽溶現(xiàn)象。 3.3 酶的分離方法酶的分離方法（1 1） 沉淀分離沉淀分離（2 2） 離心分離離心分離（3 3） 過濾與膜分離過濾與膜分離（4 4） 層析分離層析分離（5 5） 電泳分離電泳分離（6 6） 萃取分離萃取分離（1 1） 沉淀分離沉淀分離 通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的溶解度溶解度降低降低，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離的技術。沉淀分離方法沉淀分離方法分離原理分離原理鹽析沉淀鹽析沉淀利用不同蛋白質(zhì)在不同鹽濃度下溶解度

6、不同的特性，在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)析出，實現(xiàn)酶與雜質(zhì)的分離等電點沉淀等電點沉淀利用兩性電解質(zhì)在等電點時溶解度最低，及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的pH值，使酶或雜質(zhì)析出有機溶劑有機溶劑沉淀沉淀利用酶與雜質(zhì)在有機溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出復合沉淀復合沉淀在酶液中加入某些物質(zhì)，使之與酶形成復合物而沉淀析出選擇性變性選擇性變性沉淀沉淀選擇一定條件使酶液中的雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的酶 鹽析法鹽析法鹽析法是在酶的分離純化中應用最早，且至今仍廣泛使用的蛋白質(zhì)類酶的分離純化方法。 蛋白質(zhì)在水中的溶解度受到溶液中鹽濃度的影

7、響。低鹽濃度下，蛋白質(zhì)溶解度隨鹽濃度的升高而增加，即鹽溶現(xiàn)象。在鹽濃度達到某一界限后，蛋白質(zhì)溶解度隨鹽濃度的升高而降低，從而使蛋白質(zhì)沉淀析出，即鹽析現(xiàn)象鹽析現(xiàn)象。11鹽析機理：鹽析機理：S ：蛋白質(zhì)的溶解度(g/L)； S0 ：為蛋白質(zhì)在離子強度為0時（即純?nèi)軇┲校┑娜芙舛?g/L)； I ：離子強度；Ks：鹽析常數(shù)，主要取決于鹽的性質(zhì)主要取決于鹽的性質(zhì)，與蛋白質(zhì)的種類有關，但與溫度和pH值無關。酶在溶液中的溶解度與溶液的離子強度的關系：酶在溶液中的溶解度與溶液的離子強度的關系：IKSSS0lga. 不同種類的鹽主要影響Ks；b. 離子半徑小，帶電多，電荷密度高，鹽析效果好(Ks大）。13：主

8、要取決于蛋白質(zhì)的性質(zhì)，與溫度溫度和pH值有關。當pH和溫度值一定時，為常數(shù)。IKSIKSSSSlglglg0 在一定的溫度和pH值條件下，S0為常數(shù)，上式可寫作：Cohnx公式14溫度的影響：溫度的影響：一般物質(zhì)的溶解度隨溫度的升高而增大；現(xiàn)在（高離子強度溶液中），升高溫度有利于某些蛋白質(zhì)溶液的失水，因而溫度升高，蛋白質(zhì)的溶解度下降。溫度影響的溫度影響的 值：值：T ， ；T ， 。pKs分級鹽析法：分級鹽析法： 在一定pH值及溫度下，通過改變離子強度(鹽濃度，即I)使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法p分級鹽析法：分級鹽析法： 在一定的鹽和離子強度的條件下（KsI為常數(shù)），通過改變?nèi)芤簻囟群蚿H值，

9、使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法。p一般的初步分離用第一種方法，進一步純化時用第二種方法。一般的初步分離用第一種方法，進一步純化時用第二種方法。16較高的鹽析效能；高溶解度，能配置高離子強度的鹽溶液；溶解度受溫度的影響?。畸}溶液的密度不高，便于蛋白質(zhì)沉淀和離心分離；不易引起蛋白質(zhì)的變性；價格低廉；無機鹽的挑選原則：無機鹽的挑選原則： 在蛋白質(zhì)的鹽析中，通常采用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀等。其中以硫酸銨最為常用以硫酸銨最為常用。在鹽析時，溶液中硫酸銨的濃度通常以飽和度飽和度表示。 硫酸銨缺點：硫酸銨缺點： 緩沖能力較差， 銨離子會干擾蛋白質(zhì)的測定 水解后溶液pH降低， 在高 pH下產(chǎn)氨， 腐蝕

10、性強，有異味，終產(chǎn)物必須除盡。硫酸銨優(yōu)點：硫酸銨優(yōu)點： 在水中的溶解度大溫度系數(shù)小， 不影響酶的活性， 分離效果好， 價廉易得。18無機鹽添加方式19 等電點沉淀法等電點沉淀法 pH值作用于值作用于值中：值中：pI值通常在pH46范圍內(nèi)變化，一般用無機酸（如鹽酸、磷酸和硫酸）作沉淀劑。適用于：適用于：蛋白質(zhì)疏水性比較大和結合水比較小時的沉淀；提高等電點沉淀能力：提高等電點沉淀能力：與鹽析法、有機溶劑法或其他沉淀法結合使用。缺點：缺點：無機酸引起較大的蛋白質(zhì)不可逆變性。IKSSlgA、機理：有機溶劑的加入，使水溶液的介電常數(shù)降低，從而增大蛋白質(zhì)分子間的靜電引力，使蛋白質(zhì)互相吸引，進而凝集沉淀。B

11、、對具有水膜的分子而言，有機溶劑與水互相作用，使溶質(zhì)分子表面的水膜破壞，使其溶解度降低而沉淀析出。 有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀法 p常用的有機溶劑：常用的有機溶劑：乙醇、丙酮、異丙醇、甲醇等 。有機溶劑的用量一般為酶液體積的2倍左右。p影響因素及控制影響因素及控制pH值：值：蛋白質(zhì)最低溶解度出現(xiàn)在蛋白的pI處，因此一般將pH值調(diào)節(jié)到與分離 的蛋白質(zhì)的等電點附近。溫度：溫度：（1）有機溶劑與水混合時，會放出大量的稀釋熱，使溶液T顯著升高，對不耐熱的pro影響較大。（攪拌、少量多次加入，避免溫度驟然升高）溫度：溫度：（2）溫度還會影響有機溶劑對pro的沉淀能力，一般溫度越低，沉淀越完全，所以在乙醇

12、沉淀人血漿蛋白時，溫度控制在-10C下進行。有機溶劑：有機溶劑：通常隨有機溶劑濃度的上升，蛋白質(zhì)溶解度下降。如血纖維蛋白原的最大溶解度在乙醇濃度為8%時達到最大，而當乙醇濃度為40%時達到最小。蛋白質(zhì)：蛋白質(zhì)：避免使用很稀的濃度，因蛋白質(zhì)在高濃度下才較穩(wěn)定。23優(yōu)點：優(yōu)點：A、蛋白質(zhì)沉淀的濃度范圍較寬，所得產(chǎn)品的純度較高；B、從沉淀的蛋白質(zhì)中去除有機溶劑很方便，且有機溶劑本身可作為蛋白質(zhì)的殺菌劑。缺點：缺點：A、耗用大量溶劑，而溶劑來源、貯存都比較困難；B、沉淀操作需在低溫下進行，使用上有一定的局限性；C、收率比鹽析法低；D、試劑易燃，有毒。p 有機溶劑沉淀法特點有機溶劑沉淀法特點3.3 酶的

13、分離方法酶的分離方法（1 1） 沉淀分離沉淀分離（2 2） 離心分離離心分離（3 3） 過濾與膜分離過濾與膜分離（4 4） 層析分離層析分離（5 5） 電泳分離電泳分離（6 6） 萃取分離萃取分離（2 2） 離心分離離心分離 離心分離是借助于離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力離心力，使不同大小不同大小、不同密度不同密度的物質(zhì)分離的技術過程。根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的顆粒大小、密度和特性的不同，選擇適當?shù)碾x心機、離心方法和離心條件。沉降速率沉降速率：蛋白質(zhì)分子量、分子密度分子量、分子密度、組成、組成、形形狀狀有關。2/dtdxS 沉降沉降系數(shù)：系數(shù)：描述沉降性質(zhì)（與分子密度/分子量成正比）分子顆粒的沉降系數(shù)

14、是指單位離心力場顆粒下沉的速度，用S表示：離心力（離心力（RCF）相對離心加速度，指離心加速度a相對重力加速度g的倍數(shù)，單位為g。9803600)(422rrpmRCF離心力與轉(zhuǎn)速的換算離心力與轉(zhuǎn)速的換算8 . 298036006)65000(49803600)(42222rrpmRCF例題：顆粒距離離心機軸的半徑是例題：顆粒距離離心機軸的半徑是6 cm，轉(zhuǎn)速是，轉(zhuǎn)速是65000 rpm，求顆粒的，求顆粒的RCF是多少？是多少？ 常速離心機（低速離心機）常速離心機（低速離心機）最大轉(zhuǎn)速：最大轉(zhuǎn)速： 8000 rpm相對離心力(RCF)： 1104 g 應用：細胞、細胞碎片和培養(yǎng)基殘渣等固形物的分離，酶的結晶等較大顆粒的分離。 高速離心機：高速離心機：最大轉(zhuǎn)速：最大轉(zhuǎn)速：50,000rpm)轉(zhuǎn)速較低( 2m酵