生化制藥大實(shí)驗(yàn)葛根素的提取分離和精制

1、葛根素的提取、分離和精制一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 建立對生化物質(zhì)提取、分離及精制過程的認(rèn)識2. 了解溶劑萃取法、吸附分離法、柱層析法及結(jié)晶的基本原理3. 掌握大孔吸附樹脂的分離原理和基本操作4. 掌握葛根素的提取、分離和精制方法二、實(shí)驗(yàn)原理葛根（Radix Puerariae）為豆科植物野葛Pueraria lobata （Willd）ohwi的根，是常用的中藥，具有解肌退熱、生津、透疹、升陽止瀉等功效。圖1 葛根葛根中含多種黃酮類成分，主要活性成分為大豆素(daidzein）、大豆甙（daidzin）、葛根素（puerarin）、葛根素-7-木糖甙（puerarin-7-xyloside）等。其主要

2、成分為葛根素，即8-D-葡萄吡喃糖-4,7-二羥基異黃酮。葛根素具有擴(kuò)張冠脈和腦血管、降低心肌耗氧量、改善心肌收縮功能、促進(jìn)血液循環(huán)等作用。適用于冠心病、心絞痛、心肌梗死、視網(wǎng)膜動脈靜脈阻塞、突發(fā)性耳聾等疾病的治療，效果顯著。1. 萃取萃?。╡xtraction）是利用溶質(zhì)在互不相溶的兩項(xiàng)之間分配系數(shù)的不同而使溶質(zhì)得到純化或濃縮的方法。萃取是是工業(yè)生產(chǎn)中常用的分離、提取的方法之一。如果含有目標(biāo)產(chǎn)物的原料為固體，則稱此操作為液固萃取或浸取；如果含有目標(biāo)產(chǎn)物的原料為液體，則稱此操作為液液萃取。（1）液固萃取液固萃取通稱浸?。╨eaching），是用液體提取固體原料中的有用成分的擴(kuò)散分離操作。生物分

3、離過程中經(jīng)常需要利用液固萃取法從細(xì)胞或生物體中提取目標(biāo)產(chǎn)物或除去有害成分。例如，從咖啡豆中脫咖啡因，從草莓中提取花色苷色素，從植物組織中提取生物堿、黃酮類皂苷等。為了使固體原料中的溶質(zhì)能夠很快的接觸溶劑，需對原料進(jìn)行預(yù)處理，一般包括粉碎、研磨、切片等。固液萃取操作主要包括不溶性固體中所含的溶質(zhì)在溶劑中溶解的過程和分離殘?jiān)徒∫旱倪^程。（2）液液萃取用溶劑從溶液中抽提物質(zhì)叫液液萃取，也叫溶劑萃取。根據(jù)所用萃取劑性質(zhì)不同或萃取機(jī)制的不同，液液萃取可分為多種類型。經(jīng)典的液液萃取指的有機(jī)溶劑萃取，在生物產(chǎn)物中用于生物小分子的分離純化。即在液體混合物（原料液）中加入一種與其基本不相混溶的液體作為溶劑，

4、構(gòu)成第二相，利用原料液中各組分在兩個(gè)液相中的溶解度不同而使原料液混合物得以分離。選用的溶劑稱為萃取劑，以S表示；原料液中容易溶于S的組分，稱為溶質(zhì)，以A表示；難溶于S的組分稱為原溶劑（或稀釋劑），以B表示。液液萃取操作的基本過程：將一定量萃取劑加入原料液中，然后加以攪拌使原料液與萃取劑充分混合，溶質(zhì)通過相界面由原料液向萃取劑中擴(kuò)散。攪拌停止后，兩液相因密度不同而分層：一層以溶劑S為主，并溶有較多的溶質(zhì)，稱為萃取相，以E表示；另一層以原溶劑（稀釋劑）B為主，且含有未被萃取完的溶質(zhì)，稱為萃余相，以R表示。實(shí)現(xiàn)組分分離的萃取過程即由混合、分層、萃取相分離、萃余相分離等一系列步驟共同完成。2. 吸附分

5、離法吸附（adsorption）法是指利用吸附作用，將樣品中的生物活性物質(zhì)或雜質(zhì)吸附于適當(dāng)?shù)奈絼┥?，利用吸附劑對活性物質(zhì)和雜質(zhì)間吸附能力的差異，使目的物和其他物質(zhì)分離，達(dá)到濃縮和提純目的的方法。在工業(yè)生產(chǎn)中常用的吸附劑有活性炭、白陶土、氧化鋁、硅膠、大孔吸附樹脂等。3. 柱層析法圖2 柱層析示意圖柱色譜是常用色譜分析法的一種，它是將固定相裝于色譜柱內(nèi)，色譜過程在色譜柱內(nèi)進(jìn)行，按其粗細(xì)可分為一般柱色譜法、毛細(xì)色譜法及微填充柱色譜法，氣相色譜與高效液相色譜都屬于柱色譜范圍。其裝置如圖2所示，色譜柱內(nèi)裝有固體吸附劑（固定相），液體樣品從柱頂加入，在頂部被吸附劑吸附，然后，從柱頂部加入作為洗脫劑的有

6、機(jī)溶劑（流動相），由于吸附劑對各組分的吸附能力不同，各組分以不同速率下移，被吸附較弱的組分在流動相里的百分含量比吸附較強(qiáng)的組分要高，以較快的速率向下移動，而被吸附較強(qiáng)的組分則下移速率較慢，這樣，樣品中各組分經(jīng)過反復(fù)多次的吸附洗脫而隨溶劑以不同的時(shí)間從色譜柱下端流出，從而達(dá)到分離的目的。如果各組分為有色物質(zhì)，則可直接觀察到不同顏色的譜帶。分離得到的各組分用不同容器盛取后，可進(jìn)行定性、定量分析。由于色譜法經(jīng)濟(jì)、簡便、高效、準(zhǔn)確等，在藥物分離分析中獲得了廣泛的應(yīng)用。三、實(shí)驗(yàn)材料、試劑和設(shè)備1. 實(shí)驗(yàn)材料葛根，葛根素（8-D-葡萄吡喃糖-4，7-二羥基異黃酮）2. 實(shí)驗(yàn)試劑工業(yè)乙醇，正丁醇（AR），無

7、水乙醇（AR），甲醇（AR）3. 實(shí)驗(yàn)設(shè)備粉碎機(jī)，標(biāo)準(zhǔn)篩（10目），加熱回流裝置（1000 mL燒瓶、冷凝管、加熱套、溫度計(jì)、攪拌器），過濾裝置（布氏漏斗、濾紙、抽濾瓶），分液漏斗，量筒，燒杯（50 mL、100 mL、500 mL），錐形瓶（100 mL），滴管，鐵架臺，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，天平，容量瓶（100 mL、25mL），移液管（1 mL）；紫外分光光度計(jì)。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容本實(shí)驗(yàn)先用95乙醇從葛根中提取葛根素粗品，然后再用樹脂吸附法對粗品進(jìn)行分離純化，具體實(shí)驗(yàn)操作流程如下：五、實(shí)驗(yàn)步驟1. D101型大網(wǎng)格吸附樹脂的預(yù)處理大孔吸附樹脂（macfofeticulaf resin）是六十年代末發(fā)展起

8、來的一類有機(jī)高聚物吸附劑，它具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較好的吸附性能。D-101型大孔吸附樹脂是苯乙烯型弱極性共聚體，是一種多孔立體結(jié)構(gòu)的聚合物吸附劑，是依靠它和吸附物之間的范德華力通過巨大比表面進(jìn)行物理吸附。D-101具有物化性質(zhì)穩(wěn)定，對葛根異黃酮選擇性吸附能力強(qiáng)、容易解析、再生簡單、不容易老化、可反復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)。把葛根醇提取液通過大孔吸附樹脂，葛根素被吸附，而大量水溶性雜質(zhì)隨水流出，從而使葛根素與水溶性雜質(zhì)分離。大網(wǎng)格聚合物吸附劑在使用前使用要預(yù)處理，特別是新購買的大網(wǎng)格聚合物吸附劑，含有許多脂溶性雜質(zhì)。取50 g樹脂，用95%乙醇溶液浸泡樹脂24 h，充分溶脹后濕法裝柱，以2 BV/h的流速洗脫

9、，至流出液與水混合（比例15）不呈混濁為止，再用蒸餾水洗至無醇味，備用。2. 葛根的預(yù)處理稱取50g葛根，用粉碎機(jī)粉碎，過10目篩。將葛根粉末裝入到提取瓶中，加入6倍量的95%乙醇，過夜。3. 葛根素的粗提用加熱回流裝置從葛根中提取葛根素，一共加熱回流3次：第一次加6倍量的95%乙醇加熱回流提取2 h，過濾；第二次濾渣加入4倍量的95%乙醇加熱回流提取1.5 h，過濾；第三次濾渣加入2倍量的95%乙醇加熱回流提取1 h，過濾。合并三次提取液，減壓濃縮的粗提浸膏。4. 葛根素的分離將葛根素粗提物用適量的水溶解后，濾去不溶物，以2 BV/h的流速通過處理好的大孔樹脂柱（吸附劑用量為粗提物的7倍）。

10、穿透液重復(fù)吸附3次，靜置30 min。用蒸餾水洗去糖類、蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)等水溶性雜質(zhì)，至水清。改用70%乙醇洗脫（乙醇用量為粗提物的12倍），流速2 BV/h，收集洗脫液。濃縮回收乙醇至無醇味。5. 葛根素的精制洗脫液加等體積正丁醇萃取4次，合并正丁醇萃取液，回收正丁醇至干。6. 葛根素收率的測定將精制葛根素用甲醇溶解并定容至100 mL的容量瓶中。移取1 mL，用甲醇稀釋至25 mL的容量瓶中，即為樣品溶液。分析方法：（1）配制一系列葛根素為標(biāo)準(zhǔn)溶液（至少5個(gè)濃度梯度），以甲醇為空白，讀取248nm下的紫外吸收值。以濃度為橫坐標(biāo)、吸收值為縱坐標(biāo)，得線性回歸方程，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）樣品溶液，以甲

11、醇為空白，讀取248nm下的吸收值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算溶液濃度C。 （mg/g）六、注意事項(xiàng)1. 樹脂一定要在充分溶脹以后才能裝柱。2. 預(yù)處理好的樹脂，一直保持濕潤，不能脫水。3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，樹脂回收到指定的容器中。備注：1. 濕法裝柱步驟裝柱質(zhì)量是確保柱層析分離效果的技術(shù)關(guān)鍵之一。無論是手工、機(jī)械、自動化裝柱都是一樣的，要求裝入柱中的分離載體材料松緊適度，分布均勻，無氣泡、無斷層、無結(jié)節(jié)，能保持正常的溶脹形態(tài)和結(jié)構(gòu)。一般采用濕法填充，一般步驟為：層析柱底部若沒有石英砂，應(yīng)放置少量玻璃絲或棉花；要求它們不漏不堵、不吸附樣品，且能保持一定的流速；固定層析住，柱中加入1/5柱高的溶劑；樹脂應(yīng)充分溶脹。開始裝柱時(shí)，應(yīng)打開柱端閥門，并保