萌發(fā)麥苗淀粉酶活力的測定_實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、班級(jí)：植物142 學(xué)號(hào)：1401080229 姓名：劉國強(qiáng)實(shí)驗(yàn)七：萌發(fā)麥種的淀粉酶活力的測定1、 研究背景及目的酶是由生物體內(nèi)活細(xì)胞產(chǎn)生的一種生物催化劑。大多數(shù)由蛋白質(zhì)組成（少數(shù)為RNA）。能在機(jī)體中十分溫和的條件下，高效率地催化各種生物化學(xué)反應(yīng)，促進(jìn)生物體的新陳代謝。生命活動(dòng)中的消化、吸收、呼吸、運(yùn)動(dòng)和生殖都是酶促反應(yīng)過程。酶是細(xì)胞賴以生存的基礎(chǔ)。細(xì)胞新陳代謝包括的所有化學(xué)反應(yīng)幾乎都是在酶的催化下進(jìn)行的。因此，對(duì)酶的研究是十分重要的。通過對(duì)酶活性的測定，可以更好地了解生物體的代謝過程。2、 實(shí)驗(yàn)原理淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶類總稱，可以分成-淀粉酶，-淀粉酶等。-淀粉酶既作用于直鏈淀粉，亦作

2、用于支鏈淀粉，無差別地隨機(jī)切斷糖鏈內(nèi)部的-1，4-鏈。-淀粉酶與-淀粉酶的不同點(diǎn)在于從非還原性末端逐次以麥芽糖為單位切斷-1，4-葡聚糖鏈。 根據(jù)其催化產(chǎn)物的特點(diǎn)和現(xiàn)有測定方法規(guī)定酶活力單位為：每分鐘每克鮮重麥種所催化產(chǎn)生的麥芽糖毫克數(shù)。3,5二硝基水楊酸法是一種對(duì)還原糖定量測定的方法。還原糖和堿性二硝基水楊酸試劑一起共熱，產(chǎn)生一種棕紅色的氨基化合物，在一定的濃度范圍內(nèi)，棕紅色物質(zhì)顏色的深淺程度與還原糖的量成正比。因此，我們可以測定樣品中還原糖以及總糖的量。麥芽糖是還原性糖，可用該方法對(duì)其含量進(jìn)行測定。本實(shí)驗(yàn)分為兩部分，一是通過純化-淀粉酶活力完成-淀粉酶的活力測定，二是不進(jìn)行任何純化處理測定

3、總酶活力。 三、儀器試劑1、儀器設(shè)備：低溫冷凍離心機(jī)（Eppendorf 5804R）恒溫水浴鍋（ ）分光光度計(jì)（ ）托盤天平（JYT-1，原常熟市金羊天平儀器廠）2.試劑：（1）1%淀粉溶液，稱取1g可溶性淀粉，加入80ml左右蒸餾水，在電爐上加熱溶解，等冷卻后，定容到100ml。（2） pH5.6的檸檬緩沖液：A液（稱取檸檬酸20.01克，溶解后定容至1L）B液（稱取檸檬酸鈉29.41克，溶解后定容至1L）取A液5.5ml、B液14.5ml混勻即為pH5.5檸檬酸緩沖液；（3）3，5-二硝基水楊酸溶液（稱取3，5-二硝基水楊酸1.00克，溶于20ml 1M氫氧化鈉中，加入50ml蒸餾水，再

4、加入30克酒石酸鈉，待溶解后，用蒸餾水稀釋至100ml，蓋緊瓶塞，勿使二氧化碳進(jìn)入）；（4）麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液（稱取0.100克麥芽糖，溶于少量蒸餾水中，小心移入100ml容量瓶中，用蒸餾水定容到100ml）；（5）0.4M NaOH；3、 實(shí)驗(yàn)材料：萌發(fā)的小麥種子。四、實(shí)驗(yàn)步驟1.酶液的制備（蒸餾水浸提）：稱取2克萌發(fā)的小麥種子（芽長一厘米左右），置于研缽中加少量石英砂，蒸餾水作為勻漿液，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到50ml容量瓶中至40ml左右，浸提15-20分鐘，用蒸餾水定容到刻度，混勻后3500轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取出上清液備用（初始酶液）。2.淀粉酶活性的測定：（1）.取試管4支，注明兩支為對(duì)照管，

5、兩支為測定管。（2）.于每個(gè)管中各加入酶提取液1毫升，在70恒溫水浴中（水浴溫度的變化不應(yīng)超過0.5）準(zhǔn)確加熱15分鐘，取出后迅速在水浴中徹底冷卻。(3).在試管中各加入1ml pH5.6檸檬酸緩沖液。4).將測定管和對(duì)照管置于40（0.5）恒溫水浴中準(zhǔn)確保溫15分鐘后，向兩支對(duì)照管中各加入4ml 0.4MNaOH，再向各管分別加入40下預(yù)熱的淀粉溶液2ml，搖勻，立即放入40水浴中準(zhǔn)確保溫5分鐘后，向兩支測定管分別迅速加入4ml 0.4NaOH，然后準(zhǔn)備下步糖的測定。3.-淀粉酶及-淀粉酶總活性的測定：取酶液5ml，放入100ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度。混均后，取4支試管，2支為對(duì)照管

6、，2支為測定管，各加入稀釋后酶液1ml及pH5.6檸檬酸緩沖液1ml，以下步驟重復(fù)淀粉酶測定的第(4)步的操作。4.麥芽糖的測定：（1）.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取15ml具塞刻度試管7支，編號(hào)，按表1操作試劑 管號(hào)1234567麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液00.10.30.50.70.91.0蒸餾水1.00.90.70.50.30.10 表1.麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)管的制備搖勻后再加入3,5-二硝基水楊酸1毫升，搖勻，在沸水浴中準(zhǔn)確保溫5分鐘，取出冷卻，用蒸餾水稀釋到15毫升，混均勻后用分光光度計(jì)在520nm波長下進(jìn)行比色，記錄消光值，以消光值為縱坐標(biāo)以麥芽糖含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）.樣品的測定取以上各管中酶作用后的溶液

7、及對(duì)照管中的溶液各1毫升，分別放入15毫升具塞刻度管中，在加入1毫升，3,5-二硝基水楊酸試劑混勻，置于沸水浴中準(zhǔn)確煮沸5分鐘，取出冷卻，用蒸餾水稀釋至15毫升，混勻，用分光光度計(jì)在520nm波長下進(jìn)行比色，記錄消光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。5.結(jié)果計(jì)算-淀粉酶活性（毫克麥芽糖克-1鮮重分鐘-1）=（A-A）*樣品稀釋總體積/樣品重(g)*5（-+-）淀粉酶總活性（毫克麥芽糖克-1鮮重分鐘-1）= (B-B)* 樣品稀釋總體積/樣品重(g)*5A -淀粉酶測定管中的麥芽糖濃度A -淀粉酶對(duì)照管中的麥芽糖濃度B -及-淀粉酶總活性測定管中的麥芽糖濃度B -及-淀粉酶總活性對(duì)照管中的麥芽糖濃

8、度五、數(shù)據(jù)整理與計(jì)算麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：管號(hào)1234567麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度15(mg/ml)00.10.30.50.70.91.0OD520淀粉酶活力測定液：管號(hào)89101112131415項(xiàng)目-對(duì)照管-測定管+-對(duì)照管+-測定管OD520OD520均值麥芽糖濃度（mg/ml）結(jié)果計(jì)算：六、結(jié)果分析七、參考文獻(xiàn)1百度百科-淀粉酶百科名片 2 八、 思考題1、酶活力測定實(shí)驗(yàn)的總體設(shè)計(jì)思路是什麼？實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的關(guān)鍵你認(rèn)為是什麼？為什么？答：酶活力的測定其總體思路就是在最適條件下測定酶促反應(yīng)的初速度（底物消耗小于5%）。據(jù)此具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是底物過量的情況（一般S10KM），于酶的最適pH、溫度等條件下測定某種

9、酶作用產(chǎn)物的生成速度以表征酶的催化能力。所以本實(shí)驗(yàn)在保證以上要求下，以麥芽糖的生成量來表征淀粉酶的活力，并嚴(yán)格定義了酶活單位。在這個(gè)總體思路的指導(dǎo)下，我們首先必須關(guān)注的是：材料自身、原本就存在的被測定產(chǎn)物的含量！具體到本實(shí)驗(yàn)即是麥芽中自身已經(jīng)存在的麥芽糖。這部分酶作用產(chǎn)物是必須要精確刨除的，否則我們實(shí)驗(yàn)的最終定量便無法準(zhǔn)確。而這就是“對(duì)照管”要完成的任務(wù)。所以，所有的酶活力測定實(shí)驗(yàn)中都有所謂“對(duì)照管”的設(shè)計(jì)，其作用就是刨除所有非指定酶促反應(yīng)測定時(shí)間段內(nèi)的待測產(chǎn)物！以保證最終結(jié)果的可信準(zhǔn)確。這是酶活力測定中最關(guān)鍵的設(shè)計(jì)。2、本實(shí)驗(yàn)最易產(chǎn)生對(duì)結(jié)果有較大誤差影響的操作是哪些步驟？為什么？怎樣的操作策

10、略可以盡量減少誤差？答：浸提步驟。70溫度或15min時(shí)間控制不嚴(yán)格不準(zhǔn)確則可能導(dǎo)致淀粉酶未完全鈍化使測得活性偏大。應(yīng)嚴(yán)格控制溫度和時(shí)間。70水浴后需要立即冰浴，否則淀粉酶復(fù)性使測得淀粉酶活性結(jié)果偏大。向測定管中加入NaOH時(shí)應(yīng)迅速，否則酶與底物繼續(xù)反應(yīng)使結(jié)果偏大。3、-淀粉酶活性測定時(shí)70水浴為何要嚴(yán)格保溫15分鐘？保溫后為何要立即于冰浴中驟冷？答：由于-淀粉酶不耐熱，在70下處理一定時(shí)間可以鈍化，嚴(yán)格保溫15分鐘可以達(dá)到理想的鈍化效果，時(shí)間過長，-淀粉酶活性也會(huì)受到影響；時(shí)間不足，-淀粉酶鈍化不完全。保溫后立即驟冷是為了通過劇烈的溫變改變b-淀粉酶的結(jié)構(gòu)以防止在隨后的反應(yīng)中復(fù)性，這樣就保證

11、了在隨后的40溫浴的酶促反應(yīng)中，-淀粉酶不會(huì)再參與催化反應(yīng)。此外我認(rèn)為冰浴使酶迅速降溫，便于嚴(yán)格控制高溫處理時(shí)間的長短。4、pH5.6檸檬酸緩沖液的作用？各管于40水浴準(zhǔn)確保溫15分鐘的作用？答：酶實(shí)驗(yàn)體系的pH值變化或變化過大，會(huì)使酶活性下降甚至完全失活。加入pH5.6的緩沖液調(diào)至酶促反應(yīng)的最適pH，同時(shí)穩(wěn)定溶液的pH不至于在反應(yīng)過程中大幅波動(dòng)。 40水浴準(zhǔn)確保溫15分鐘為調(diào)整酶促反應(yīng)的最適溫度5、眾多測定淀粉酶活力的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中一般均采取鈍化b-淀粉酶的活力而測a-淀粉酶和測總酶活力的策略，為何不采取鈍化a-淀粉酶活力去測b-淀粉酶活力呢？這種設(shè)計(jì)思路說明什么？答：淀粉酶與淀粉酶的催化特性是

12、有差異的。淀粉酶主要作用于直鏈淀粉的-1，4-糖苷鍵，而且僅從淀粉分子外圍的非還原性末端開始，切斷至-1,6-鍵的前面反應(yīng)就停止了；而淀粉酶則無差別地作用于直鏈淀粉與支鏈淀粉的-1，4-糖苷鍵，所以淀粉酶需要淀粉酶淀粉支鏈的-1，4-糖苷鍵后才能完全體現(xiàn)其催化能力。 此外我認(rèn)為在實(shí)驗(yàn)中溫度比酸度更易控制，鈍化淀粉酶難度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于淀粉酶，而且若提高酸度鈍化淀粉酶，則回調(diào)最適pH時(shí)淀粉酶也有可能由于復(fù)性恢復(fù)活力。這種設(shè)計(jì)思路說明在測定酶的比活力時(shí)要綜合考慮各種可能出現(xiàn)的酶的性質(zhì)以及它們之間的聯(lián)系，也要考慮到實(shí)驗(yàn)操作的可行性。6、本實(shí)驗(yàn)中所設(shè)置的對(duì)照管的作用？它與比色法測定物質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)中設(shè)置的空白管有何異同？本實(shí)驗(yàn)可否用對(duì)照管調(diào)分光光度計(jì)的100%T？為什么？答：消除非酶促反應(yīng)（如淀粉酸性環(huán)境下加熱水解）和非測定時(shí)間內(nèi)的酶促反應(yīng)引起的麥芽糖的生成帶來的誤差。兩種都是為了消除非測定部分對(duì)光的吸收，空白組是為了消除溶液中溶劑等其它組分對(duì)光的吸收，而對(duì)照管是為了消除非測量所需反應(yīng)所得的多余溶質(zhì)對(duì)光的吸收。不可，因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線的確定是在空白的基礎(chǔ)上的，得到的是OD值與麥芽糖含量的關(guān)系7、我們所測定得到的總酶活力減去所測定得到的a-淀粉酶活力是否就等于b