發(fā)酵、釀造工藝實驗

1、第六部分發(fā)酵、釀造工藝實驗第一篇發(fā)酵工程設(shè)備發(fā)酵工程設(shè)備實驗項目及其各專業(yè)必修、選修表實驗序號實驗項目實驗學(xué)時實驗類型實驗類別面向?qū)I(yè)（以下打為必修，為選修，數(shù)字為開課學(xué)期）生科生技生工食品1小型生物反應(yīng)器的安裝與拆卸2驗證V (6 )V(5 )2小型連續(xù)培養(yǎng)實驗裝置的設(shè)計組建3綜合V (6 )V(5 )3體積溶氧傳遞系數(shù)的測定3綜合V (6 )V(5 )4搖床培養(yǎng)確定酵母菌體培養(yǎng)條件8綜合V (6 )V(5 )5反應(yīng)器培養(yǎng)液的火菌與接種培養(yǎng)8綜合V(7 )6pH電極、溶氧電極的校正2驗證V(7 )7生物制品的冷凍干燥6綜合V(7 )83M 3機械攪拌通風(fēng)發(fā)酵 罐結(jié)構(gòu)的認(rèn)識4驗證V(7 )91

2、M3中試發(fā)酵設(shè)備的操作方法12綜合V(7 )10面包酵母流加培養(yǎng)與分批培養(yǎng)試驗24綜合V(7 )實驗序號實驗項目實驗學(xué)時實驗類型實驗類別面向?qū)I(yè)（以下打為必修，為選修，數(shù)字為開課學(xué)期）生科生技生工食品學(xué)時合計727216第二篇釀造工藝學(xué)實驗釀造工藝學(xué)實驗項目及其各專業(yè)必修、選修表實驗序號實驗項目實驗學(xué)時實驗類型實驗類別面向?qū)I(yè)（以下打為必修，為選修，數(shù)字為開課學(xué)期）生科生技生工食品1葡萄酒釀造過程24/14綜合V (6 )，(4)2葡萄酒結(jié)束理化指標(biāo)的測定8/0綜合V (6 )，(4)3葡萄酒感官品評4/2綜合V (6 )，(4)4乳酸發(fā)酵工藝10/8綜合V (6 )，(4)5醋酸發(fā)酵工藝10

3、/8綜合V (6 )，(4)學(xué)時合計56/325632第一篇發(fā)酵工程設(shè)備實驗一小型生物反應(yīng)器的安裝與拆卸機械攪拌式生物反應(yīng)器，又稱發(fā)酵罐，是生物工程設(shè)備的重要組成部分，在微生物工程、酶工程、細(xì)胞工程（細(xì)胞培養(yǎng)）、基因工程（基因工程菌）等科學(xué)研究領(lǐng)域，生物反應(yīng)器均為生物技術(shù)轉(zhuǎn)化為產(chǎn) 品必要的設(shè)備。由于小型生物反應(yīng)器進(jìn)料、出料、清洗、電極校正等過程都不同于大型發(fā)酵罐，需要拆 卸之后進(jìn)行，因此熟悉生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)及安裝與拆卸操作是正確使用反應(yīng)器的前提。一、實驗?zāi)康恼莆丈锓磻?yīng)器安裝和拆卸的操作規(guī)程，認(rèn)識和了解生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)與功能。二、基本原理生物反應(yīng)器裝置分兩大部分：1.罐體及內(nèi)部的各傳感器、檢測電

4、極；2.罐外檢測控制裝置，蒸汽及無菌空氣系統(tǒng)。反應(yīng)器罐體具有可卸上蓋，與罐體是通過橡皮墊圈和螺栓密封。蓋上設(shè)有接種口、空氣進(jìn)口、尾氣出口、各種檢測儀表的插孔、 溫度傳感器及溶氧電極和 pH電極插口、消泡劑和酸堿液注入口、 取樣口、 備用口、壓力表、安全閥等；罐底部設(shè)有夾套層，用以熱交換，罐內(nèi)有攪拌槳葉、檔板、空氣分布器；罐外：連接各種傳感器及電極相應(yīng)的控制器，可以自動地調(diào)控試驗所需的培養(yǎng)條件；連接無菌空氣系統(tǒng)，并配備一臺自動調(diào)控裝置；連接蒸汽發(fā)生器，供滅菌使用。尾氣三、實驗裝置3 L園柱形機械攪拌式生物反應(yīng)器圖1機械通風(fēng)式攪拌生物反應(yīng)器四、實驗步驟1 .首先斷開所有電源。2 .卸下可移動的所有

5、檢測電極和探頭。3 .擰下螺栓，打開上蓋，檢查培養(yǎng)罐內(nèi)部是否清洗干凈。4 .插入校正完畢的pH電極和氧電極于罐側(cè)面相關(guān)位置，并與放大器連接。5 .加入配置好的培養(yǎng)液，加蓋（由于蓋上的零件較多，必須對準(zhǔn)位置后再蓋上去），并對稱擰緊螺母,直至上蓋被密封固定。6 . 將事先清洗干凈并開啟的尾氣過濾器裝于蓋上，安裝安全閥、泡沫傳感器、觀察燈、壓力計、取樣管，以及滅過菌的無菌空氣過濾器進(jìn)氣管等，剩余的孔洞須用硅膠塞和瞎塞擰緊備用。7 . 檢查檢測系統(tǒng)的連接，調(diào)試密閉。8 . 作出 3 L 機械通風(fēng)攪拌式生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)示意圖，注明各裝置名稱。9 . 標(biāo)注檢測系統(tǒng)的連接。五、 思考題 1.小型生物反應(yīng)器的

6、安裝和拆卸應(yīng)該注意那些問題？ 2. pH 電極、 溶氧電極如何校正？實驗二 小型連續(xù)培養(yǎng)實驗裝置的設(shè)計組建連續(xù)培養(yǎng)是在培養(yǎng)器中不斷補充新鮮營養(yǎng)物質(zhì)，并及時不斷地以同樣速度排出培養(yǎng)物，理論上對數(shù)生長期可無限延長。不同于分批培養(yǎng)發(fā)酵周期受培養(yǎng)基消耗殆盡的影響，連續(xù)培養(yǎng)使微生物在特定的環(huán)境中持續(xù)保持旺盛生長狀態(tài)，隨著培養(yǎng)基不斷加入，產(chǎn)物不斷生成排出，減少了非發(fā)酵時間，可提高發(fā)酵工業(yè)的生產(chǎn)效益和自動化水平。常用的連續(xù)培養(yǎng)方法有恒濁法與恒化法兩類，恒化連續(xù)培養(yǎng)在研究微生物利用某種底物進(jìn)行代謝的規(guī)律方面被廣泛采用。 本實驗設(shè)計組建實驗室恒化法培養(yǎng)裝置，有助于對恒化法連續(xù)培養(yǎng)及裝置特性加深理解。一、實驗?zāi)康?/p>

7、 設(shè)計組建小型微生物連續(xù)發(fā)酵裝置，掌握連續(xù)發(fā)酵的操作原理和方法。二、 實驗原理恒化法是通過控制培養(yǎng)基中營養(yǎng)物主要是生長限制因子的濃度來調(diào)控微生物生長繁殖與代謝速度的連續(xù)培養(yǎng)方式。由于培養(yǎng)基質(zhì)加入流量與產(chǎn)物流出的流量保持恒定，隨著培養(yǎng)時間的推移，培養(yǎng)器中各物質(zhì)濃度不隨時間改變， 稱為恒化法， 設(shè)計恒化器培養(yǎng)裝置除滿足液體深層培養(yǎng)所必須的條件外，著重在于滿足上述條件。三、實驗儀器與材料 三角瓶、玻璃槽、玻璃管、棉花、蠕動泵、橡膠管、磁力攪拌器、溫度計、酒精噴燈四、實驗步驟1. 用實驗室儀器設(shè)計一套恒化法連續(xù)培養(yǎng)裝置（厭氧培養(yǎng)），并組建安裝。2. 畫出你所組建的簡單連續(xù)培養(yǎng)裝置示意圖并注明各裝置的作

8、用。3. 設(shè)計出求算單級連續(xù)培養(yǎng)比生長速率的實驗步驟及求算科的過程。五、 思考題1.在你組建的裝置中如何實現(xiàn)培養(yǎng)器中基質(zhì)濃度的恒定？如何保證培養(yǎng)過程無污染？2.連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)在工業(yè)生產(chǎn)與科研上的意義？實驗三體積溶氧傳遞系數(shù)的測定單位體積發(fā)酵液氧傳遞系數(shù)kLa可稱為 通氣效率”，不同類型的發(fā)酵罐由于供氧裝置的不同其體積溶氧傳遞系數(shù)不同，kLa大意味著反應(yīng)器供給單位發(fā)酵液的氧的能力強。通過kLa的測定，可了解發(fā)酵過程中氧的傳遞效果的好壞，對提高氧的利用率和增產(chǎn)節(jié)能都有著重要意義。一、實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)運用亞硫酸鹽法測定小型生物反應(yīng)器的 kLa值。二、基本原理 用Cu2+為催化劑，溶解在水中的氧能立即將水中

9、的SO32室化成為SO42-,其氧化反應(yīng)的速度在很大范圍內(nèi)與 SO32-的濃度幾乎無關(guān)。因此氧化速率是控制氧化反應(yīng)的因素。其反應(yīng)式如下：2Na2SO3+ O22Na2SO4剩余的Na2SO3與過量的碘作用Na2SO3+l2+H2O1K Na2SO4+2HI剩余的I2用標(biāo)定的Na2s2O3溶液滴定。標(biāo)準(zhǔn)Na2s2。3溶液的用量取決于溶解氧的量。每1 ml溶氧可氧化2 mol Na 2SO3,也就消耗掉4 mol Na 2s2O3。因此每消耗1 mol Na 2s2O3 (與對比 樣的體積差)必有 1/4 mol溶氧在通氧過程中參與反應(yīng)。則：溶氧當(dāng)量 NV V N 60 mol/(L h) m t

10、 4Nv=K La C c*-c)KLa= Nv/0.21三、實驗儀器與材料3 L生物反應(yīng)器、250 ml三角瓶、25 ml移液管、滴定臺、滴定管、Na2SO3、CuSO4、碘溶液、Na2s2O3四、實驗方法與步驟1 .稱取12.6 g Na2SO3和0.072 g CuSO4。按實驗一方法打開發(fā)酵罐，將 1 L自來水加入到發(fā)酵罐中，開 始攪拌，依次加入 Na2SO3晶體和CuSO4,攪拌使完全溶解。取樣 10 ml,作為未通氣的對照組，注入 預(yù)先準(zhǔn)備好的過量的碘溶液中。2 .安裝好發(fā)酵罐，檢查使密閉。開閥通氣，打開攪拌器到常用轉(zhuǎn)速。氣閥開啟迅速調(diào)至預(yù)定空氣流量。當(dāng)罐內(nèi)溶液中有氣泡冒出時，開始

11、計時，作為通氧時間的開始。3 .氧化時間持續(xù)10-20 min,到預(yù)定時間停止通氣和攪拌，準(zhǔn)確記錄通氧時間。4 .取木¥ 10 ml作為樣液，注入預(yù)先準(zhǔn)備好的過量的與對照組所注入的相同量的碘溶液中。5 .在對照組與樣液中分別加入淀粉溶液3滴作為指示劑，分別用標(biāo)定的Na2s2O3溶液滴定，至碘溶液中藍(lán)色消失。6 .分別記錄對照組與樣液滴定所消耗Na2s2O3溶液的量。五、實驗結(jié)果滴定前讀數(shù)滴定后讀數(shù)滴定消耗量 V對照液滴定V1=樣液滴定V2=六、思考題 1.kLa的大小受哪些因素的影響？2.測定kLa值其他方法有哪些?實驗四搖床培養(yǎng)確定酵母菌體培養(yǎng)條件正交試驗（Orthogonal e

12、xperimental）是研究多因素多水平的試驗方法，它是根據(jù)正交性從全面試驗中挑選出部分有代表性的點進(jìn)行試驗，這些有代表性的點具備了均勻分散，齊整可比”的特點，是一種高效率、快速、經(jīng)濟(jì)的實驗設(shè)計方法，可大幅度減少試驗工作量，因而正交試驗在很多領(lǐng)域的研究中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。本實驗即是利用正交試驗的方法選擇酵母最佳培養(yǎng)基以掌握正交試驗的方法。一、實驗?zāi)康耐ㄟ^搖瓶法確定發(fā)酵周期，學(xué)習(xí)應(yīng)用正交法確定發(fā)酵培養(yǎng)基最佳配比。二、實驗原理1.培養(yǎng)周期的確定。生物量的測定方法有比濁法和直接稱重法等。由于酵母在液體深層通氣發(fā)酵過程中是以均一混濁液的狀態(tài)存在的，可采用直接比濁法進(jìn)行測定。搖瓶培養(yǎng)中通過定期取樣測定

13、酵母濃度，找出對數(shù)生長末期確定為培養(yǎng)終點。2.最佳培養(yǎng)基的確定。在碳源、氮源、無機鹽初步確定的前提下，通過四因素三水平正交試驗，可判斷四因素組合時各因素的最佳濃度，從而確定最佳培關(guān)苴 釬舉。三、實驗儀器與材料1.實驗儀器：全恒溫振蕩培養(yǎng)箱，分光光度計、電熱恒溫水浴槽、超凈工作臺、高壓滅菌鍋、天平；250 ml三角瓶、50 ml三角瓶、移液管（移液槍）。2.試驗材料：葡萄糖、蔗糖、 酵母膏、KH 2 P。4。四、實驗方法與步驟1.養(yǎng)基的配制（見表1, 2）表1正父表試驗設(shè)計(100 ml)因素水平葡萄糖蔗糖酵母膏KH 2PO411.00.00.50.522.01.01.01.033.02.02.

14、02.0表2正交表實驗方案編R葡萄糖蔗糖酵母膏KH 2 PO4生物量 （OD）(A)(C)0h 12h24h 36h48h60h(B)(D)1(1)(1)(1)(1)2(1)(2)(2)(2)3(1)(3)(3)(3)4(2)(1)(2)(3)5(2)(2)(3)(1)6(2)(3)(1)(2)7(3)(1)(3)(2)8(3)(2)(1)(3)9(3)(3)(2)(1)KiK2K3極差R2. 取250ml三角瓶將上述培養(yǎng)基配制200 ml,取6個50 ml三角瓶各裝入培養(yǎng)基10 ml,及剩余的培養(yǎng)基（用于測定時稀釋，當(dāng) OD 值小于或大于）于121 下滅菌 30 min ，冷卻。 （制備無菌

15、水）3. 冷卻后接種 0.5 ml （接種量為 5） ，置于 28 培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。4. 測 OD 值：將接種 0 h、12 h、 24 h、 36 h、 48 h、 60 h 不同時間的菌懸液搖均勻后于560 nm 波長、1 cm 比色皿中測定OD 值。比色測定時，用以未接種的培養(yǎng)基作空白對照，并將OD 值填入表中，最終確定最佳培養(yǎng)基的組成及發(fā)酵時間。5. 作各因素水平的K 圖。6. 根據(jù)試驗數(shù)據(jù)判定發(fā)酵時間及最佳培養(yǎng)基配比。五、思考題 1. 為什么要作 K 圖？如果實驗繼續(xù)深入，應(yīng)該改變那些因素水平，為什么？ 2.R 值反應(yīng)的是什么？有何意義？實驗五 反應(yīng)器培養(yǎng)液的滅菌與接種培養(yǎng)小型臺式玻

16、璃生物反應(yīng)器置于高壓鍋中滅菌， 而金屬制生物反應(yīng)器的滅菌是采用夾套層蒸汽加熱滅菌的方式進(jìn)行的。 由于結(jié)構(gòu)的差異小型生物反應(yīng)器滅菌與大型發(fā)酵罐滅菌操作有一定的差別， 小型生物反應(yīng)器的上蓋上有眾多的電極接口， 需防止蒸汽打濕； 蒸汽的進(jìn)出口路線也有所不同， 需保證蒸汽進(jìn)出暢通。通過實際操作熟悉滅菌的過程。1、 實驗?zāi)康?學(xué)習(xí)和掌握生物反應(yīng)器滅菌與接種培養(yǎng)的操作， 認(rèn)識和掌握運用現(xiàn)代化反應(yīng)器的操作規(guī)程及方法。2、 實驗原理將反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的溫度升至121 ， 以達(dá)到滅菌的效果， 滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至培養(yǎng)溫度后，即可接種培養(yǎng)。接種時，嚴(yán)格按照無菌操作進(jìn)行，避免雜菌污染。三、實驗儀器與材料1.實驗儀器5

17、L 升生物反應(yīng)器、蒸汽發(fā)生器、反應(yīng)器控制臺、三角瓶； 2.實驗材料 菌種：酵母菌；培養(yǎng)基：葡萄糖，酵母膏，蛋白胨，無機鹽。四、實驗步驟與方法1 .滅菌：在反應(yīng)器安裝就序后，接通電源，打開控制臺總開關(guān)，開啟冷卻水閥，分別按下溫度、pH 、溶解氧、 攪拌器開關(guān)鍵， 調(diào)節(jié)攪拌器轉(zhuǎn)速約 120 rpm ， 調(diào)整滅菌時間 （ 30 min） ， 設(shè)置滅菌溫度（121 ） ，同時，按下滅菌開關(guān)鍵。使電加熱器對罐底夾套層進(jìn)行加熱，罐內(nèi)溫度逐漸上升， 待溫度升至105 左右時，關(guān)閉廢氣出口閥。溫度繼續(xù)上升至滅菌溫度，自動保溫至設(shè)定時間后，由冷卻水自動冷卻至設(shè)置的發(fā)酵溫度。2 . 培養(yǎng)條件的確定：通人反應(yīng)器的空

18、氣是從空壓機經(jīng)空氣過濾器而成無菌空氣，再由空氣分布管送入滅過菌的培養(yǎng)罐內(nèi)。在控制臺上，設(shè)定所需的攪拌轉(zhuǎn)速、發(fā)酵溫度、 pH 值，并將空氣流量計的流量調(diào)至確定值。3 .接種與培養(yǎng)：將事先培養(yǎng)好的培養(yǎng)液（在三角瓶中進(jìn)行搖床培養(yǎng)，處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，以無菌操作方式倒入已滅過菌的帶有插在保險管套筒內(nèi)的注射針及軟管的三角瓶內(nèi)） 由接種口接入罐內(nèi)， 接種時，要在接種口的隔膜周圍放上浸有酒精的棉花或用 1-3 ml 乙醇覆蓋，點燃，以產(chǎn)生上升的氣流來防止雜菌污染。接種塞從無菌筒內(nèi)取出，然后將接種針穿過火焰和隔膜，慢慢插入中心部位，擰緊連接螺帽，直至插入部分固定。接種量大體上是培養(yǎng)液的百分之幾。如調(diào)節(jié) pH

19、 值和泡沫時，可將酸液和堿液及消泡劑裝入三角瓶，滅菌后，分別經(jīng)蠕動泵與反應(yīng)器連接，與罐體連接的方法與接種相同。這樣，通過控制臺的自動控制，就可以自動地連接流加，使罐內(nèi)保持所需pH 值和泡層狀態(tài)。4 . 取樣：為了了解培養(yǎng)過程中反應(yīng)物的變化情況，必須定時地進(jìn)行取樣，取樣時，要關(guān)閉排氣口，使罐內(nèi)處于正壓狀態(tài)，打開取樣口，培養(yǎng)液即可自動流出。但是，在第二次取樣時，必須注意將殘液放凈 后再取樣。五、思考題 1. 本實驗是采用何種方式滅菌的？你所了解的反應(yīng)器滅菌方式有哪幾種？2. 如何保證接種過程中不使反應(yīng)器內(nèi)部發(fā)生雜菌污染？實驗六pH 電極、溶氧電極的校正為了準(zhǔn)確測定發(fā)酵液的 pH 值和 0D 值，每

20、發(fā)酵周期需對pH 電極和溶氧電極進(jìn)行校正。特別是a)長期未用的電極和新?lián)Q的電極；b)被測溶液溫度與標(biāo)定時溫度相差過大時尤需校正。pH 電極的校正一、實驗?zāi)康?了解 pH 電極、溶氧電極的基本原理，掌握其校正方法及步驟。二、實驗原理待校正的 pH 電極是由氯化銀參比電極和玻璃電極組合在一起的復(fù)合玻璃電極。復(fù)合電極的內(nèi)層玻璃管與玻璃球泡相通，內(nèi)充以恒定 pH 植的標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液，從中引出氯化銀電極導(dǎo)線，組成玻璃電極(即指示電極) 。在外層玻璃管引入銀絲，其表面覆蓋一層AgCl 薄膜。從上部擴(kuò)大部分邊上的注液口加入飽和氯化鉀溶液， 就形成氯化銀電極， 在外玻璃管的下部， 開有一小口， 裝有多孔陶瓷芯，

21、使 KCl 溶液可稍許向外溶液滲漏， 即所謂液絡(luò)部。 復(fù)合電極的基本性能參數(shù)有電極轉(zhuǎn)換系數(shù) (也稱 Nernst 斜率) ，電極零電位，電極內(nèi)阻，參比電阻，電極響應(yīng)時間，耐高溫沖擊的次數(shù)等等，它們都有一定的要求和測試方法， 對新使用的電極或已經(jīng)發(fā)酵運行一段時間的電極， 其性能參數(shù)要發(fā)生變化， 對某些性能參數(shù)要進(jìn)行測定，決定是否可投入使用。三、實驗儀器與材料復(fù)合玻璃電極、pH操縱器、標(biāo)準(zhǔn)pH試劑、蒸儲水、Na2HPO4、檸檬酸四、實驗方法與步驟打開 pH 操縱器、測量范圍和溫度開關(guān)，將pH 電極的電插頭插入放大器插孔。首先測標(biāo)準(zhǔn)pH 試劑的溫度，然后記下緩沖液瓶子標(biāo)簽上的溫度條件下所得到 pH

22、值。緩沖液和電極組件應(yīng)該是在同樣的溫度，如果不是，則允許23 分鐘時間達(dá)到熱平衡。溫度恒定后，調(diào)節(jié)溫度。將電極浸入緩沖液 pH7.0 (0.2 mol/LNa 2HPO4 16.47mL, 0.1 mol/L檸檬酸3.53 mL)中，獲得穩(wěn)定 讀數(shù)就立即將pH 表(asymmetry )設(shè)定到緩沖液的值。將蒸餾水漂洗電極玻璃球泡部位，然后用軟紙輕輕擦干，再浸入第二種緩沖液pH9.2 ( 1/15mol/LNa 2HPO4)或 pH 4.0 (0.2 mol/LNa 2HPO4 7.71mL, 0.1 mol/L 檸檬酸 12.29 mL)中，獲得穩(wěn)定讀數(shù) 后，用斜率電位計( mV/pH )糾正

23、 pH 值。如此反復(fù)2-3 次，直至讀數(shù)與被測試劑相同并穩(wěn)定。以上程序不得顛倒，否則不能獲得有效的校準(zhǔn)。圖2復(fù)合玻璃電極的構(gòu)造五、思考題 1.在pH電極的校正操作過程中應(yīng)注意哪些事項？溶氧電極的校正一、實驗?zāi)康牧私馊芙馊苎酰―O）電極的基本原理，掌握其校正方法。二、實驗原理a電解型電極b原電池型電極圖3氧電極的類型1 .（極譜型）電解型電極電解型電極是由一個陰極（貴重金屬如鉗或金）、一個陽極（Ag/AgCl ）和一種電解質(zhì)，如中性NaCl溶液組成的。在某一溶氧濃度一定的溶液系統(tǒng)中，通過電極之間約0.6-0.8的電壓，使溶解氧在陰極上被還原，從電極的電流 電壓極譜圖（圖6）可以看出，OA為極譜殘

24、余電流；A點為氧的分解電壓，當(dāng) 外加電壓大于分解電壓A,這時電極輸出電流I隨著電壓增大而增加，當(dāng)達(dá) B點后，電極電流就不再隨著外加電壓而增加，即電極電壓進(jìn)入恒LN*)«41-3 d4 心防 0 8I*J5(V)10 u so圖4擴(kuò)散電流與氧濃度的關(guān)系定區(qū)，這時稱為飽和電流或擴(kuò)散電流。當(dāng)外加電壓繼續(xù)增至C點時，電極輸出電流迅速增加，這是由于水被還原成氧所造成的。從圖中也可看出飽和電流與溶氧濃度成正比關(guān)系。因此，只要把外加電壓固定在電流電壓圖中的平坦部分，電極輸出電流就可以校正測量溶解氧，這個固定電壓常選在0.60.8 V之間。反應(yīng)式為：陰極：O2 + 2H2O +2e- - H2O2

25、+ 2OH-H2O2 +2e- - 2OH-陽極： Ag +Cl- AgCi + e-總反應(yīng)：4Ag + O2 + 2H2O + 4Cl- 4AgCl + 4OH -用NaCl或KCl作為電解質(zhì)，電解質(zhì)在使用過程中被消耗，必須在一段時間后補充。2 .原電池型電極原電池型電極不采用外電壓，而是選用參比電位比陰極電位高的堿性金屬（鋅、鋁或鎘）作陽極， 以貴重金屬（銀或金）作陰極，這是氧就在陰極自發(fā)地被還原，產(chǎn)生電動勢。銀一鉛電池型電極的電子反應(yīng)為：陰極：O2 +2H2O + 4e- - 4OH-陽極：Pb - Pb+ 2e-總反應(yīng)：O2 +2Pb + 2H 2O - 2Pb（OH）2隨著時間的推移

26、，這一反應(yīng)也會氧化電極。為了校正氧電極，使液體被空氣中的氧飽和，假定飽和度被擴(kuò)大至100%顯示。電極的零點適宜用氧氣調(diào)節(jié)，因為電極顯示是氧分壓而不是氧濃度，顯然在 1 M KCl溶液中飽和時氧的實際濃度只有其 在水中濃度的73%,但還是假定空氣飽和時，在 1 M KCl溶液中得到與在水中相等的數(shù)值顯示。三、實驗儀器與材料溶氧電極、DO測量放大器（指示組件）、壓縮空氣、水浴鍋、鐵架臺、Na2SO3。四、實驗方法與步驟1. 將氧電極置于與恒溫水浴（溫度調(diào)至與被測發(fā)酵液相等）相連接的內(nèi)部盛有水的帶夾套燒杯中，并置于氣體分布管的上方，電極的連線與放大器連接并將放大器開關(guān)打開。2. 設(shè)置 0 ：將電極置

27、于飽和Na2SO3 溶液中，待DO 測量放大器顯示電壓值穩(wěn)定，調(diào)節(jié)零電位器，使數(shù)字顯示器達(dá)到 0 值。3. 設(shè)置滿量程：將空氣通入氣體分布管，使帶夾套燒杯中的水被空氣飽和，使其達(dá)到充分?jǐn)嚢琛ＴO(shè)置壓力選擇器至三檔中的任何一檔（即 100， 200， 800 mmHg ） ，使數(shù)字顯示器指向約95% ，再操作斜度電位器，仔細(xì)調(diào)節(jié)指示值，至95%顯示。4.精度檢查：用惰性氣體N2通入氣體分布管，使水飽和。顯示器將指向0,而在此操作期間，壓力選擇器 0 和斜度電位器不再調(diào)節(jié)。五、思考題 1.在校正溶氧電極時為何要待DO 測量放大器顯示電壓值穩(wěn)定？ 2.溶氧電極如何保養(yǎng)？實驗七、生物制品的冷凍干燥冷凍干

28、燥是利用升華的原理進(jìn)行干燥的一種技術(shù)， 將被干燥的物質(zhì)在低溫下快速凍結(jié)， 然后在適當(dāng)?shù)恼婵窄h(huán)境下使凍結(jié)的水分子直接升華成為水蒸氣逸出的過程。 在眾多的干燥方法中最能保證熱不穩(wěn)定性生物制品的質(zhì)量： 即生物活性不變、 外觀色澤均勻、 形態(tài)飽滿、 結(jié)構(gòu)牢固、 溶解速度快， 殘余水分低。應(yīng)用于疫苗、抗生素、菌種保藏等。要獲得高質(zhì)量的生物制品（包括部分發(fā)酵制品） ，對凍干的理論和工藝應(yīng)有一個比較全面的了解。一、 實驗?zāi)康?學(xué)習(xí)和掌握冷凍干燥設(shè)備的工作原理、 應(yīng)用范圍和操作要點； 掌握應(yīng)用凍干法干燥生物 活性物質(zhì)的方法和要求。二、實驗原理 物質(zhì)在干燥前始終處于低溫（凍結(jié)狀態(tài)），同時冰晶均勻分布于物質(zhì)中，升

29、華過程不會因脫水而發(fā)生濃縮現(xiàn)象，避免了由水蒸氣產(chǎn)生泡沫、 氧化等副作用。 干燥物質(zhì)呈干海綿多孔狀，體積基本不變，極易溶于水而恢復(fù)原狀。在最大程度上防止干燥物質(zhì)的理化和生物學(xué)方面的變性。三、實驗儀器與材料ALPHA1-2 凍干機、超低溫冰箱、生物酶制劑、圓底燒瓶。四、實驗方法與步驟1. 預(yù)冷凍。將已測酶活性的酶溶液置于冷凍容器中，于-80 超低溫冰箱2 h 進(jìn)行預(yù)凍。2. 啟動冷凍干燥機，當(dāng)溫度下降至-54 以下時，打開冷凍機蓋快速放入需要凍干的材料（注意戴手套操作，并打開瓶塞） ，密封凍干器。3. 抽真空，使真空度達(dá)到 20 Pa,維持36 h左右。4. 待凍干材料呈粉狀或膜狀后，關(guān)閉真空泵及

30、凍干機，待真空撤去后，先封好瓶蓋，再取出凍干材料。5. 將已凍干的酶測定活性，比較凍干前活性。五、注意事項1 . 制備樣品應(yīng)盡可能擴(kuò)大其表面積，厚度不超過 1 cm ，其中不得含有酸堿物質(zhì)和揮發(fā)性有機溶劑；2 . 樣品必須完全凍結(jié)成冰，如有殘留液體會造成氣化噴射；3 .注意冷阱約為-65 C,可以做低溫冰箱使用，但必須戴保溫手套操作防止凍傷；4 .啟動真空泵以前，檢查出水閥是否擰緊，充氣閥是否關(guān)閉，有機玻璃罩與橡膠圈的接觸面是否清潔 無污物，良好密封；5 . 一般情況下，該機不彳#連續(xù)使用超過48小時；6 .樣品在冷凍過程中，溫度逐漸降低，可以將樣品取出回暖一段時間后（仍處于冰凍狀態(tài)），繼續(xù)干

31、燥, 以縮短干燥時間。六、思考題 1.采用凍干法制備生物發(fā)酵劑中應(yīng)注意哪些問題？實驗八 3M3機械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐結(jié)構(gòu)的認(rèn)識機械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐在制藥、生物制品的生產(chǎn)開發(fā)中起著特別重要的作用。在眾多類型的發(fā)酵設(shè)備中，兼具通氣又帶機械攪拌的標(biāo)準(zhǔn)式發(fā)酵罐用途最為普遍，廣泛使用于抗生素、氨基酸、有機酸、酶制 劑等領(lǐng)域，在生物制品工廠廣泛使用。據(jù)不完全統(tǒng)計，占發(fā)酵罐總數(shù)的70%-80%,故又稱通用式發(fā)酵罐。一、實驗?zāi)康耐ㄟ^實地觀察，了解機械攪拌式發(fā)酵罐的內(nèi)部結(jié)構(gòu)組成，各裝置的配備安裝及功能。二、實驗原理 機械攪拌式發(fā)酵罐主體包括罐身、攪拌器、軸封、消泡器、中間軸承，空氣分布器、擋 板、冷卻裝置、人孔等，配

32、套裝置：各工藝參數(shù)監(jiān)測系統(tǒng)、空氣除菌系統(tǒng)、蒸汽熱力系統(tǒng)等。發(fā)酵罐主 體各裝置依據(jù)設(shè)計規(guī)范達(dá)到各自設(shè)置的作用。三、實驗設(shè)備3M 3機械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐.四、實驗方法與步驟1 .打開人孔及內(nèi)視燈觀察以下各裝置。1.1 罐體的材料、高徑比、封頭形式。1.2 攪拌器組數(shù)、葉輪類型。1.3 擋板的組數(shù)及安裝。1.4 空氣分布裝置的形式。1.5 軸封的類型和結(jié)構(gòu)。1.6 消泡裝置類型和安裝。1.7 冷卻裝置的類型。1.8 進(jìn)料、進(jìn)氣、排料、出料、取樣裝置。1.9 加熱、冷卻裝置。1.10 壓力、溫度、pH、溶氧控制接口。2 .作出3 M3機械通風(fēng)攪拌式生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)示意圖，標(biāo)注以上各裝置名稱。圖5機械攪拌

33、通風(fēng)發(fā)酵罐參考示意圖3 .考察本設(shè)備配備的蒸汽系統(tǒng)組成。4 .考察本設(shè)備所配備的空氣除菌系統(tǒng)組成，并作出空氣除菌流程示意圖。五、思考題 1.小型和大型生物反應(yīng)器設(shè)計上有什么不同點？2.本設(shè)備所選用的攪拌葉輪、機械消泡裝置、冷卻裝置分別為何種形？除此之外分別還有哪些類型？3.本設(shè)備配備的蒸汽系統(tǒng)蒸汽生產(chǎn)量多大？5 .本設(shè)備所配備的空氣除菌系統(tǒng)為幾級？分別采用何種過濾器？實驗九1 M3中試發(fā)酵設(shè)備的操作方法發(fā)酵車間實地訓(xùn)練是培養(yǎng)技能型人才，增強工程意識的必要途徑。通過中試發(fā)酵設(shè)備全方位的直接操作真正提高學(xué)生的適應(yīng)能力和實戰(zhàn)技能。一、實驗?zāi)康?1.通過發(fā)酵中試車間實訓(xùn)， 體驗上罐操作的全過程。2.熟

34、悉車間管路布置及各設(shè)備性能。3.掌握空氣過濾系統(tǒng)操作、冷卻系統(tǒng)操作、工藝參數(shù)控制。4.加深對分批培養(yǎng)的基本原理及過程的理解。二、實驗原理微生物技術(shù)產(chǎn)品從實驗室到工業(yè)生產(chǎn)的開發(fā)過程中，需要進(jìn)行小試、中試、生產(chǎn)逐級放大培養(yǎng)，中試培養(yǎng)已經(jīng)近似于生產(chǎn)發(fā)酵。其工藝環(huán)節(jié)包括：空消、實消、空氣除菌、接種、移鐘、消泡、進(jìn)料、取樣、出料等；工藝參數(shù)控制包括：溫度、 pH值、溶氧、壓力等。、實驗設(shè)備與材料1M3機械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐、食用菌。相忖1莖圖6發(fā)酵罐檢測裝置配備示意圖四、實驗操作步驟1 .空消：首先，清洗培養(yǎng)罐內(nèi)部，特別要注意在空氣分布或取樣管導(dǎo)出殘留污物。罐內(nèi)加入20%30%的水后，通入加熱蒸汽（蒸汽需經(jīng)

35、過濾膜過濾），在121c下殺菌15 min。殺菌過程中不斷地打開閥門， 確保徹底殺菌。殺菌完成后，從取樣管將罐內(nèi)液體排出。2 .培養(yǎng)基制備：培養(yǎng)基的加入量一般為罐容積的50%60%。將稱量好的培養(yǎng)基組分，經(jīng)溶解后加入到發(fā)酵罐中。此時培養(yǎng)液的體積為實際所需培養(yǎng)基容積的80%。由于蒸汽殺菌過程中有大量的蒸汽轉(zhuǎn)變?yōu)樗?，使發(fā)酵液體積增大。對于合成培養(yǎng)基的滅菌操作，葡萄糖與磷酸鹽應(yīng)分別滅菌后，在開始培養(yǎng)前加入以避免在殺菌過程中，葡萄糖與氮化合物之間發(fā)生美拉德反應(yīng)，以及磷酸鹽與其他金屬離子形成沉淀。3 .安裝控制裝置：安裝調(diào)試好 PH電極、溶氧電極。4 .實消與冷卻：夾套內(nèi)通入加熱蒸汽，是培養(yǎng)液溫度達(dá)到8

36、0 c以上。隨后將蒸汽直接通入發(fā)酵罐，在121c下殺菌15 min。殺菌過程中，間斷打開各閥門，排出內(nèi)部空氣，以保證各出管內(nèi)殺菌完全。此時 如果不采用夾套預(yù)熱至一定溫度，直接通入蒸汽殺菌的話，培養(yǎng)基裝置內(nèi)冷凝水增加，將增加培養(yǎng)液體積調(diào)節(jié)的難度。殺菌完全后，夾套內(nèi)通入冷卻水，進(jìn)行培養(yǎng)基的冷卻。為保證罐內(nèi)正壓，應(yīng)通入適量無菌空氣。5 .操作條件的設(shè)定：在無菌條件下連接好酸、堿消泡劑等流入管線。設(shè)定好通風(fēng)量（一般為0.52L/min.L ）、溫度和 pH 值。6 .接種、培養(yǎng)：將浸有酒精的脫脂棉圍繞在接種口周圍，點火后打開接種口，加入無菌水，調(diào)節(jié)好罐 內(nèi)培養(yǎng)液量（必要時應(yīng)加入葡萄糖、 磷酸鹽等溶液）

37、，進(jìn)而將種子培養(yǎng)液注入。 接種量一般為1%10%, 蓋好接種口后，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)數(shù)至所需值，培養(yǎng)開始。7 . 取樣：為了解培養(yǎng)過程中的變化，需定時取樣進(jìn)行樣品分析。由于罐內(nèi)為正壓，打開取樣管時，樣品自然流出。 取樣時應(yīng)將上一次取樣時殘留在取樣管中的培養(yǎng)液去除后在取樣。 另外， 取樣后應(yīng)通入加熱蒸汽，以防取樣管路污染雜菌。8 . 培養(yǎng)結(jié)束：將電極與培養(yǎng)液全部取出，培養(yǎng)液在121 下殺菌 15 min 后，排出到指定地點。罐內(nèi)應(yīng)沖洗干凈。五思考題 1.發(fā)酵罐的放大有哪些方法？國內(nèi)常用的方法有哪些？實驗十 面包酵母流加培養(yǎng)與分批培養(yǎng)試驗流加培養(yǎng)又稱補料分批培養(yǎng)，是在分批培養(yǎng)的過程中，間歇或連續(xù)地補加新鮮

38、培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法。其優(yōu)點可使發(fā)酵系統(tǒng)中維持很低的限制性底物濃度， 減少底物的抑制或其分解代謝物的阻遏作用， 避免出現(xiàn)限制性底物濃度過高影響菌體得率和代謝產(chǎn)物生成速率的現(xiàn)象。 本實驗通過面包酵母流加培養(yǎng)與分批培養(yǎng)的結(jié)果加以驗證。一、實驗?zāi)康?1. 以斜面菌種活化為起始，經(jīng)實驗室菌種擴(kuò)大、車間菌種擴(kuò)大至發(fā)酵罐培養(yǎng)，熟悉發(fā)酵培養(yǎng)的全過程； 2. 對比分批培養(yǎng)與流加培養(yǎng)面包酵母菌生長過程及菌體得率； 3. 鞏固滅菌、空氣過濾、冷卻、發(fā)酵罐工藝參數(shù)控制等操作過程； 4. 加深補料分批續(xù)培養(yǎng)的基本原理的理解，熟悉流加補料過程的控制方法； 5. 熟悉菌體離心分離及真空干燥過程的操作。二、實驗原理面包酵母在通

39、風(fēng)供氧充足的前提下，培養(yǎng)基中葡萄糖為限制性基質(zhì)，葡萄糖的濃度對于提高酵母得率是至關(guān)重要的。 本實驗面包酵母培養(yǎng)的目的是獲得最大酵母濃度， 因此采用葡萄糖流加培養(yǎng)，并比較同樣條件下分批培養(yǎng)的效果。三、菌種與培養(yǎng)基1. 菌種：面包酵母2.培養(yǎng)基酵母斜面培養(yǎng)基10。麥芽汁固體斜面，pH5.0;酵母搖瓶種子培養(yǎng)基10。麥芽汁，pH5.0或葡萄糖 10% ，玉米漿 1% ，尿素 O.2% ， pH5.0 ；酵母分批發(fā)酵培養(yǎng)基玉米粉經(jīng)液化、糖化，折合葡萄糖濃度為 10% ，玉米漿 1%，硫酸銨 0.4% ， pH5.5 。四、實驗設(shè)備與材料1.30L 、 300L 種子罐； 3M3 全自動發(fā)酵罐；2 .搖

40、床；3 .超凈工作臺；4 .離心機；5 .顯微鏡；6 .分光光度計7 .滅菌鍋8 .培養(yǎng)箱9 .真空干燥箱10 .試管，棉塞，500ml三角瓶，5L三角瓶，分口膜。五、實驗方法與步驟1 .分批培養(yǎng)1.1 總流程斜面培養(yǎng)（斜面培養(yǎng)基配制、滅菌，接種，培養(yǎng)） 一搖瓶種子培養(yǎng)一種子罐培養(yǎng)（糖化液稀釋 至10%濃度，添加輔料，滅菌，接種。）一發(fā)酵罐培養(yǎng) 一菌體分離。1.2 斜面種子制備自保藏斜面中挑取一環(huán)酵母菌體接入新鮮的斜面試管中，于28c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。1.3 搖瓶種子的制備將上述培養(yǎng)好的斜面種子接入500ml三角瓶裝的滅過菌的100ml搖瓶種子培養(yǎng)基中，在28 C, 200rpm震蕩培養(yǎng)15

41、-20h。1.4 種子罐培養(yǎng)于30L發(fā)酵罐裝入20L發(fā)酵培養(yǎng)基，121c滅菌20min,冷卻至30C,將培養(yǎng)好的搖瓶種子接入發(fā)酵罐（接種量2-3%）進(jìn)行發(fā)酵。培養(yǎng)條件為：溫度28C,攪拌轉(zhuǎn)速200rpm,通風(fēng)量1vvm。1.5 發(fā)酵罐培養(yǎng) 按實驗八中步驟，進(jìn)行空罐滅菌（包括空氣過濾器滅菌）、實罐滅菌操作。消泡劑滅菌。將種子罐中的酵母菌種壓送至發(fā)酵罐，通氣量在3- 5 L/min ,攪拌轉(zhuǎn)數(shù)200rpm ,接種量10%。發(fā)酵條件1.4同種子罐培養(yǎng)。1.6 過程監(jiān)控0小時：取樣測定總糖和還原糖；4-24小時：每隔4小時取樣鏡檢、測定還原糖、菌體濃度。2 .流加培養(yǎng)2.1 種子制備同分批培養(yǎng)種子制備

42、過程。2.2 流加培養(yǎng)前的準(zhǔn)備工作葡萄糖于流加儲罐滅菌。2.3 流加培養(yǎng)通氣量3-5 L/min,攪拌轉(zhuǎn)數(shù) 200 rpm ,接種量10%?？刂屏骷觾迚毫κ惯_(dá)到流加25g/100mL葡萄糖，當(dāng)發(fā)酵罐內(nèi)葡萄糖濃度達(dá)到2030g/L,滴加0.1 mol/L氨液，控制培養(yǎng)液pH值為1.1 。通過調(diào)節(jié)風(fēng)量和攪拌轉(zhuǎn)數(shù)控制溶氧濃度在10%左右。1.4 過程監(jiān)控 同1.6步驟。3 .菌體離心分離將分批培養(yǎng)與流加培養(yǎng)發(fā)酵液用布袋初步過濾，放入離心機，轉(zhuǎn)速1000r/min ,10min.。4 .菌體干燥4.1 將離心分離后的菌體置于不銹鋼托盤放入真空干燥箱，將箱門關(guān)上，并關(guān)閉放氣閥，開啟真空閥， 再開啟真空

43、泵電源開始抽氣，使箱內(nèi)達(dá)到所需真空度，關(guān)閉真空閥，再關(guān)閉真空泵電源開關(guān)。4.2 把真空干燥箱電源開關(guān)撥至“處，設(shè)定溫度 60C,箱內(nèi)溫度開始上升，當(dāng)箱內(nèi)溫度接近設(shè)定溫度時，加熱指示燈突亮突熄，反復(fù)多次，一般 120min以內(nèi)擱板層面進(jìn)入恒溫狀態(tài)。4.3 當(dāng)所需工作溫度較底時，可采用二次設(shè)定方式，如所需工作溫度60 C,第一次可以設(shè)定 50 C,等溫度過沖開始回落后， 再第二次設(shè)定60 C,這樣可降低甚至杜絕溫度過沖現(xiàn)象， 盡快進(jìn)入恒溫狀態(tài)。（注 意：智能型儀表請參照操作方法）4.4 干燥時間12h.當(dāng)干燥時間較長，真空度下降，需再次抽氣恢復(fù)真空度，應(yīng)先開啟真空泵電機開關(guān)， 再開啟真空閥。4.5

44、 干燥結(jié)束后，先關(guān)閉電源，旋動放氣閥，解除箱內(nèi)真空狀態(tài)，再打開箱門取出物品。（解除真空后，因密封圈與箱門吸緊變形不易立即打開箱門，經(jīng)過一段時間后，等密封圈恢復(fù)原形后，才能方便開啟箱門。）5 .稱重 干燥結(jié)束后取出菌體，計算菌體總得率。六、分析方法1 .菌體量（X）生物量的測定生物量的測定方法有比濁法和直接稱重法等。比濁法。以空白培養(yǎng)基為對照，在550 nm處測定發(fā)酵液的吸光值。酵母濃度測定（濕重法）:吸取5ml菌液，2500rpm離心5min ,去上清液，稱量菌體濕重。2 .還原糖的測定斐林試劑法3 .發(fā)酵活力的測定（選彳）:稱取0.26g鮮酵母，力口 5g在30c下恒穩(wěn)1h的面粉制成面團(tuán)。置

45、于30c水中.測定面團(tuán)從水底浮出的時間。浮起時間在15min內(nèi)認(rèn)為樣品合格。4 .分析決定初始體積 V0,比生長速率 科及菌體濃度X的測量，補料速度F與補料濃度SF的計算與控 制。七、實驗結(jié)果 1.分別畫出分批培養(yǎng)與流加培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液中葡萄糖（g/L）、酵母菌體量（g/L）隨流加培養(yǎng)時間的變化曲線；2.分別計算酵母產(chǎn)率（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，葡萄糖）。八、討論 1.流加培養(yǎng)與分批培養(yǎng)菌體濃度的區(qū)別何在及原理分析；2.推導(dǎo)理想狀況下準(zhǔn)穩(wěn)態(tài)恒速流加與與時間參數(shù)的方程。第二篇釀造工藝學(xué)實驗實驗一葡萄酒的釀造一、目的與要求1 .確定葡萄酒釀造的最佳工藝條件，同時簡單了解葡萄酒釀制的工藝原理。2 .掌握干紅葡萄

46、酒釀造中發(fā)酵的監(jiān)控方法及相關(guān)的操作要求。3 . 了解如何確定葡萄酒酒精發(fā)酵的結(jié)束，同時對葡萄酒進(jìn)行分離和封裝，轉(zhuǎn)入后發(fā)酵階段。4、熟悉各個理化指標(biāo)的測定方法。二、實驗原理葡萄酒釀造就是將葡萄轉(zhuǎn)化為葡萄酒。它包括兩個階段：第一階段為物理化學(xué)或物理學(xué)階段，即在釀造紅葡萄酒時，葡萄漿果中的固體成分通過浸漬進(jìn)入葡萄汁，在釀造白葡萄酒時， 通過壓榨獲得葡萄汁；第二階段為生物學(xué)階段，即酒精發(fā)酵和蘋果-酸乳酸發(fā)酵階段。葡萄酒釀造的目標(biāo)就是，實現(xiàn)對葡萄酒感官平衡及其風(fēng)格至關(guān)重要的這些口感物質(zhì)和芳香物質(zhì)之間的平衡，然后保證發(fā)酵的正常進(jìn)行。醛母菌C.Hq » £CtH5OH+2 C Os蕭萄糖

47、酒精+二氧化碳葡萄的糖分，全部由葡萄糖與果糖構(gòu)成，這兩種糖在酵母作用下， 直接發(fā)酵生成乙醇和二氧化碳及種種副產(chǎn)物，同時放出熱量。二、實驗儀器與材料1. pH計、手持糖量計、溫度計、天平、量筒、燒杯、比重計、水浴鍋、電爐、移液管、錐形瓶、容量 瓶、5L玻璃瓶、塑料盆，紗布。2.斐林試劑A、B液，1%次甲基蘭，0.1mol/L氫氧化鈉溶液、1%酚酬:指示劑、鄰苯二甲酸氫鉀，95%酒精，鹽酸、亞硫酸、白砂糖、酵母、 KHCO 3O三、實驗方法與步驟（一）原料篩選：選擇新鮮、無腐爛、充分成熟的葡萄釀造葡萄酒。選好原料后注意除去殘枝敗葉和青 果，盡量避免接觸水分和長期存放。無論生產(chǎn)白葡萄酒還是紅葡萄酒，

48、都要選用含糖量高的原料，含糖多則產(chǎn)酒精多，如果100毫升的葡萄汁中能夠含17克糖，也就是17%的含糖量， 發(fā)酵后酒精度可以達(dá)到10度。此外， 含酸量最好是0.6-1.0克/毫升葡萄汁， 以造成酸性環(huán)境，便于酵母菌的生長繁殖，同時也可以增進(jìn)葡萄酒的風(fēng)味。葡萄的出汁率越高越好，這樣可以少用原料，降低成本。要達(dá)到以上要求， 葡萄就要充分成熟。我國栽培的優(yōu)良釀酒葡萄品種很多，例如， 釀造白葡萄酒的品種有意斯林、霞多麗、雷司令、賽美容、白詩南、白玉霓、瓊瑤漿、龍眼等。釀造紅葡萄酒的品種有赤霞珠、品 麗珠、梅鹿輒、寶石、西拉、黑彼諾、法國蘭、蛇龍珠等。（二）破碎：破碎的目的是使葡萄汁液與酵母菌接觸，這樣，

49、酵母菌可以充分地利用葡萄汁中的糖分進(jìn)行發(fā)酵。破碎時要注意以下幾點：1、破碎要充分，盡量使每顆葡萄果粒的果皮都能被壓破。2、破碎時不要壓破種子，以免種子中的油脂、 單寧、糖昔等物質(zhì)溢流到葡萄汁中而引起葡萄酒產(chǎn)生麻、澀、苦等異味。3、避免與銅、鐵容器接觸，以免增加酒中的銅、鐵含量，影響酒的質(zhì)量，破碎機和壓榨機與葡萄汁接觸的部件最好用不銹鋼制成。4、腐爛的果粒和沒有成熟的青果粒都會影響酒的質(zhì)量，破碎前應(yīng)摘除干凈。5、作紅葡萄酒，破碎時要將果梗去除，因為果梗中含有較多的單寧、樹脂等，會給酒帶來過重的澀味。而且，果梗中的水分較多，帶梗破碎會增加葡萄汁的含水量、降低含糖量。破碎是用各種類型的破碎機進(jìn)行的。

50、（三）壓榨：壓榨是將果實的汁液或剛完成發(fā)酵的新酒與果實皮、渣分離開的工序。作紅葡萄酒時，壓榨是在前發(fā)酵完成以后進(jìn)行的， 而作白葡萄酒時， 壓榨是在發(fā)酵以前進(jìn)行的。為提高出汁率，作白葡萄酒時可以帶梗進(jìn)行破碎和壓榨， 另一方面， 因為作白葡萄酒是果汁發(fā)酵， 果汁中單寧含量少， 如 果帶梗壓榨可以增加葡萄汁中單寧含量， 反而對酒的澄清有利。 壓榨的關(guān)鍵是掌握好壓力， 既要使葡萄汁或者新酒被充分地壓榨出來， 又不能壓破種子。 為了保證酒的質(zhì)量， 可以采用分次取汁的方法， 將不加壓力或者稍加壓力便自行流出的汁稱為自流汁， 是作優(yōu)質(zhì)酒的原料， 大約占汁液總量的 50%-55% ，然后施加壓力榨出的汁稱為壓

51、榨汁， 亦可用來釀制質(zhì)量較好的酒。 如果在果實皮渣中加人水， 攪拌后還可溶出一些可溶性的物質(zhì)， 然后再榨出的汁稱為 “ 二道汁 ” ， 這種汁液只能作質(zhì)量較差的酒， 或 者發(fā)酵后進(jìn)行蒸餾作白蘭地。（四）果汁成分的調(diào)整 ：果汁中的糖、酸和單寧等，既與發(fā)酵有密切的關(guān)系，又影響成品品質(zhì)。釀制一般果酒， 壓榨的果汁即可進(jìn)行發(fā)酵， 但為了使釀成的酒中成分接近， 且質(zhì)量良好， 并促使發(fā)酵安全進(jìn)行，必須根據(jù)果汁成分的情況進(jìn)行調(diào)整。1. 糖分調(diào)整 ：糖是產(chǎn)生酒精的基礎(chǔ)。酒精的含量對于葡萄酒的貯藏是有力的保證， 酒精含量低的新酒在陳釀期間很容易受到雜菌的感染， 一般來說， 酒精度為 14度以上的酒才是安全的。所

52、謂“ 酒精度 ”是指在100毫升的酒液中含有1毫升的酒精為酒精度 1度。 而生成1度酒則需要在100毫升葡萄汁中含有1.7克的糖或者 1 升葡萄汁中含有17克糖。 增加酒精濃度的方法有兩種， 一是補加糖使生成足量濃度的酒精，一是發(fā)酵后補加同品種高濃度的蒸餾酒或經(jīng)處理過的酒精。 實踐中， 釀制優(yōu)質(zhì)葡萄酒須用前者。 補加酒精量以不超過原果汁發(fā)酵的酒精量的 10%為宜。生產(chǎn)上， 可以根據(jù)我們所要求達(dá)到的酒精度以及葡萄中實際的含糖量來計算需要加人的糖量。（舉例來講， 現(xiàn)有含糖量為 14%的葡萄， 要釀造 1000升14度的葡萄酒， 需加多少糖？已知， 100升葡萄汁需1.7公斤糖生成1度酒。那么， 1

53、00升葡萄汁需1.7*14 公斤糖生成14度的酒， 即為 23.8公斤糖。100升葡萄汁中現(xiàn)有糖14公斤。需加糖23.8-14=9.8公斤。）加糖時還應(yīng)結(jié)合酵母菌對糖液濃度的適應(yīng)性。酵母菌在含糖20克/100毫升以下的糖液中，繁殖、發(fā)酵都較旺盛，再增高糖濃度，繁殖、發(fā)酵就延緩。因此，生產(chǎn)上釀制高酒度的葡萄酒常用分次加糖法，即先加適量的糖，以適應(yīng)酵母旺盛地繁殖發(fā)酵，等發(fā)酵降低糖濃度后， 再加剩余的糖。 加糖時先將糖溶于一部分葡萄汁中， 然后再兌到全部葡萄汁中去， 并將其攪拌均勻2. 酸度調(diào)整 ：發(fā)酵時，果汁中的含酸量以0.6 1.2克/100毫升為適宜。這是因為酵母菌只有在適宜的酸性條件下才能正

54、常的生長和繁殖。此外， 有機酸有利于色素的溶解， 改進(jìn)果酒的色澤， 還可以增進(jìn)果酒的清涼口感。 若酸度低于0.5克/100毫升，則另加酒石酸或檸檬酸或酸度高的果汁調(diào)整。 酸過高， 除了用糖漿降低或用酸低的果汁調(diào)整外，還可用中性酒石酸鉀中和。（五）裝瓶（入罐） ：葡萄裝量不超過瓶容的80，以預(yù)留足夠空間便于發(fā)酵期間二氧化碳?xì)夂蜔崃康呐欧牛乐箽怏w聚集引起的溢罐或者爆瓶；同時按汁量加入 6080mg/LS02,攪勻，S02添加量的計算：葡萄果實X70%X60/0.06 1000 o并加入果膠酶20mg/L（或按說明書）同時取汁測糖、酸、比重、溫度。（六）酵母的活化添加 ：采用工業(yè)專用酵母，按照 200mg/L 的量稱取酵母，