Chapter7南工大生物分離工程

1、本章主要知識(shí)點(diǎn)本章主要知識(shí)點(diǎn)色譜法簡(jiǎn)單分類色譜法簡(jiǎn)單分類cqKd遷移距離流動(dòng)相在色譜系統(tǒng)中的溶質(zhì)的遷移距離fRsdmmfAKAARsdmeVKVV22/1)(54. 5WtNR2)(16bRWtN NLH 吸附吸附 解吸解吸再吸附再吸附 再解吸再解吸 反復(fù)多次洗脫反復(fù)多次洗脫被測(cè)組被測(cè)組分分配系數(shù)不同分分配系數(shù)不同 差速遷移差速遷移 分離分離 分離機(jī)制：分離機(jī)制： 各組分與流動(dòng)相分子爭(zhēng)奪吸附劑表面活性中心各組分與流動(dòng)相分子爭(zhēng)奪吸附劑表面活性中心 利用吸附劑對(duì)不同組分的吸附能力差異而實(shí)現(xiàn)分離利用吸附劑對(duì)不同組分的吸附能力差異而實(shí)現(xiàn)分離常用的吸附劑：常用的吸附劑：u氧化鋁：氧化鋁：有堿性氧化鋁、中

2、性氧化鋁和酸性氧化鋁。有堿性氧化鋁、中性氧化鋁和酸性氧化鋁。 堿性氧化鋁，混有碳酸鈉等成分而帶有堿性，堿性氧化鋁，混有碳酸鈉等成分而帶有堿性，適用分離一些堿性成分適用分離一些堿性成分，如生物堿類，但是不宜用于醛、酮、酯、內(nèi)酯等類型的化合物分離，因?yàn)橛腥缟飰A類，但是不宜用于醛、酮、酯、內(nèi)酯等類型的化合物分離，因?yàn)橛袝r(shí)堿性氧化鋁可與上述成分發(fā)生次級(jí)反應(yīng)，如異構(gòu)化、氧化、消除反應(yīng)等。時(shí)堿性氧化鋁可與上述成分發(fā)生次級(jí)反應(yīng)，如異構(gòu)化、氧化、消除反應(yīng)等。 中性氧化鋁是由堿性氧化鋁除去堿性雜質(zhì)，沖洗至中性。仍屬于堿性吸中性氧化鋁是由堿性氧化鋁除去堿性雜質(zhì)，沖洗至中性。仍屬于堿性吸附劑的范疇，附劑的范疇，不

3、適用于酸性成分的分離。不適用于酸性成分的分離。 酸性氧化鋁是氧化鋁用稀硝酸或稀鹽酸處理得到的產(chǎn)物，并使氧化鋁顆粒酸性氧化鋁是氧化鋁用稀硝酸或稀鹽酸處理得到的產(chǎn)物，并使氧化鋁顆粒表面帶有表面帶有 NO3-或或 Cl-的陰離子，從而具有離子交換劑的性質(zhì)，的陰離子，從而具有離子交換劑的性質(zhì)，酸性氧化鋁適酸性氧化鋁適合于酸性成分的柱色譜。合于酸性成分的柱色譜。 u硅膠：硅膠：適用于中性或酸性成分的柱色譜。硅膠是一種弱酸性陽離子交換劑適用于中性或酸性成分的柱色譜。硅膠是一種弱酸性陽離子交換劑，其表面上的硅醇基能釋放弱酸性的氫離子，通過離子交換反應(yīng)吸附化合物。其表面上的硅醇基能釋放弱酸性的氫離子，通過離子

4、交換反應(yīng)吸附化合物。硅膠作為吸附劑有較大的吸附容量，硅膠作為吸附劑有較大的吸附容量，能用于極性和非極性化合物的分離能用于極性和非極性化合物的分離u活性炭：活性炭：柱色譜用的活性炭，最好選用顆?；钚蕴?。柱色譜用的活性炭，最好選用顆?；钚蕴?。 活性炭是非極性吸活性炭是非極性吸附劑，其吸附作用與硅膠和氧化鋁相反，對(duì)非極性物質(zhì)具有較強(qiáng)的親和附劑，其吸附作用與硅膠和氧化鋁相反，對(duì)非極性物質(zhì)具有較強(qiáng)的親和能力，在水溶液中吸附力最強(qiáng)，在有機(jī)溶劑中較弱，因此水的洗脫能力能力，在水溶液中吸附力最強(qiáng)，在有機(jī)溶劑中較弱，因此水的洗脫能力最弱而有機(jī)溶劑較強(qiáng)。最弱而有機(jī)溶劑較強(qiáng)。主要分離水溶性成分，氨基酸、糖、苷等。主

5、要分離水溶性成分，氨基酸、糖、苷等。u聚酰胺：聚酰胺：為高分子聚合物質(zhì)，不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿及丙為高分子聚合物質(zhì)，不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿及丙酮等常用有機(jī)溶劑，對(duì)堿較穩(wěn)定，對(duì)酸穩(wěn)定性較差，可溶于濃鹽酸、冰酮等常用有機(jī)溶劑，對(duì)堿較穩(wěn)定，對(duì)酸穩(wěn)定性較差，可溶于濃鹽酸、冰醋酸及甲酸。醋酸及甲酸。 聚酰胺對(duì)有機(jī)物質(zhì)的吸附屬于氫鍵吸附聚酰胺對(duì)有機(jī)物質(zhì)的吸附屬于氫鍵吸附，通過分子中的，通過分子中的酰酰胺羰基胺羰基與酚類、黃酮類化合物的酚羥基，或酰胺鍵上的與酚類、黃酮類化合物的酚羥基，或酰胺鍵上的游離氨基游離氨基與醌類與醌類、脂肪羧酸上的羰基形成氫鍵締合而產(chǎn)生吸附。、脂肪羧酸上的羰基形成

6、氫鍵締合而產(chǎn)生吸附。吸附的強(qiáng)弱則取決與各吸附的強(qiáng)弱則取決與各種化合物與之形成氫鍵締合的能力。種化合物與之形成氫鍵締合的能力。主要用于分離黃酮類、蒽醌類、酚主要用于分離黃酮類、蒽醌類、酚類、有機(jī)酸類、鞣質(zhì)類等成分。類、有機(jī)酸類、鞣質(zhì)類等成分。 固定相固定相機(jī)械吸附在惰性載體上的液體機(jī)械吸附在惰性載體上的液體 流動(dòng)相流動(dòng)相必須與固定相不為互溶必須與固定相不為互溶 載體載體惰性，性質(zhì)穩(wěn)定，惰性，性質(zhì)穩(wěn)定， 不與固定相和流動(dòng)相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)不與固定相和流動(dòng)相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)u分離機(jī)制：利用組分在流動(dòng)相和固定相間溶解度差別進(jìn)行分離分離機(jī)制：利用組分在流動(dòng)相和固定相間溶解度差別進(jìn)行分離溶劑溶劑常用的離子交換樹脂

7、Mini Q PC 3.2/3: Glutathione synthetaseSDS-PAGEStarting materialPeak 2Expanded Bed離子排斥色譜法(分子篩)凝膠色譜 固定相固定相多孔性凝膠多孔性凝膠 流動(dòng)相流動(dòng)相水水凝膠過濾色譜凝膠過濾色譜 流動(dòng)相流動(dòng)相有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑凝膠滲透色譜凝膠滲透色譜分離機(jī)制分離機(jī)制： 利用分子大小不同、在固定相上選擇性滲透實(shí)現(xiàn)分離利用分子大小不同、在固定相上選擇性滲透實(shí)現(xiàn)分離分子篩凝膠色譜原理Desalting proteinsproteinssalts凝膠色譜填料紙層析紙層析展開劑的選擇展開劑的選擇薄層色譜法薄層色譜法HPLC,高效

8、液相色譜高效液相色譜HPLC 分離原理分離原理u液固吸附色譜液固吸附色譜:按照極性大小順序先后分離按照極性大小順序先后分離,非極性溶非極性溶質(zhì)先流出質(zhì)先流出u液液分配色譜液液分配色譜:類似于液類似于液-液萃取液萃取,同分配色譜同分配色譜u離子交換色譜離子交換色譜:與離子交換中心的不同親和力與離子交換中心的不同親和力u空間排斥色譜空間排斥色譜:類似于分子篩效應(yīng)類似于分子篩效應(yīng),小分子易滲透保留小分子易滲透保留在凝膠內(nèi)在凝膠內(nèi).30m15m5mu液液-液色譜有正相和反相之分。液色譜有正相和反相之分。如果采用極性固定相和相對(duì)非極性流動(dòng)相，如果采用極性固定相和相對(duì)非極性流動(dòng)相，就稱為正相；如果采用相對(duì)

9、非極性固定相和極性流動(dòng)相，則稱為反相。由就稱為正相；如果采用相對(duì)非極性固定相和極性流動(dòng)相，則稱為反相。由于極性化合物更容易被極性固定相所保留，所以正相液于極性化合物更容易被極性固定相所保留，所以正相液-液色譜系統(tǒng)一般可液色譜系統(tǒng)一般可用于分離極性化合物。相反，反相液用于分離極性化合物。相反，反相液-液色譜系統(tǒng)一般可用于分離非極性或液色譜系統(tǒng)一般可用于分離非極性或弱極性化合物。弱極性化合物。正相色譜的流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出正相色譜的流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出；反相色譜的流出順序正好相反。另外，其他有些色譜如柱色譜也有正反；反相色譜的流出順序正好相反。另外，其他有些

10、色譜如柱色譜也有正反相之分。相之分。 u反相液相色譜分離多肽和蛋白質(zhì)是基于蛋白質(zhì)的疏水性，因此通常采用非反相液相色譜分離多肽和蛋白質(zhì)是基于蛋白質(zhì)的疏水性，因此通常采用非極性的烷基固定相作為填料，其表面化學(xué)性質(zhì)和流動(dòng)相的選擇應(yīng)最大限度極性的烷基固定相作為填料，其表面化學(xué)性質(zhì)和流動(dòng)相的選擇應(yīng)最大限度地滿足疏水的要求。通常在流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑（三氟乙酸）來增大地滿足疏水的要求。通常在流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑（三氟乙酸）來增大蛋白質(zhì)和多肽的疏水性蛋白質(zhì)和多肽的疏水性為什么反相色譜應(yīng)用廣泛?u它能使中性化合物和極性化合物在一根色譜柱中得到分離。它能使中性化合物和極性化合物在一根色譜柱中得到分離。u適用

11、于多種基體中的多類不同性質(zhì)化合物的測(cè)定和分離。適用于多種基體中的多類不同性質(zhì)化合物的測(cè)定和分離。u保留時(shí)間可以用分子的疏水性進(jìn)行描述和解釋。保留時(shí)間可以用分子的疏水性進(jìn)行描述和解釋。 u所用高純度的水、甲醇和乙腈等溶劑價(jià)格便宜、實(shí)用。所用高純度的水、甲醇和乙腈等溶劑價(jià)格便宜、實(shí)用。u選擇性可通過用緩沖溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)（通過調(diào)節(jié)選擇性可通過用緩沖溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)（通過調(diào)節(jié)pH值來調(diào)節(jié)值來調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度和膠團(tuán)粒子大小等等），以實(shí)現(xiàn)最佳分離。離子強(qiáng)度和膠團(tuán)粒子大小等等），以實(shí)現(xiàn)最佳分離。蛋白質(zhì)分離常用的色譜方法親和色譜（Affinity chromatography）AC ver 99032630Steric

12、 considerations &spacer armsSmall ligand (1,000)Risk of steric interference with binding between matrix and target moleculeOften need spacer armbut watch out for adsorption to the spacer!Spacer armCompetitive elution在載體表面連接上疏水的直鏈碳鏈或其他疏水基團(tuán)，在載體表面連接上疏水的直鏈碳鏈或其他疏水基團(tuán)，如苯基，可以與蛋白質(zhì)的某些疏水基團(tuán)相互作用，從如苯基，可以與蛋白質(zhì)的

13、某些疏水基團(tuán)相互作用，從而實(shí)現(xiàn)多組分的分離。而實(shí)現(xiàn)多組分的分離。操作要點(diǎn)操作要點(diǎn):蛋白質(zhì)的局部變性，鹽濃度高疏水作用強(qiáng)蛋白質(zhì)的局部變性，鹽濃度高疏水作用強(qiáng)洗脫采用逐步降低鹽濃度的方法進(jìn)行，一般采用有機(jī)洗脫采用逐步降低鹽濃度的方法進(jìn)行，一般采用有機(jī)溶劑或非離子型的洗滌劑。溶劑或非離子型的洗滌劑。Mechanism of HIC操作要點(diǎn)：操作要點(diǎn)： 由于蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在不同的由于蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在不同的pH值下，其解值下，其解離程度是不同的，因此既可以采用陽離子交換，也可離程度是不同的，因此既可以采用陽離子交換，也可以用陰離子交換，可視具體情況而定以用陰離子交換，可視具體情況而定 pHp

14、I, 蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷 由于蛋白質(zhì)的極性基團(tuán)很多，為了避免洗脫困難，通由于蛋白質(zhì)的極性基團(tuán)很多，為了避免洗脫困難，通常采用常采用弱陽或弱陰離子交換劑弱陽或弱陰離子交換劑 適當(dāng)調(diào)節(jié)緩沖溶液的適當(dāng)調(diào)節(jié)緩沖溶液的pH值，使蛋白質(zhì)適當(dāng)解離，通值，使蛋白質(zhì)適當(dāng)解離，通常采用的常采用的pH值靠近其等電點(diǎn)值靠近其等電點(diǎn)（不是等電點(diǎn)）（不是等電點(diǎn)）u金屬螯合層析金屬螯合層析 將螯合形成基團(tuán)與瓊脂糖等層析劑耦合，使將螯合形成基團(tuán)與瓊脂糖等層析劑耦合，使層析劑能層析劑能與過渡金屬離子結(jié)合（如與過渡金屬離子結(jié)合（如Cu2+,Zn2+,Fe3+）形成吸附中）形成吸附中心，這些金屬離子能與一些配基配位，可與

15、氨基酸的心，這些金屬離子能與一些配基配位，可與氨基酸的咪唑基和巰基結(jié)合，可用于蛋白質(zhì)的分離。咪唑基和巰基結(jié)合，可用于蛋白質(zhì)的分離。操作要點(diǎn)操作要點(diǎn)金屬離子對(duì)層析劑的親和力必須比與待分離物質(zhì)的配金屬離子對(duì)層析劑的親和力必須比與待分離物質(zhì)的配位親和力強(qiáng)才能保持待分離物質(zhì)被吸附位親和力強(qiáng)才能保持待分離物質(zhì)被吸附螯合形成的基團(tuán)一般為中性或陰離子，洗脫一般采用螯合形成的基團(tuán)一般為中性或陰離子，洗脫一般采用反離子或降低反離子或降低pH。根據(jù)巰基化合物與層析劑上二硫鍵發(fā)生共價(jià)交換反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)分根據(jù)巰基化合物與層析劑上二硫鍵發(fā)生共價(jià)交換反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)分離，蛋白質(zhì)中含有巰基，可進(jìn)行分離。離，蛋白質(zhì)中含有巰基，可進(jìn)行分

16、離。 操作要點(diǎn)操作要點(diǎn):共價(jià)層析操作分為三步：共價(jià)層析操作分為三步：（1）吸附，蛋白質(zhì)的巰基與層析劑上二硫鍵發(fā)生共價(jià)交換反應(yīng)，）吸附，蛋白質(zhì)的巰基與層析劑上二硫鍵發(fā)生共價(jià)交換反應(yīng)，被吸附在層析劑上被吸附在層析劑上（2）洗脫，用小分子巰基化合物洗脫，將層析劑上二硫鍵進(jìn)行交洗脫，用小分子巰基化合物洗脫，將層析劑上二硫鍵進(jìn)行交換反應(yīng)，二硫鍵層析劑變成巰基層析劑，一部分巰基與蛋白質(zhì)換反應(yīng)，二硫鍵層析劑變成巰基層析劑，一部分巰基與蛋白質(zhì)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)洗脫。結(jié)合，實(shí)現(xiàn)洗脫。（3）再生，利用）再生，利用2，2-吡啶基二硫化合物與巰基層析劑作用，重吡啶基二硫化合物與巰基層析劑作用，重新形成二硫鍵層析劑新形成二硫鍵層析劑凝膠排阻色譜的放大凝膠排阻色譜的放大凝膠排阻色譜中，溶質(zhì)與分離介質(zhì)無吸附作用，屬于線性平衡，在該色譜凝膠排阻色譜中，溶質(zhì)與分離介質(zhì)無吸附作用，屬于線性平衡，在該色譜中，峰寬和塔板數(shù)主要受孔隙擴(kuò)散影響。塔板數(shù)恒定，因此放大前后的色中，峰寬和塔板數(shù)主要受孔隙擴(kuò)散影響。