DNA提取-2010

1、實(shí)驗(yàn)三：DNA提取及PCR反應(yīng)蔣建偉第一部分：第一部分：DNA提取提取一、一、DNA提取的基本步驟提取的基本步驟三、三、DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題與對(duì)策提取常見(jiàn)問(wèn)題與對(duì)策二、二、DNA提取注意事項(xiàng)提取注意事項(xiàng) I. I.材料準(zhǔn)備材料準(zhǔn)備II.II.破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放 III.III.核酸分離、純化核酸分離、純化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì) V.V.核酸溶解在適量緩沖液或水中核酸溶解在適量緩沖液或水中DNA提?。ㄒ唬悠窚?zhǔn)備：（一）樣品準(zhǔn)備：1 1、組織：、組織：3 g 組織，用組織，用8 層紗布包好，再包多層牛皮紙，浸入液氮，取出，用木

2、層紗布包好，再包多層牛皮紙，浸入液氮，取出，用木錘敲碎。錘敲碎。碎組織放入搪瓷缽中，加少量液氮，碾磨至粉末狀。碎組織放入搪瓷缽中，加少量液氮，碾磨至粉末狀。在在50 ml離心管中，加離心管中，加10 ml DNA提取液提取液，用玻棒邊攪動(dòng)液體，邊加入，用玻棒邊攪動(dòng)液體，邊加入組織粉末，組織粉末，37 混勻?；靹?。2、組織，、組織， 3 g ，-70 保存，臨用時(shí)用玻璃勻漿器，用保存，臨用時(shí)用玻璃勻漿器，用DNA提取液提取液 將組織將組織磨成勻漿。磨成勻漿。注： DNA提取液提取液 見(jiàn)見(jiàn) p-8 或或 p-11,下同。下同。（一）樣品準(zhǔn)備（一）樣品準(zhǔn)備3、培養(yǎng)細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞 消化收集細(xì)胞，消化收

3、集細(xì)胞，PBS洗洗3次，加次，加10ml DNA提取液提取液，混勻。，混勻。4、血液、血液 取血液離心，取淡黃色白細(xì)胞層，加取血液離心，取淡黃色白細(xì)胞層，加NS，離心。，離心。 或者加或者加D2.H2O，離心，收集白細(xì)胞。，離心，收集白細(xì)胞。 加加10 ml DNA提取液提取液，37 mix。（一）樣品準(zhǔn)備（一）樣品準(zhǔn)備（二）提（二）提DNA酚抽提法：酚抽提法： 加加RNase，371 h，加蛋白酶加蛋白酶K，50 ，3 h ； 或或 37 12 h , 不時(shí)不時(shí)mix加等體積酚，充分加等體積酚，充分mix，9000rpm，3min，小心吸取上層粘稠水相。，小心吸取上層粘稠水相。加等體積酚，充

4、分加等體積酚，充分mix，9000rpm， 3min，小心吸取上層粘稠水相。，小心吸取上層粘稠水相。氯仿氯仿-異戊醇異戊醇(24:1)抽提抽提1次。次。9000rpm ，3min，小心吸取上層粘稠水，小心吸取上層粘稠水相。相。 移到移到50ml燒杯中，加燒杯中，加2.5倍體積冷無(wú)水乙醇，用玻棒鉤出倍體積冷無(wú)水乙醇，用玻棒鉤出DNA。TE 溶解。溶解。2 2、異丙醇沉淀法：、異丙醇沉淀法： 原理：原理： 用用2倍體積異丙醇沉淀倍體積異丙醇沉淀DNA溶液，溶液，DNA沉淀是絲狀，而沉淀是絲狀，而RNA溶于異丙醇中，可溶于異丙醇中，可除去除去RNA。細(xì)胞，細(xì)胞，PBS洗洗2次。次。3 ml TEN重

5、懸，加重懸，加DNA提取液提取液，蛋白酶，蛋白酶K，5014 h加等體積飽和酚，混勻，加等體積飽和酚，混勻，9000rpm 3 min，小心吸取上層粘稠水相。，小心吸取上層粘稠水相。氯仿氯仿-異戊醇異戊醇(24:1)抽提抽提1次，次，9000rpm 3 min，小心吸取上層粘稠水相。，小心吸取上層粘稠水相。加加2倍體積的異丙醇，用玻棒鉤出倍體積的異丙醇，用玻棒鉤出DNA。TE溶解。溶解。（二）提（二）提DNAq SDS法法-提取提取DNASDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（是一種陰離子去垢劑，在高溫（5565）條件下）條件下能裂解細(xì)能裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；胞，使染色體離析

6、，蛋白變性，釋放出核酸；提高鹽提高鹽(KAc或或NH4Ac)濃度并降低溫度（冰?。?，使蛋白質(zhì)及多糖濃度并降低溫度（冰浴），使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；上清液中的上清液中的DNA用酚用酚/氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。組份組份Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH 8.0 ）NaCl SDS終濃度終濃度 10 mM 20 mM 0.4M 2%q SDS法法DNA提取緩沖液提取緩沖液小小 結(jié)結(jié)q SDS SDS法流程圖法流程圖 （以動(dòng)物組織為例）（以動(dòng)物組織為例） 動(dòng)物組織動(dòng)物組織細(xì)胞裂解細(xì)胞裂解

7、上層溶液上層溶液組織勻漿組織勻漿抽提抽提干燥溶解干燥溶解離心洗滌離心洗滌酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液qCTAB法法CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽(yáng)離子去污劑，可溴化銨），是一種陽(yáng)離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。物。該復(fù)合物在高鹽溶液中（該復(fù)合物在高鹽溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，可通過(guò)有機(jī)溶）是可溶的，可通過(guò)有機(jī)溶劑抽提劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類(lèi)等雜質(zhì)，加入乙醇沉淀即可使核酸分，去除蛋白、多糖、酚類(lèi)等雜質(zhì)，加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來(lái)。

8、離出來(lái)。注：注：CTAB溶液在低于溶液在低于15 時(shí)會(huì)形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的時(shí)會(huì)形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的 植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時(shí)溫度不要低于植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時(shí)溫度不要低于15。舉舉 例例qCTAB提取緩沖液提取緩沖液 的經(jīng)典配方的經(jīng)典配方 組份組份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0） NaCl CTAB-巰基乙醇巰基乙醇 終濃度終濃度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入使用前加入Tris-HCl （pH8.0）提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合

9、螯合Mg2+或或Mn2+離子，抑制離子，抑制DNase活性；活性；NaCl 提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中；充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除qCTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方提取緩沖液的改進(jìn)配方 組份組份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0）NaCl CTAB PVP40-巰基乙醇巰基乙醇 終濃度終濃度 100 mM 20 mM1.4

10、M3%(W/V) 5%(W/V)2%（V/V）使用前加入使用前加入vPVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時(shí)它也能中酚的污染；同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。和多糖結(jié)合，有效去除多糖。qCTAB法流程圖：法流程圖：植物材料植物材料裂解液裂解液上層溶液上層溶液液氮研磨液氮研磨抽提抽提細(xì)胞裂解細(xì)胞裂解干燥溶解干燥溶解離心洗滌離心洗滌酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液二、二、DNA提取注意事項(xiàng)提取注意事項(xiàng) 最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)

11、最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融凍融 提取血液基因組提取血液基因組DNA時(shí)，要選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞）時(shí)，要選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞） 組培細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)造成組培細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)造成DNA降解降解 含病毒的液體材料含病毒的液體材料DNADNA含量較少，提取前先富集含量較少，提取前先富集基因組基因組DNADNA的提取的提取注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)適量。過(guò)多會(huì)影響裂解，導(dǎo)致適量。過(guò)多會(huì)影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低量少，純度低針對(duì)不同材料，選擇適當(dāng)?shù)尼槍?duì)不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理裂解預(yù)處理 方式：方式： 植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨 動(dòng)物組織勻漿或液氮研磨動(dòng)物

12、組織勻漿或液氮研磨 組培細(xì)胞蛋白酶組培細(xì)胞蛋白酶K 細(xì)菌溶菌酶破壁細(xì)菌溶菌酶破壁 酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時(shí)，定時(shí)輕柔振蕩高溫溫浴時(shí)，定時(shí)輕柔振蕩基因組基因組DNADNA的提取的提取注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)3. 核酸分離、純化：采用有機(jī)（酚采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動(dòng)作要輕柔。氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動(dòng)作要輕柔。離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間。離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間。針對(duì)不同材料的特點(diǎn)，在提取過(guò)程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的針對(duì)不同材料的特點(diǎn)，在提取過(guò)程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法。方法。基因組基因組DNADNA的提取的提取注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)q 蛋白質(zhì)的去

13、除：蛋白質(zhì)的去除：酚酚/ /氯仿抽提氯仿抽提使用變性劑變性（使用變性劑變性（SDSSDS、異硫氰酸胍等）、異硫氰酸胍等）高鹽洗滌高鹽洗滌蛋白酶處理蛋白酶處理q 多糖的去除：多糖的去除： 高鹽法：用乙醇沉淀時(shí)，在待沉淀溶液中加入高鹽法：用乙醇沉淀時(shí)，在待沉淀溶液中加入1/21/2體體積的積的5M NaCl，高鹽可溶解多糖。，高鹽可溶解多糖。 用用 多糖水解酶多糖水解酶 將多糖降解。將多糖降解。 在提取緩沖液中加一定量的在提取緩沖液中加一定量的氯苯氯苯 (1/2, v/v(1/2, v/v) )，氯苯，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖 。 用用PEGPEG8

14、0008000代替乙醇沉淀代替乙醇沉淀DNADNA：在：在500L DNA500L DNA液中加入液中加入200l 20% PEG200l 20% PEG8000 8000 ( (含含1.2 M NaCl) 1.2 M NaCl) ，冰浴，冰浴20min20min。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)q 多酚的去除：多酚的去除： 在抽提液中加入在抽提液中加入 防止酚類(lèi)氧化防止酚類(lèi)氧化 的試劑：的試劑：-巰基乙醇巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等 加入易與酚類(lèi)結(jié)合的試劑：如加入易與酚類(lèi)結(jié)合的試劑：如PVPPVP、PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇) )，它，它們與酚類(lèi)有較強(qiáng)的

15、親和力，可防止酚類(lèi)與們與酚類(lèi)有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類(lèi)與DNADNA的結(jié)合的結(jié)合q 鹽離子的去除：鹽離子的去除： 7070的乙醇洗滌的乙醇洗滌注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)4. 核酸沉淀、溶解當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的預(yù)冷的 乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會(huì)乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分。更充分。沉淀時(shí)加入沉淀時(shí)加入1/10體積的體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分），有利于充分沉淀。沉淀。沉淀后應(yīng)用沉淀后應(yīng)用70的乙醇洗滌，以除去鹽離子等。的乙醇洗滌，以除去鹽離子等。晾干晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過(guò)分干燥）。，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過(guò)分干燥）。若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用

16、TE緩沖液溶解。緩沖液溶解。TE中的中的EDTA能螯和能螯和Mg2+或或Mn2+離子，抑制離子，抑制DNase。pH值為值為8.0，可防止，可防止DNA發(fā)生酸解發(fā)生酸解 ?；蚪M基因組DNADNA的提取的提取注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 三、DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題與對(duì)策1.DNA中含有蛋白、中含有蛋白、多糖、多酚類(lèi)雜質(zhì)多糖、多酚類(lèi)雜質(zhì)2.DNA在溶解前，有在溶解前，有酒精殘留，酒精抑酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)制后續(xù)酶解反應(yīng)3.DNA中殘留中殘留有金屬有金屬離子離子1.重新純化重新純化DNA，去除蛋，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)白、多糖、多酚等雜質(zhì)（具體方法見(jiàn)前）（具體方法見(jiàn)前）2.重新沉淀重新沉淀DNA，讓

17、酒精，讓酒精充分揮發(fā)充分揮發(fā)3.增加增加70乙醇洗滌的次乙醇洗滌的次數(shù)（數(shù)（2-3次）次）q問(wèn)題一：?jiǎn)栴}一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)反應(yīng)。 原原因因?qū)?duì)策策DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題與對(duì)策1.1.材料不新鮮或反復(fù)凍材料不新鮮或反復(fù)凍融融2.2.未很好抑制內(nèi)源核酸未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性酶的活性3.3.提取過(guò)程操作過(guò)于劇提取過(guò)程操作過(guò)于劇烈，烈，DNADNA被機(jī)械打斷被機(jī)械打斷4.4.外源核酸酶污染外源核酸酶污染5.5.反復(fù)凍融反復(fù)凍融1.1.盡量取新鮮材料，低溫保存材料避盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融。免反復(fù)凍融。2.2.液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解

18、凍液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液。前加入裂解緩沖液。3.3.在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的的DNA時(shí)，可增加裂解液中時(shí)，可增加裂解液中螯合劑螯合劑的含量。的含量。4.4.細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔5.5.所有試劑用無(wú)菌水配制，耗材經(jīng)高所有試劑用無(wú)菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌。溫滅菌。6.6.將將DNA分裝保存于緩沖液中，避免分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融。反復(fù)凍融。q問(wèn)題二：?jiǎn)栴}二：DNA降解降解。對(duì)對(duì)策策 原原因因DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題與對(duì)策1.1.實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少2.2.破壁或裂解不充分破壁或裂

19、解不充分3.3.沉淀不完全沉淀不完全4.4.洗滌時(shí)洗滌時(shí)DNADNA丟失丟失1.1.盡量選用新鮮（幼嫩）的材盡量選用新鮮（幼嫩）的材料。料。2.2.動(dòng)植物要?jiǎng)驖{研磨充分；動(dòng)植物要?jiǎng)驖{研磨充分；G G菌、酵母裂解前先用生物酶菌、酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁?；驒C(jī)械方式破壁。3.3.高溫裂解時(shí)，時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)高溫裂解時(shí)，時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)（對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌可增（對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌可增加加PK的用量）。的用量）。4.4.低溫沉淀，延長(zhǎng)沉淀時(shí)間。低溫沉淀，延長(zhǎng)沉淀時(shí)間。5.5.加輔助物，促進(jìn)沉淀。加輔助物，促進(jìn)沉淀。6.6.洗滌時(shí)，最好用槍頭將洗滌洗滌時(shí)，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒。液吸出，勿傾倒

20、。DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題與對(duì)策q問(wèn)題三：?jiǎn)栴}三：DNADNA提取量少。提取量少。對(duì)對(duì)策策 原原因因 第二節(jié)第二節(jié) PCR反應(yīng)反應(yīng) 一、一、PCR反應(yīng)原理和反應(yīng)過(guò)程反應(yīng)原理和反應(yīng)過(guò)程 二、PCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系： 三、三、PCR的反應(yīng)條件（反應(yīng)參數(shù)）的反應(yīng)條件（反應(yīng)參數(shù)） 四、PCR常見(jiàn)問(wèn)題與對(duì)策 五、PCR衍生技術(shù)（略）多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) PCR是由美國(guó)科學(xué)家是由美國(guó)科學(xué)家Mullis提出的一種提出的一種體外簡(jiǎn)化條件下模擬體外簡(jiǎn)化條件下模擬DNA體內(nèi)復(fù)制的體內(nèi)復(fù)制的DNA快速擴(kuò)增的方法，此技術(shù)獲得快速擴(kuò)增的方法，此技術(shù)獲得1993年諾貝年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。爾化學(xué)獎(jiǎng)。一、一、PCR反應(yīng)原理和反應(yīng)過(guò)

21、程反應(yīng)原理和反應(yīng)過(guò)程DNA的體外復(fù)制包括的體外復(fù)制包括3個(gè)步驟：個(gè)步驟： 變性（變性（denaturation）:94 C 95 C 退火（退火（annealing）:40 C 70 C 延伸（延伸（extension）:72 C 3個(gè)步驟作為個(gè)步驟作為PCR的一個(gè)循環(huán)，每當(dāng)完成一的一個(gè)循環(huán)，每當(dāng)完成一個(gè)循環(huán)，一個(gè)分子的模板被復(fù)制為二個(gè)，個(gè)循環(huán)，一個(gè)分子的模板被復(fù)制為二個(gè)，產(chǎn)物量以指數(shù)形式增長(zhǎng)。產(chǎn)物量以指數(shù)形式增長(zhǎng)。引物引物引物引物TaqTaq DNADNA聚合酶（聚合酶（thermus aquaticusthermus aquaticus) )酶活性酶活性(%)()40 50 60 70 8

22、0 90 100100 80 60 40 20耐熱耐熱DNADNA聚合酶聚合酶Saiki（1988）將耐熱）將耐熱DNA聚合酶引入聚合酶引入PCR，使利用熱變性解鏈，使利用熱變性解鏈DNA模板可行。模板可行。PCR反應(yīng)循環(huán)反應(yīng)循環(huán)PCR的指數(shù)擴(kuò)增（的指數(shù)擴(kuò)增（2n）二、PCR DNA模板模板 引物引物 反應(yīng)緩沖液反應(yīng)緩沖液 dNTP ddH2O 耐熱聚合酶耐熱聚合酶1 模板模板單、雙鏈單、雙鏈DNA均可。注意模板的完整性，均可。注意模板的完整性，模板降解會(huì)導(dǎo)致模板降解會(huì)導(dǎo)致PCR擴(kuò)增無(wú)產(chǎn)物。擴(kuò)增無(wú)產(chǎn)物。不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合

23、蛋結(jié)合蛋白類(lèi)。白類(lèi)。蛋白、多糖、酚類(lèi)等雜質(zhì)會(huì)抑制蛋白、多糖、酚類(lèi)等雜質(zhì)會(huì)抑制PCR反應(yīng)。反應(yīng)。RNA作為模板時(shí)，須先將作為模板時(shí)，須先將RNA逆轉(zhuǎn)錄為逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以，再以 cDNA作作為為擴(kuò)增的模板。擴(kuò)增的模板。DNA模板一般模板一般100ng /100 L。模板濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非模板濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。特異性增加。2、引、引 物物（Primers) 引物決定引物決定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和長(zhǎng)度。擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和長(zhǎng)度。 是化學(xué)合成的寡核苷酸，是化學(xué)合成的寡核苷酸， 能與模板特異地結(jié)合，能與模板特異地結(jié)合， 引物決定引物決定PCR產(chǎn)物的特異性和長(zhǎng)度。產(chǎn)物的特異性和長(zhǎng)度

24、。引物設(shè)計(jì)的原則（一）引物設(shè)計(jì)的原則（一）引物長(zhǎng)度：引物長(zhǎng)度： 15-30bp，常用為，常用為20mer左右左右. 引物的有效長(zhǎng)度不能大于引物的有效長(zhǎng)度不能大于 38 mer，否則最適延伸溫度會(huì)超過(guò)，否則最適延伸溫度會(huì)超過(guò)Taq DNA聚合酶的最適溫度（聚合酶的最適溫度（74），不能保證），不能保證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。引物擴(kuò)增跨度引物擴(kuò)增跨度： 以以500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。的片段。引物堿基：引物堿基： G+C含量以含量以40-60%為宜。引物退火溫度計(jì)算：為宜。引物退火溫度計(jì)算：Tm=2（A+T）+4（C+G）。）。T

25、m在在55-65 最好。最好。 G+C太少擴(kuò)增效果不佳，太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。 ATGC最好隨機(jī)分布，避免最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 引物的解鏈溫度：兩個(gè)引物之間的引物的解鏈溫度：兩個(gè)引物之間的 Tm 值差異最好在值差異最好在 5之內(nèi)。之內(nèi)。引物設(shè)計(jì)的原則（二引物設(shè)計(jì)的原則（二）避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu) 避免兩條引物間互補(bǔ)，避免兩條引物間互補(bǔ)， 特別是特別是 3端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異性的擴(kuò)增條帶。產(chǎn)生非特異

26、性的擴(kuò)增條帶。引物引物 3端的堿基要求嚴(yán)格配對(duì)端的堿基要求嚴(yán)格配對(duì) 特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。失敗。引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)引物引物3端為關(guān)鍵堿基；端為關(guān)鍵堿基；5端無(wú)嚴(yán)格限制端無(wú)嚴(yán)格限制，引物的，引物的5端可被修飾（引入端可被修飾（引入酶切位點(diǎn)、引入突變位點(diǎn)、生物素等標(biāo)記）。酶切位點(diǎn)、引入突變位點(diǎn)、生物素等標(biāo)記）。引物設(shè)計(jì)的原則（三引物設(shè)計(jì)的原則（三）引物的特異性：引物的特異性： 序列應(yīng)位于高度保守區(qū)序列應(yīng)位于高度保守區(qū),與非擴(kuò)增區(qū)無(wú)同源序列。與非擴(kuò)增區(qū)無(wú)同源

27、序列。引物量：引物量： 引物濃度：引物濃度：0.1 0.2umol/L，濃度過(guò)高容易生成引物二聚體濃度過(guò)高容易生成引物二聚體，過(guò)低則擴(kuò)，過(guò)低則擴(kuò)增產(chǎn)物減少。增產(chǎn)物減少。其他：其他：避免反復(fù)凍融。避免反復(fù)凍融。 RT-PCR 引物設(shè)計(jì)特別注意：跨越兩個(gè)外顯子。引物設(shè)計(jì)特別注意：跨越兩個(gè)外顯子。3、脫氧核苷三磷酸（dNTP） 是是dATP、dCTP、dGTP和和dTTP 4種脫氧核苷三磷酸的混合物種脫氧核苷三磷酸的混合物 。 dNTP呈顆粒狀，酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以呈顆粒狀，酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1M Tris-HCl的緩的緩沖液將其沖液將其pH調(diào)節(jié)到調(diào)節(jié)到7.07.5，小量分裝，

28、小量分裝，-20冰凍保存。多次凍融冰凍保存。多次凍融會(huì)使會(huì)使dNTP降解。降解。 在在PCR反應(yīng)中，反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為應(yīng)為20200umol/L，尤其是注意尤其是注意4種種dNTP的的濃度要相等（等摩爾配制濃度要相等（等摩爾配制 ），）， 如其中任何一種濃度不同于其它幾種如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)（偏高或偏低），就會(huì)引起錯(cuò)配。時(shí)（偏高或偏低），就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度升高增加非特異性擴(kuò)增；濃度升高增加非特異性擴(kuò)增；濃濃度過(guò)低又會(huì)降低度過(guò)低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。產(chǎn)物的產(chǎn)量。 dNTP 能與能與Mg2+結(jié)合，使游離的結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。濃度降低。4、DNA聚合酶聚合酶l 從一種

29、生活在熱泉（從一種生活在熱泉（8090）中的水棲噬熱菌）中的水棲噬熱菌（Thermus aquaticus, Taq）中提取，有很高的耐熱穩(wěn)定性。）中提取，有很高的耐熱穩(wěn)定性。 l Taq 酶的作用：在模板指導(dǎo)下，以酶的作用：在模板指導(dǎo)下，以dNTP為原料，在引物為原料，在引物3-OH末端加上脫氧單核苷酸，形成末端加上脫氧單核苷酸，形成3, 5 -磷酸二酯鍵，使磷酸二酯鍵，使DNA鏈沿鏈沿53方向延伸，催化方向延伸，催化DNA合成。合成。 l 最適酶量：最適酶量：0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反應(yīng)特異性下降；酶量過(guò)少影響反應(yīng)產(chǎn)量。酶量增加使反應(yīng)特異性下降；酶量過(guò)少影響反應(yīng)產(chǎn)量。Taq

30、 DNA聚合酶復(fù)制的保真性：聚合酶復(fù)制的保真性：Taq DNA聚合酶無(wú)聚合酶無(wú)3 5外切酶活性外切酶活性，因而無(wú)校正功能，在因而無(wú)校正功能，在復(fù)制新鏈的過(guò)程中會(huì)發(fā)生堿基錯(cuò)配。復(fù)制新鏈的過(guò)程中會(huì)發(fā)生堿基錯(cuò)配。Taq DNA聚合酶在聚合酶在每次循環(huán)中產(chǎn)生的移碼突變率為每次循環(huán)中產(chǎn)生的移碼突變率為1/30000，堿基替換率為，堿基替換率為1/8000，故擴(kuò)增的片段越長(zhǎng)，錯(cuò)配的機(jī)率越高。，故擴(kuò)增的片段越長(zhǎng)，錯(cuò)配的機(jī)率越高。Pfu DNA polymerase具有較高的熱穩(wěn)定性，較高的保真性，降低堿具有較高的熱穩(wěn)定性，較高的保真性，降低堿基錯(cuò)配率基錯(cuò)配率2 10倍。倍。5 5、鎂離子濃度、鎂離子濃度鎂離

31、子濃度是一個(gè)至為關(guān)鍵的因素鎂離子濃度是一個(gè)至為關(guān)鍵的因素，對(duì)于反應(yīng)系統(tǒng)本身、穩(wěn)定核，對(duì)于反應(yīng)系統(tǒng)本身、穩(wěn)定核苷酸和提高苷酸和提高Taq 酶的活性有直接影響。酶的活性有直接影響。當(dāng)當(dāng)dNTP濃度為濃度為200umol/L時(shí)，時(shí)，MgCl2 的濃度為的濃度為1.5mmol/L較宜。較宜。6、其它反應(yīng)因素、其它反應(yīng)因素pH：調(diào)節(jié)至酶反應(yīng)所需的最適：調(diào)節(jié)至酶反應(yīng)所需的最適pH（ pH =7.2左右左右）鹽：合適的鹽濃度有利于穩(wěn)定雜交體，有利于引物與模板雜交鹽：合適的鹽濃度有利于穩(wěn)定雜交體，有利于引物與模板雜交小結(jié)：反應(yīng)體系對(duì)小結(jié)：反應(yīng)體系對(duì)PCRPCR擴(kuò)增的影響擴(kuò)增的影響DNA模板模板純度純度 蛋白、

32、多糖、酚類(lèi)等雜質(zhì)會(huì)抑制蛋白、多糖、酚類(lèi)等雜質(zhì)會(huì)抑制PCRPCR反應(yīng)反應(yīng)完整性完整性 模板降解會(huì)導(dǎo)致模板降解會(huì)導(dǎo)致PCRPCR擴(kuò)增無(wú)產(chǎn)物擴(kuò)增無(wú)產(chǎn)物濃度濃度 加量過(guò)多導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增增加加量過(guò)多導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增增加特異性特異性 長(zhǎng)度適當(dāng)長(zhǎng)度適當(dāng)、避免二級(jí)結(jié)構(gòu)和二聚體避免二級(jí)結(jié)構(gòu)和二聚體完整性完整性 避免反復(fù)凍融避免反復(fù)凍融濃度濃度 應(yīng)適當(dāng)應(yīng)適當(dāng), ,過(guò)高導(dǎo)致非特異性增加過(guò)高導(dǎo)致非特異性增加, ,過(guò)低則過(guò)低則引引 物物擴(kuò)增產(chǎn)物太少擴(kuò)增產(chǎn)物太少小結(jié)：反應(yīng)體系對(duì)小結(jié)：反應(yīng)體系對(duì)PCRPCR擴(kuò)增的影響擴(kuò)增的影響反應(yīng)反應(yīng) pH值值, ,鹽離子濃度鹽離子濃度穩(wěn)定劑穩(wěn)定劑, ,增強(qiáng)劑增強(qiáng)劑Mg 2濃度濃度過(guò)高非

33、特異性嚴(yán)重過(guò)高非特異性嚴(yán)重過(guò)低無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物過(guò)低無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物濃度適當(dāng)濃度適當(dāng)避免反復(fù)凍融避免反復(fù)凍融ddH2OpH值適當(dāng)值適當(dāng)避免污染避免污染三、三、PCR的反應(yīng)條件的反應(yīng)條件 （變性、退火、延伸）反應(yīng)溫度（變性、退火、延伸）反應(yīng)溫度（變性、退火、延伸）反應(yīng)時(shí)間（變性、退火、延伸）反應(yīng)時(shí)間循環(huán)次數(shù)（循環(huán)次數(shù)（PCR效率及產(chǎn)物量）效率及產(chǎn)物量）溫度的設(shè)置溫度的設(shè)置：設(shè)置變性設(shè)置變性-退火退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)延伸三個(gè)溫度點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法， 變性溫度：變性溫度：94 94 97 97 退火溫度：低于引物退火溫度：低于引物Tm 5 Tm 5 左右左右 溫度過(guò)高：降低擴(kuò)增效

34、率；溫度過(guò)高：降低擴(kuò)增效率； 溫度過(guò)低：增加非特異性擴(kuò)增。溫度過(guò)低：增加非特異性擴(kuò)增。 延伸溫度：延伸溫度：7272度，此時(shí)度，此時(shí)TaqTaq酶具有較高的酶酶具有較高的酶。 對(duì)于較短靶基因（長(zhǎng)度為對(duì)于較短靶基因（長(zhǎng)度為100300bp時(shí)）可采用二溫度點(diǎn)法，時(shí)）可采用二溫度點(diǎn)法， 將退將退火與延伸溫度合二為一，一般采用火與延伸溫度合二為一，一般采用94變性，變性，65左右退火與延伸。左右退火與延伸。 變性溫度與時(shí)間：變性溫度與時(shí)間： 變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。失敗的最主要原因。 一般一般9394, 1min足以使模板足以使模板DNA變性變性

35、 若低于若低于93則需延長(zhǎng)時(shí)間則需延長(zhǎng)時(shí)間 但溫度不能過(guò)高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。但溫度不能過(guò)高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。 此步若不能使靶基因模板或此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗失敗 退火退火( (復(fù)性復(fù)性) )溫度與時(shí)間：溫度與時(shí)間：退火溫度是影響退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至變性后溫度快速冷卻至4060，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞

36、結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度。度。對(duì)于對(duì)于20個(gè)核苷酸，個(gè)核苷酸，G+C含量約含量約50%的引物，的引物，55為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。較為理想。引物的復(fù)性溫度引物的復(fù)性溫度通過(guò)以下公式幫助選擇合適的溫度：通過(guò)以下公式幫助選擇合適的溫度： Tm值（解鏈溫度）值（解鏈溫度）=4（G+C）2（A+T） 復(fù)性溫度復(fù)性溫度=Tm值值-（510） 在在Tm值允許范圍內(nèi)，值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度選擇較高的復(fù)性

37、溫度 可大大減少引物和模可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。反應(yīng)的特異性。 復(fù)性時(shí)間一般為復(fù)性時(shí)間一般為3060sec，足以使引物與模板之間完全，足以使引物與模板之間完全結(jié)合結(jié)合 延伸溫度與時(shí)間：延伸溫度與時(shí)間： Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：聚合酶的生物學(xué)活性： 高于高于90時(shí)，時(shí)，DNA合成幾乎不能進(jìn)行合成幾乎不能進(jìn)行 7080 150核苷酸核苷酸/S/酶分子酶分子 70 60核苷酸核苷酸/S/酶分子酶分子 55 24核苷酸核苷酸/S/酶分子酶分子 延伸溫度與時(shí)間：延伸溫度與時(shí)間： 延伸溫度：一般選擇在延伸溫度：一般選擇在7075之間之

38、間 常用溫度為常用溫度為72 過(guò)高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。過(guò)高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。 延伸反應(yīng)時(shí)間：根據(jù)待擴(kuò)增片段長(zhǎng)度而定延伸反應(yīng)時(shí)間：根據(jù)待擴(kuò)增片段長(zhǎng)度而定 1 Kb以內(nèi)的以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間片段，延伸時(shí)間1 min（足夠）。（足夠）。 34 kb的靶序列需的靶序列需34 min 擴(kuò)增擴(kuò)增10 Kb需延伸至需延伸至15 min。 延伸進(jìn)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)延伸進(jìn)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些。增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些。3 3、循環(huán)次數(shù)、循環(huán)次數(shù) 重復(fù)次數(shù)一般設(shè)為重復(fù)次數(shù)一般設(shè)為2535個(gè)循環(huán)個(gè)循環(huán) 擴(kuò)增反應(yīng)的平臺(tái)效

39、應(yīng)：擴(kuò)增反應(yīng)的平臺(tái)效應(yīng)： 理論上，理論上，PCR反應(yīng)產(chǎn)物呈指數(shù)性增長(zhǎng)，但這種反應(yīng)產(chǎn)物呈指數(shù)性增長(zhǎng)，但這種增長(zhǎng)形式在擴(kuò)增增長(zhǎng)形式在擴(kuò)增25或或25個(gè)循環(huán)以后便放慢直至個(gè)循環(huán)以后便放慢直至停止，達(dá)到反應(yīng)平臺(tái)，此時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物量不再隨停止，達(dá)到反應(yīng)平臺(tái)，此時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物量不再隨循環(huán)次數(shù)的增加而呈指數(shù)增長(zhǎng)。循環(huán)次數(shù)的增加而呈指數(shù)增長(zhǎng)。n指數(shù)增長(zhǎng)期n平臺(tái)期循環(huán)數(shù) # 理論值 實(shí)際值Log 產(chǎn)物DNAPCR過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)平臺(tái)出現(xiàn)得遲早與模板的初始量有關(guān)，模板初始量平臺(tái)出現(xiàn)得遲早與模板的初始量有關(guān)，模板初始量越多，平臺(tái)出現(xiàn)得越早。越多，平臺(tái)出現(xiàn)得越早。平臺(tái)效應(yīng)產(chǎn)生的因素：平臺(tái)效應(yīng)產(chǎn)生的因素： 引物二聚體的產(chǎn)生、反應(yīng)

40、產(chǎn)物、各組分的消耗和變引物二聚體的產(chǎn)生、反應(yīng)產(chǎn)物、各組分的消耗和變性、引物和已擴(kuò)增的性、引物和已擴(kuò)增的DNA片段間的競(jìng)爭(zhēng)等片段間的競(jìng)爭(zhēng)等使用使用PCR增強(qiáng)劑增強(qiáng)劑 甲酰胺，甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜堿等都可充當(dāng)，甘油，甜菜堿等都可充當(dāng)PCR的增強(qiáng)劑，的增強(qiáng)劑，其可能的機(jī)理是降低熔解溫度，從而有助于引物退火并輔助其可能的機(jī)理是降低熔解溫度，從而有助于引物退火并輔助DNA聚合酶延伸通過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)。聚合酶延伸通過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)。 增強(qiáng)劑濃度要適當(dāng)增強(qiáng)劑濃度要適當(dāng) 無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物 非特異性擴(kuò)增 拖尾 假陽(yáng)性 無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物1.1. 模板模板: :含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低2.2. BufferBuffer對(duì)樣品不合適對(duì)樣品不合適3.3. 引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解解4.4. 反應(yīng)條件：反應(yīng)條件：退火溫度太高，延退火溫度太高，延伸時(shí)間太短伸時(shí)間太短 原原因因?qū)?duì)策策1.1. 純化模板或者使用試劑盒提取純化模板或者使用試劑盒提