發(fā)光免疫分析技術(shù)

1、 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù) 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù) 慨慨 述述 - 化學(xué)發(fā)光 - 化學(xué)發(fā)光效率 化學(xué)發(fā)光劑和標(biāo)記技術(shù)化學(xué)發(fā)光劑和標(biāo)記技術(shù) - 化學(xué)發(fā)光劑 - 發(fā)光劑的標(biāo)記技術(shù) 化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型 - 直接化學(xué)發(fā)光免疫分析 - 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析 - 電化學(xué)發(fā)光免疫分析什么是發(fā)光免疫分析？什么是發(fā)光免疫分析？是將發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立起來的一是將發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立起來的一種新的檢測(cè)微量抗原或抗體的新型標(biāo)記免疫分析種新的檢測(cè)微量抗原或抗體的新型標(biāo)記免疫分析技術(shù)。技術(shù)。 放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù) 三大經(jīng)典標(biāo)記技

2、術(shù) 發(fā)光是指分子或原子中的電子吸收能量后，由基態(tài) （較低能級(jí)）躍遷到激發(fā)態(tài)（較高能級(jí)），然后再 返回到基態(tài)，并釋放光子的過程。 根據(jù)形成激發(fā)態(tài)分子的能量來源不同可分為: 光照發(fā)光、生物發(fā)光、化學(xué)發(fā)光等。 發(fā)光的基礎(chǔ)知識(shí) 光照發(fā)光（photoluminescence）指發(fā)光劑（熒光素） 經(jīng)短波長(zhǎng)的入射光照射后，電子吸收能量躍遷到激發(fā) 態(tài)，其回至基態(tài)時(shí)，發(fā)射出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的光。 生物發(fā)光（bioluminescence）是指發(fā)生在生物體內(nèi)的 發(fā)光現(xiàn)象，如螢火蟲的發(fā)光，反應(yīng)底物為螢火蟲熒光 素，在熒光素酶的催化下，利用ATP能，生成激發(fā)態(tài)氧 化型熒光素，它在回復(fù)基態(tài)時(shí)多余的能量以光子的形 式釋放出來。

3、化學(xué)發(fā)光 發(fā)光的基本類型發(fā)光的基本類型化學(xué)發(fā)光（chemiluminescence）是指伴隨化學(xué)反應(yīng)過程所產(chǎn)生的光的發(fā)射現(xiàn)象。某些物質(zhì)(發(fā)光劑)在化學(xué)反應(yīng)時(shí)，吸收了反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的化學(xué)能，使反應(yīng)的產(chǎn)物分子或反應(yīng)的中間態(tài)分子中的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時(shí)，以發(fā)射光子的形式釋放出能量，這一現(xiàn)象稱為化學(xué)發(fā)光?；瘜W(xué)發(fā)光又分為：直接化學(xué)發(fā)光間接化學(xué)發(fā)光 什么是化學(xué)發(fā)光什么是化學(xué)發(fā)光一些化學(xué)反應(yīng)能釋放足夠的能量把參加反應(yīng)的物質(zhì)激發(fā)到能發(fā)射光的電子激發(fā)態(tài)，若被激發(fā)的是一個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物分子，則這種反應(yīng)過程叫直接化學(xué)發(fā)光。反應(yīng)過程簡(jiǎn)單地描述如下： A十B C* C* C h為光子，C*表示C處于

4、激發(fā)態(tài) 直接化學(xué)發(fā)光直接化學(xué)發(fā)光若激發(fā)能傳遞到另一個(gè)未參加化學(xué)反應(yīng)的分子D上，使D分子激發(fā)到電子激發(fā)態(tài)，D分子從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)發(fā)光，這種過程叫間接化學(xué)發(fā)光。反應(yīng)過程表示如下： A十B C* C*十D C十D* D* D十h 間接化學(xué)發(fā)光間接化學(xué)發(fā)光 化學(xué)發(fā)光劑和標(biāo)記技術(shù)在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物，稱為化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物。釋放能量的化合物，稱為化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物。 一、化學(xué)發(fā)光劑一、化學(xué)發(fā)光劑 發(fā)光的量子產(chǎn)率高； 它的物理-化學(xué)特性要與被標(biāo)記或測(cè)定的 物質(zhì)相匹配； 能與抗原或抗體形成穩(wěn)定的偶聯(lián)結(jié)合物；

5、 其化學(xué)發(fā)光常是氧化反應(yīng)的結(jié)果； 在所使用的濃度范圍內(nèi)對(duì)生物體沒有毒性 化學(xué)發(fā)光劑的基本條件化學(xué)發(fā)光劑的基本條件直接化學(xué)發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過程中不需酶的催化直接化學(xué)發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過程中不需酶的催化作用，直接參與發(fā)光反應(yīng)，它們?cè)诨瘜W(xué)結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生作用，直接參與發(fā)光反應(yīng)，它們?cè)诨瘜W(xué)結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光的特有基團(tuán)，可直接標(biāo)記抗原或抗體。發(fā)光的特有基團(tuán)，可直接標(biāo)記抗原或抗體。 （一）直接化學(xué)發(fā)光劑（一）直接化學(xué)發(fā)光劑一一. . 代表物質(zhì)：吖啶酯，在堿性條件下被代表物質(zhì)：吖啶酯，在堿性條件下被H H2 2O O2 2氧化時(shí)氧化時(shí), ,發(fā)出發(fā)出波長(zhǎng)波長(zhǎng)470nm470nm的光，具有很高的發(fā)光效率，其激發(fā)

6、態(tài)產(chǎn)物的光，具有很高的發(fā)光效率，其激發(fā)態(tài)產(chǎn)物N-N-甲甲基吖啶酮是該發(fā)光反應(yīng)體系的發(fā)光體?；灌ね窃摪l(fā)光反應(yīng)體系的發(fā)光體。 二二. . 另一類代表物質(zhì)：另一類代表物質(zhì)：三聯(lián)吡啶釕，三聯(lián)吡啶釕，RU(bpy)3RU(bpy)32+2+是電化學(xué)發(fā)光劑，是電化學(xué)發(fā)光劑，它和電子供體三丙胺（它和電子供體三丙胺（TPATPA）在陽(yáng)電極表面可同時(shí)失去）在陽(yáng)電極表面可同時(shí)失去一個(gè)電子而發(fā)生氧化反應(yīng)。一個(gè)電子而發(fā)生氧化反應(yīng)。 三聯(lián)吡啶釕三聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光劑反應(yīng)原理電化學(xué)發(fā)光劑反應(yīng)原理 利用標(biāo)記酶的催化作用，使發(fā)光劑利用標(biāo)記酶的催化作用，使發(fā)光劑（底物）發(fā)光，這一類需酶催化后發(fā)光的發(fā)光劑。（底物）發(fā)光，這一

7、類需酶催化后發(fā)光的發(fā)光劑。代表物質(zhì)：代表物質(zhì)：魯米諾及其衍生物，魯米諾及其衍生物，AMPPDAMPPD （二）酶促化學(xué)發(fā)光劑（二）酶促化學(xué)發(fā)光劑 魯米諾增強(qiáng)發(fā)光反應(yīng)原理魯米諾增強(qiáng)發(fā)光反應(yīng)原理 AMPPD3-(2-螺旋金剛烷螺旋金剛烷)-4-甲氧基甲氧基-4-(3“-磷酰氧基磷酰氧基)苯苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷二氧雜環(huán)丁烷化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型 用吖啶酯直接標(biāo)記抗體(抗原)，與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-吖啶酯標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)只需加入氧化劑（H2O2）和NaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光 。 由集光器

8、和光電倍增管接收、記錄單位時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，這部分光的積分與待測(cè)抗原的量成正比，可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測(cè)抗原的含量。一、直接化學(xué)發(fā)光免疫分析一、直接化學(xué)發(fā)光免疫分析發(fā)光發(fā)光Y YY磁微粒子磁微粒子被測(cè)抗原被測(cè)抗原+ 抗體抗體+丫啶酯標(biāo)丫啶酯標(biāo)記物抗體記物抗體YYYYYYYYYYY沖洗后沖洗后（1 1）加入加入H H2 2O O2 2（pH10） 直接化學(xué)發(fā)光分析直接化學(xué)發(fā)光分析-夾心法夾心法電化學(xué)發(fā)光免疫分析（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）是以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體(抗原)，以三丙胺(TPA)為電子供體， 在電場(chǎng)中因電子轉(zhuǎn)移而

9、發(fā)生特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個(gè)過程。 二、電化學(xué)發(fā)光免疫分析二、電化學(xué)發(fā)光免疫分析 磁性微粒為固相載體包被抗體(抗原)，用三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體(抗原)，在反應(yīng)體系內(nèi)待測(cè)標(biāo)本與相應(yīng)的抗原 (抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成磁性微粒包被抗體-待測(cè)抗原-三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)將上述復(fù)合物吸入流動(dòng)室，同時(shí)引人TPA緩沖液。 當(dāng)磁性微粒流經(jīng)電極表面時(shí)，被安裝在電極下面的電磁鐵吸引住，而未結(jié)合的標(biāo)記抗體和標(biāo)本被緩沖液沖走。與此同時(shí)電極加壓，啟動(dòng)電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，使三聯(lián)吡啶釕和TPA在電極表面進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光，光強(qiáng)度與待測(cè)抗原濃度成正比。 電化學(xué)發(fā)光免疫分析電化學(xué)發(fā)光免疫分析電

10、化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖電化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖以TSH為例：第一步：結(jié)合了活化的三聯(lián)吡啶釕衍生物即Ru(bpy)32+ + N羥基琥珀酰胺酯（NHS）的TSH抗體和結(jié)合了生物素的TSH抗體與待測(cè)血清同時(shí)加入一個(gè)反應(yīng)杯中，孵育9分鐘。第二步：將被鏈霉親和素包被的磁珠加入反應(yīng)杯中，再次孵育9分鐘，使生物素通過與親和素的結(jié)合將磁珠、TSH抗體連接為一體，形成雙抗體夾心法。下一步，蠕動(dòng)泵將形成的Ru(bpy)32+抗體抗原抗體磁珠復(fù)合體吸入流動(dòng)測(cè)量室，此時(shí)，磁珠被工作電極下面的磁鐵吸附于電極表面。同時(shí)，游離的TSH抗體（與生物素結(jié)合的和與Ru(bpy)32+結(jié)合的抗體）也被吸出測(cè)量室。緊接著，蠕動(dòng)泵加

11、入含三丙胺（TPA）的緩沖液，同時(shí)電極加電壓，啟動(dòng)ECL反應(yīng)過程。發(fā)光劑Ru(bpy)32+和電子供體TPA在陽(yáng)極表面可同時(shí)各失去一個(gè)電子而發(fā)生氧化反應(yīng)，使二價(jià)的Ru(bpy)32+被氧化成三價(jià)，后者是一種強(qiáng)氧化劑；另一方面，TPA 被氧化成陽(yáng)離子自由基TPA+q，后者很不穩(wěn)定，可自發(fā)失去一個(gè)質(zhì)子（H+），形成自由基TPAq，這是一種很強(qiáng)的還原劑，可將一個(gè)電子給三價(jià)的Ru(bpy)33+，使其形成激發(fā)態(tài)的Ru(bpy)32+，而TPA自身被氧化成二丙胺和丙醛。激發(fā)態(tài)的Ru(bpy)32+通過熒光機(jī)制衰減，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)620nm的光子，重新生成基態(tài)的Ru(bpy)32+。該過程在電極表面周而復(fù)

12、始地進(jìn)行，產(chǎn)生許多光子，光電倍增管檢測(cè)光強(qiáng)度，光強(qiáng)度與Ru(bpy)32+的濃度呈線性關(guān)系，故可測(cè)出待測(cè)抗原的含量。最后，終止電壓，移開磁珠，加入清洗液沖洗流動(dòng)測(cè)量室，準(zhǔn)備下一個(gè)樣品測(cè)定。 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶如辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶(ALP)來標(biāo)記抗原或抗體，在與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，加入底物(發(fā)光劑)，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)并加以放

13、大，處理信號(hào)計(jì)算出測(cè)定物的濃度。三、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析三、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析 該分析系統(tǒng)采用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗體(或抗原)，在與反應(yīng)體系中的待測(cè)標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-酶（HRP）標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)加入魯米這時(shí)加入魯米諾發(fā)光劑、諾發(fā)光劑、H H2 2O O2 2和化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑使產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。和化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑使產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。 （一）（一）HRP標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析 HRP標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析 該分析系統(tǒng)以堿性磷酸酶 標(biāo)記抗體(或抗原)，在與反應(yīng)體系中的待測(cè)標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)加入這時(shí)加入AMPPDAMPPD發(fā)光劑，堿性磷酸酶發(fā)光劑，堿性磷酸酶使使AMPPDAMPPD脫去磷酸根基團(tuán)而發(fā)光。脫去磷酸根基團(tuán)而發(fā)光。 （二）（二）AKP標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析 AKP標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析 加樣品、磁顆加樣品、磁顆粒子、試劑粒子、試劑孵育，使反孵育，使反應(yīng)物結(jié)合應(yīng)物結(jié)合清洗去除未清洗去除未結(jié)合物質(zhì)結(jié)合物質(zhì)加入底物加入底物 產(chǎn)生信