制藥分離工程實驗指導(dǎo)定參考模板

1、四川理工學(xué)院制藥分離工程實驗指導(dǎo)第一版制藥工程系 編二一二 年目 錄實驗一 細(xì)胞SOD的提取和分離- 1 -實驗二 大棗中多糖的提取分離3實驗三 有機溶劑沉淀法制備大豆脲酶5實驗四 柱層析法對色素的提取與分離7實驗五 質(zhì)粒的提取及電泳分離9實驗六八角茴香油的提取與檢識11實驗七 秦皮中七葉苷和七葉內(nèi)酯的提取、分離與鑒定14實驗八 大孔吸附樹脂分離純化白頭翁皂苷16實驗九 重結(jié)晶及過濾18實驗十 簡單蒸餾及分餾37 / 28實驗一 細(xì)胞SOD的提取和分離一、實驗?zāi)康?1掌握有機溶劑沉淀法的原理和基本操作。2掌握SOD酶提取分離的一般步驟。二、實驗原理超氧化物歧化酶(superoxide dism

2、utase，SOD)是一種具有抗氧化、抗衰老、抗輻射和消炎作用的藥用酶。它可催化超氧負(fù)離子(O2-)進(jìn)行歧化反應(yīng)，生成氧和過氧化氫。大蒜蒜瓣和懸浮培養(yǎng)的大蒜細(xì)胞中含有較豐富的SOD，通過組織或細(xì)胞破碎后，可用pH7.8的磷酸緩沖溶液提取出來。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮將其沉淀析出。有機溶劑沉淀的原理是有機溶劑能降低水溶液的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)分子之間的靜電引力增大。同時，有機溶劑的親水性比溶質(zhì)分子的親水性強，它會搶奪本來與親水溶質(zhì)結(jié)合的自由水，破壞其表面的水化膜，導(dǎo)致溶質(zhì)分子之間的相互作用增大而發(fā)生聚集，從而沉淀析出。三、試劑與儀器1.試劑與材料新鮮蒜瓣 、0.05mol/L磷酸緩沖液（pH

3、7.8） 、氯仿-乙醇混合液：氯仿:無水乙醇=3:5 、丙酮：用前需預(yù)冷至4-10 、0.05mol/L碳酸鹽緩沖液（pH10.2）、0.1mol/LEDTA溶液 、2mmol/L腎上腺素溶液2. 儀器 恒溫水浴鍋、冷凍高速離心機、可見分光光度計、研缽、玻棒、燒杯、量筒四、實驗步驟1. 組織細(xì)胞破碎：稱取5g大蒜蒜瓣，置于研缽中研磨。 2. SOD的提?。浩扑楹蟮慕M織中加入2-3倍體積的0.05mol/L磷酸緩沖液（pH7.8），繼續(xù)研磨20min，使SOD充分溶解到緩沖液中，然后在5000rpm下離心15min，取上清液。 3. 除雜蛋白：上清液加入0.25體積的氯仿-乙醇混合液攪拌15mi

4、n，5000rpm離心15min，得到的上清液為粗酶液。 4. SOD的沉淀分離：粗酶液中加入等體積的冷丙酮，攪拌15min，5000rpm離心15min，得SOD沉淀。將SOD沉淀溶于0.05mol/L磷酸緩沖液（pH7.8）中，于55-60熱處理15min，得到SOD酶液。 5. SOD活力測定 將上述提取液、粗酶液和酶液分別取樣，測定各自的SOD活力。 試劑空白管對照管樣品管碳酸緩沖液5.05.05.0EDTA溶液0.5腎上腺素溶液腎上腺素溶液蒸餾水0.50.5-樣品液-0.5混合均勻，在30水浴中預(yù)熱5min腎上腺素溶液0.50.5加入腎上腺素后，繼續(xù)保溫2min，然后立即在480nm

5、處測定光密度。對照管和樣品管的光密度值分別為A和B。 在上述條件下，SOD抑制腎上腺素自氧化50%所需的酶量定義為一個酶活力單位。即： 酶活力（單位）=2（A-B）N/A 式中，N樣品稀釋倍數(shù)；2抑制腎上腺素自氧化50%的換算系數(shù)。 五、實驗結(jié)果 根據(jù)提取液、粗酶液和酶液的酶活力和體積，計算純化提取率。 六、注意事項 1. 酶液提取時，為了盡可能保持酶的活性，盡可能在冰浴中研磨，在低溫中離心。 2. 腎上腺素容易被氧化，故操作時要盡量快。 以對單糖混合液進(jìn)行分離。以纖維素作為支持物，把它均勻地涂布在玻璃板上成一薄層，然后在此薄層上進(jìn)行層析即為纖維素薄層層析。纖維素是一種惰性支持物，它與水有較強

6、的親和力而與有機溶劑親和力較弱。層析時吸著在纖維素上的水是固定相，而展層溶劑是流動相。當(dāng)欲被分離的各種物質(zhì)在固定相和流動相中的分配系七、思考題1.計算出每500g大蒜蒜瓣所制備出的SOD酶的克數(shù)。2.討論有機溶劑沉淀法與鹽析法相比的優(yōu)缺點。實驗二 大棗中多糖的提取分離一 、實驗?zāi)康?1、學(xué)習(xí)多糖的提取分離方法及工藝 2、熟悉萃取、離心、蒸發(fā)、干燥等單元操作 3、掌握苯酚硫酸法鑒定多糖的方法。二 、實驗原理 多糖化合物作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，能激活免疫細(xì)胞提高機體的免疫功能，對正常的細(xì)胞沒有毒副作用，在臨床上用來治療惡性腫瘤、肝炎等疾病。大分子植物多糖如淀粉、纖維素等多不溶于水，且在醫(yī)藥制劑中僅用作

7、輔料成分，無特異的生物活性。而目前所研究的多糖，因其分子量較小，多可溶于水，因其極性基團(tuán)較多，故難溶于有機溶劑。 多糖的提取方法通常有以下三種。 (1)直接溶劑浸提法：這也是傳統(tǒng)的方法，在我國已有幾千年歷史，如中藥的煎煮、中草藥有效成分的提取。該方法具有設(shè)備簡單、操作方便、適用面廣等優(yōu)點。但具有操作時間長、對不同成分的浸提速率分辨率不高、能耗較高等缺點。 (2)索氏提取法：在有效成分提取方面曾經(jīng)有過較為廣泛的應(yīng)用，其提取原理：在索氏提取中，基質(zhì)總是浸泡在相對比較純的溶劑中，目標(biāo)成分在基質(zhì)內(nèi)、外的濃度梯度比較大；在回流提取中溶液處于沸騰狀態(tài)，溶液與基質(zhì)間的擾動加強，減少了基質(zhì)表面流體膜的擴散阻力

8、，根據(jù)費克擴散定律，由于固體顆粒內(nèi)外濃度相差比較大，擴散速率較高，達(dá)到相同濃度所需時間較短，且由于每次提取液為新鮮溶劑，能提供較大的溶解能力，所以提取率較高。但索氏提取法溶劑每循環(huán)一次所需時間較長，不適合于高沸點溶劑。 (3)新型提取方法：隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近年出現(xiàn)了一些新的提取方法和新的設(shè)備，如超聲波提取、微波提取以及與膜分離集成技術(shù)，極大地豐富了中草藥藥用成分提取理論。此外還有透析法、柱色譜法、分子篩分離法及中空纖維超濾法等。 可根據(jù)原料及多糖的特點，設(shè)計不同的提取工藝。本實驗采用直接溶劑浸提法提取大棗多糖。三 、試劑與儀器試劑：大棗，無水乙醇，濃硫酸，苯酚（常壓蒸餾，收集182餾分），

9、蒸餾水。 儀器：電熱恒溫水浴鍋，磁力攪拌器，電子天平，真空干燥箱，低速離心機，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，家用多功能粉碎機；錐形瓶，量筒，容量瓶，試管，移液管，玻璃棒，燒杯、蒸餾頭。 四 、實驗步驟 (1)大棗多糖的提取 將大棗烘干，粉碎，稱取棗粉15g，裝入250mL的錐形瓶中，并加入200mL的蒸餾水。 開動磁力攪拌器攪拌，在80恒溫水浴提取1h。 將大棗提取液離心，得到上清液，并定容于200mL容量瓶中，從中移取10mL于10mL試管中，以備鑒定。 剩余上清液45在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至原提取溶液體積的1/2，濃縮液中加220mL無水乙醇，使溶液乙醇含量達(dá)到70%，靜置2h后離心分離，收集多糖沉淀，加入多

10、糖沉淀1倍體積的無水乙醇洗滌，離心分離后將沉淀物放入45真空干燥箱，干燥至恒重得大棗粗多糖。 提取率計算 提取率=(干燥大棗粗多糖/原棗粉重量)100%(2)多糖的鑒定 5%苯酚溶液的配制：取苯酚100g，加鋁片0.1g和NaHCO3 0.05g，蒸餾收集182餾分，稱取此餾分25g，加水475g，置于棕色瓶放入冰箱備用。 移取大棗多糖提取液三份各2.5mL，標(biāo)為1 #，2#，3 #樣，分別定容于50mL、100mL、200mL容量瓶中。 分別移取1 #，2#，3 #多糖溶液1mL于10mL試管中，然后依次加入1.6mL的5%苯酚溶液，7mL濃硫酸，振蕩搖勻后室溫冷卻，觀察溶液顏色變化。 五、

11、實驗結(jié)果與討論 記錄試驗條件、過程、各試劑用量及產(chǎn)品的重量，并計算大棗多糖的提取率，填寫下表。 產(chǎn)品為暗紅色固體。觀察大棗多糖鑒定過程中的溶液顏色變化，記錄試驗現(xiàn)象。填寫下表1。 表1 大棗中多糖的提取率及鑒定結(jié)果組別多糖重量提取率溶液顏色變化1#2#3# 六、思考題 1與不同小組的實驗結(jié)果進(jìn)行比較，討論影響多糖提取實驗結(jié)果的因素都有哪些？2結(jié)合糖的性質(zhì)，分析采用苯酚一硫酸法鑒定大棗多糖的原理，并討論溶液顏色與多糖含量的關(guān)系實驗三 有機溶劑沉淀法制備大豆脲酶一、 實驗?zāi)康?掌握有機溶劑沉淀法的原理和基本操作。2掌握大豆脲提取分離的一般步驟。3.熟悉重結(jié)晶操作的方法。二、實驗原理脲酶（EC3.5

12、.6.5）廣泛存在于微生物和動、植物組織中，1926 年，Sumner J曾用32的丙酮溶液從刀豆粉中提取脲酶，并得到了結(jié)晶。該酶相對分子質(zhì)量為483 000，由6個亞基組成，等電點4.9,溶于水和稀緩沖液，粗酶較穩(wěn)定，純酶不太穩(wěn)定，結(jié)晶酶在低溫下可穩(wěn)定1年以上。本實驗用乙醇或丙酮從大豆種子中提取脲酶，并用有機溶劑和等電點結(jié)合法制備該酶。三、儀器與試劑儀器：家用磨粉機、冰浴設(shè)備、離心機、5mL、10mL 、50mL 離心管、1.5mL塑料離心管及其他常規(guī)儀器；試劑：新鮮大豆或大豆粉；人造移石（專用于吸附氨Permutin顆粒狀人造沸石）; 2 醋酸：冰醋酸2mL 用蒸餾水稀釋至l00mL ;

13、64和32丙酮(丙酮原液按體積百分比用蒸餾水配制)。四、實驗步驟1.提?。?）稱取5g人造沸石，置小燒杯中，用2乙酸浸泡兩次，傾去酸，加蒸餾水反復(fù)洗滌至中性，瀝干備用。（2）稱取10g新鮮大豆粉，置入錐形瓶中，加上述人造浮石，加50mL 32丙酮溶液，在冰浴中持續(xù)搖動4min5min,4層紗布過濾，收集濾液。（3）將濾渣重新置于錐形瓶中，另加10mL32丙酮，再提取一次。4層紗布過濾，濾液在4，3500rmin - l條件下離心8min10min ，小心傾出上清液，計量體積。取lmL酶液保存，供測酶活力和蛋白質(zhì)用。2.沉淀脲酶在32的丙酮中可以緩慢聚集而沉淀，但當(dāng)酶液在等電點附近時，沉淀生成更

14、快。故：（1）將提取的酶液置冰浴中，在緩慢攪拌下，用點滴管逐滴滴加2 醋酸，并不斷用精密pH 試紙檢測pH 變化，觀察產(chǎn)生渾濁的現(xiàn)象，直至pH4.9左右。置4 低溫下過夜，可析出沉淀。（2）將沉淀物仔細(xì)轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管， 3500rmin - l條件下離心10 min12min。上清液回收丙酮；沉淀即為脲酶粗品。風(fēng)干后，稱重，計算酶的收得率。3.重結(jié)晶（1）將所得粗酶溶于少許蒸餾水中，吸取0.2mL0.4mL用于測定酶活力和蛋白質(zhì)，此即粗酶的活力。（2）酶溶液在冰浴中冷至24，攪拌下緩慢滴入等體積64的預(yù)冷丙酮溶液，保持低溫條件下讓其緩慢析出結(jié)晶，需要較長的時間，可得到較好的正方形晶體。如果將

15、溶液調(diào)至等電點結(jié)晶，則結(jié)晶速度較快，但晶形不夠規(guī)整。結(jié)晶干燥后低溫保存。五、結(jié)果計算酶收得率（%) = （酶干重酶干重 測酶活留取液體體積酶液總體積）樣品重100% 酶的比活力Umg-1，( pr.) 總活力總蛋白質(zhì)報告試驗結(jié)果及觀察到的有關(guān)現(xiàn)象記載。酶制備記錄表如下：步驟總體積（mL）酶活力蛋白質(zhì)比活力Umg-1 ( pr. )收得率( % )UmL-1總活力( U )mgmL-1總蛋白質(zhì)（mg )( l ）提取液( 2 ）粗酶( 3 ）結(jié)晶酶六、思考題1、脲酶提取過程中為什么要用人造沸石？2、脲酶提取過程中有二次需要離心，每次離心的目的是什么？離心操作要注意些什么問題？3、實驗四 柱層析法

16、對色素的提取與分離一、實驗?zāi)康?、通過綠色植物色素的提取和分離，了解天然物質(zhì)分離提純方法；2、了解柱層析和薄層色譜分離的基本原理，掌握柱層析和薄層色譜分離的操作技術(shù)。3、通過柱色譜和薄層色譜分離操作，加深了解微量有機物色譜分離鑒定的原理。二、實驗原理石油醚是一種脂溶性很強的有機溶劑。葉綠體中的四種色素在石油醚中的溶解度是不同的：溶解度高的隨層析液在濾紙上擴散得快；溶解度低的隨層析液在濾紙上擴散得慢。溶解度最高的是胡蘿卜素，它隨石油醚在濾紙上擴散得最快，葉黃素和葉綠素a的溶解度次之；葉綠素b的溶解度最低，擴散得最慢。這樣，四種色素就在擴散過程中分離開來。同樣，提取液可用色層分析的原理加以分離。因

17、吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同，當(dāng)用適當(dāng)?shù)娜軇┩苿訒r，混合物中各成分在兩相（流動相和固定相）間具有不同的分配系數(shù)，所以它們的移動速度不同，經(jīng)過一定時間層析后，便將混合色素分離。本實驗是用活性氧化鋁作吸附劑，分離菠菜中胡蘿卜素、葉黃素、葉綠素a和葉綠素b。三、儀器與試劑 儀器：研缽、布氏漏斗、圓底燒瓶(150ML的2個)、色譜柱、抽濾瓶、鐵架臺、脫脂棉，723分光光度計 ，燒杯（500ml各3個），分液漏斗（250ml，1個）試劑：硅膠 G ，堿性三氧化二鋁，石英砂，甲醇（500ml），石油醚（ 60-90 ，500ml），丙酮（500ml），乙酸乙酯（500ml），菠菜葉。四、實驗步驟1、菠菜色

18、素的提取 取2g 新鮮菠菜葉，與10mL 甲醇拌勻研磨5 分鐘，棄去濾液。殘渣用10mL 的石油醚-甲醇（3:2）混合液進(jìn)行提取，共提取兩次。合并液用水洗后棄去甲醇層，石油醚層進(jìn)行干燥、濃縮。2、薄層層析將上述的濃縮液點在硅膠G 的預(yù)制板上，分別用石油醚-丙酮（8:2）和石油醚-乙酸乙酯（6:4）兩種溶劑系統(tǒng)展開，經(jīng)過顯色后，進(jìn)行觀察并計算比移值。3、柱層析取3g 中性氧化鋁進(jìn)行濕法裝柱。填料裝好后，從柱頂加入上述濃縮液，用石油醚-丙酮（9:1）、石油醚-丙酮（7:3）和正丁醇-乙醇-水（3:1:1）進(jìn)行洗脫，依次接收個色素帶，即得胡蘿卜素（橙黃色溶液）、葉黃素（黃色溶液）、葉綠素a（藍(lán)綠色溶

19、液）以及葉綠素b（黃綠色溶液）。稱取12g堿性三氧化二鋁加入30mL石油醚攪拌，浸泡10min。在層析柱內(nèi)加入一團(tuán)棉花（棉花要盡量薄）在底部再加入0.5cm的石英砂，然后用石油醚半充滿柱子，再將浸泡好的三氧化二鋁倒入柱內(nèi)，倒時應(yīng)該緩慢，重復(fù)使用下面的石油醚，直到裝完。用石油醚洗柱內(nèi)壁，頂部加一小團(tuán)棉花，然后再加入石英砂0.5cm高。樣品的分離層析將濃縮液小心地從柱頂部加入。加完后打開活塞，讓液面下降到柱中砂層，關(guān)閉活塞，加幾滴石油醚沖洗內(nèi)壁，打開活塞，使液面下降如前，在柱頂小心加入約1.52cm高度的石油醚-丙酮洗脫劑，層析即開始進(jìn)行。先用石油醚-丙酮（9:1）洗滌（配置約50ml的混合液即可

20、），當(dāng)黃色色帶洗出后，改用石油醚-丙酮（7:3）（配置約50ml的混合液即可），繼續(xù)洗滌。當(dāng)?shù)谝粋€有色成分即將滴出時，另取一潔凈的燒杯收集，得黃色溶液，即胡蘿卜素。將洗脫劑換成1：7的石油醚-丙酮混合液，繼續(xù)洗脫可得到第二色帶的黃綠色溶液，即葉綠素a和葉黃素。 五、思考題 1. 提取和分離葉綠體中色素的關(guān)鍵是什么？2. 葉綠體中有哪幾種色素？濾紙條上的色素帶，從上到下是怎樣排列的？3. 葉綠體中的色素含量最多和擴散速度最快的是哪一種？實驗五 質(zhì)粒的提取及電泳分離一、實驗?zāi)康?.掌握提取質(zhì)粒的方法2.掌握凝膠電泳分離鑒定質(zhì)粒DNA的方法。二、實驗原理采用溶菌酶或EDTA可以破壞菌體細(xì)胞壁，十二烷

21、基磺酸鈉（SDS）或TritonX-100處理后，細(xì)菌染色體DNA回纏繞附著在細(xì)胞碎片上，同時由于細(xì)菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多，易受機械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。當(dāng)用強熱或酸、堿處理時，細(xì)菌的線性染色體DNA變性，而共價閉合環(huán)狀DNA的兩條鏈不會相互分開，當(dāng)外界條件恢復(fù)正常時，線性染色體DNA片段難以復(fù)性，而是與變形的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片纏繞在一起，而質(zhì)粒DNA雙鏈又恢復(fù)原狀，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解狀態(tài)存在于液相中。二、 儀器與試劑 1.儀器：冷凍高速離心機、恒溫震蕩搖床、蒸汽滅菌鍋、恒溫水浴、微量移液器。2.試劑：溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L

22、 Tris.CL，10mmol/L EDTA （Ph 8.0） 溶液II: 0.2 mol/L 氫氧化鈉，1%SDS 溶液III：5 mol/L KAc 60mL, 冰醋酸11.5mL, 去離子水28.5mL， TE緩沖液：10mmol/L Tris.CL，1mmol/L EDTA （Ph 8.0） 飽和酚、氯仿、異戊醇、瓊脂糖凝膠四、實驗步驟1. 細(xì)菌培養(yǎng) 挑單菌落接種到5 mL含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中37振蕩至對數(shù)生長后期。2. 細(xì)菌收集 取1.5 mL培養(yǎng)液，4000 rpm離心5分鐘后倒掉上清液。3. 質(zhì)粒提取1）加100 L預(yù)冷的溶液I，渦旋懸浮后，在冰上放置5分鐘。2）加200 L

23、溶液II，輕輕混勻后，冰上放置5分鐘。3）加150 L溶液III，充分混合后，冰上放置5分鐘。4）4，10000 rpm離心15分鐘，把上清液移至新管。4. 抽提 加等體積的氯仿/異戊醇（24:1），混勻，放置片刻。4，10000rpm離心10分鐘，把上清液移至新管。5. 質(zhì)粒沉淀 加入2倍體積的冰乙醇，放置20分鐘。4，10000rpm離心15分鐘，倒棄上清。6. 洗滌沉淀 加入500 L，70%的乙醇，洗滌沉淀。7. 溶解質(zhì)粒 4, 7000 rpm離心5分鐘，倒棄上清，真空干燥，加入適量（20 L）的TE和0.5L RNA酶溶液。8. 制備凝膠 稱1g瓊脂糖，放入250 mL三角瓶內(nèi)，加

24、入100 mL 1TAE電泳緩沖液，加熱煮沸等其涼到60左右，倒入封好的電泳板上。9. 上樣1）吸取2 L質(zhì)粒，加入1L上樣緩沖液（Loading buffer），混勻。2）將質(zhì)粒樣品點入到瓊脂糖凝膠的上樣孔中10. 電泳 連接好電泳槽和電泳儀，以5V/cm恒壓電泳。11. 染色及脫色 電泳1.5-2 h后，關(guān)上電泳儀。取出凝膠，放入染色槽內(nèi)，加入1滴溴化乙錠（EB）輕輕搖蕩15分鐘。將染色液倒入儲存桶內(nèi)，在染色槽內(nèi)加入自來水，輕輕搖蕩10分鐘。12. 結(jié)果觀察 將凝膠放到紫外燈下觀測。記錄觀察到的電泳條帶。 五、思考題1.說明堿裂法提取質(zhì)粒的原理?2.電泳結(jié)果出現(xiàn)幾個條帶?各是什么?實驗六八

25、角茴香油的提取與檢識一、實驗?zāi)康模? 掌握用水蒸汽蒸餾法提取揮發(fā)油的原理和方法。2 學(xué)習(xí)揮發(fā)油的一般檢識及揮發(fā)油中固體成分的分離方法。3 掌握揮發(fā)油中化學(xué)成分的薄層點滴定性檢識。4 了解揮發(fā)油單向二次薄層層析法。二、實驗原理：八角茴香為木蘭科植物八角茴香的干燥成熟果實。內(nèi)含揮發(fā)油約5%。主要成分是茴香腦，約為總揮發(fā)油的80-90%。此外，尚有少量甲基胡椒酚、茴香醛、茴香酸等。其主要化合物的結(jié)構(gòu)式如下：茴香腦甲基胡椒酚茴香醛茴香酸本實驗是根據(jù)揮發(fā)油具有所屬揮發(fā)性，能隨水蒸汽一同蒸出的性質(zhì)，選用水蒸汽蒸餾法進(jìn)行提取。揮發(fā)油的組成成分比較復(fù)雜，常含有烷烴、烯烴、醇、醛、酮、酸、醚等。由于各類化合物都

26、具有其牲官能團(tuán)，因此，可以用一些檢出試劑在薄層板上進(jìn)行點滴試驗，從而了解揮發(fā)油各組分化合物的類型。揮發(fā)油各組分的極性各不相同，一般結(jié)構(gòu)中不含氧的烴類和萜類化合物極性較小，在薄層層析時可以被石油醚較好的展開；而含氧的烴類和萜類化合物極性較大，不易被石油醚展開，但可被石油醚：乙酸乙酯的混合溶劑較好的展開。為了使揮發(fā)油中各組分能在一塊薄層板上進(jìn)行分離，可采用單向二次層析展開法。所謂單向二次展開，是先用極性稍大的展開劑進(jìn)行第一次展開，當(dāng)展開劑展至薄層板中部時，取出，立即揮去展開劑。此時，揮發(fā)油中極性小的成分被推至展開劑前沿，極性較大的成分已被展開分離。將原來的薄層板改換極性小的展開劑再作第二次展開，直

27、至展開劑展開至薄層板的頂端，此時可使極性小的成分在較小極性的展開劑中得到很好的分離，從而達(dá)到在一塊薄層板上完成極性大小不同的多種成分分離的目的。所謂雙向展開，其方法是用一塊方形薄層板進(jìn)行層析，第一次展開和第二次展開的方向互為90，即用第一種展開劑先展開后，揮盡展開劑，將薄層板轉(zhuǎn)換90角，用第二種展開劑再展開一次，可使揮發(fā)油中的各組分得到分離。三、試劑與儀器儀器：圓底燒瓶，長頸圓底燒瓶，直形冷凝管，接液管，量筒，分液漏斗，錐形瓶，布氏漏斗，濾紙，抽濾瓶，電熱套等，揮發(fā)油測定器，1010cm硅膠CMCNa薄層板，毛細(xì)管。藥品：八角茴香，乙醇，石油醚（3060沸程），乙酸乙酯，香草醛，硫酸。四、實驗

28、步驟1 八角茴香油的水蒸汽蒸餾法：取八角茴香50g，搗碎，置燒瓶中，加適量水浸泡濕潤，按一般水蒸汽蒸餾法進(jìn)行蒸餾。也可將搗碎的八角茴香置于揮發(fā)油測定器的燒瓶中，加蒸餾水500mL與玻璃珠數(shù)粒，振搖混合后，連接揮發(fā)油測定器與回流冷凝管。自冷凝管上端加水使充滿揮發(fā)油測定器的刻度部分，并使溢流入燒瓶時為止。緩緩加熱至沸，至測定器中油量不再增加，停止加熱，放冷，分取油層。2 分離固體成分：將所得的八角茴香油置冰箱中冷卻1小時，即有白色結(jié)晶析出，趁冷過濾，壓干。結(jié)晶主要為茴香腦，濾液為析出茴香腦后的八角茴香油。3 八角茴香油的檢識：油斑試驗：將八角茴香油1滴，滴于濾紙片上，加熱烘烤，觀察油斑是否消失。薄

29、層點滴反應(yīng)：取硅膠CMC-Na薄層板1塊，用鉛筆在其上劃線打格，形成如圖所示的方格，進(jìn)行類似磁點滴板的試驗。先將揮發(fā)油樣品用5-10倍量乙醇稀釋后，以毛細(xì)管分別滴加于每個格內(nèi)再將各種試劑用滴管分別滴于各揮發(fā)油樣品的斑點上，觀察顏色變化。所用揮發(fā)油除本次實驗所提取的八角茴香油外，可同時用桂皮油、丁香油、薄荷油、桉葉油，松節(jié)油、樟腦油等進(jìn)行觀察。揮發(fā)油的薄層檢識：單向二次展開：取1塊長約15cm的硅膠CMCNa薄層板，在距底邊1.5cm及8cm處分別用鉛筆畫一起始線和中線。將八角茴香油溶于丙酮，用毛細(xì)管點于起始線上，用石油醚（3060沸程）：乙酸乙酯85：15的混合液為展開劑，展開至薄層板的中線處

30、，取出，揮去展開劑后，再放入石油醚（3060沸程）中展開，至接近薄層板頂端時取出，揮去溶劑后立即顯色。顯色劑：分別用下列顯色劑噴霧顯色。顯色劑與揮發(fā)油顯色情況1%香草醛60%硫酸溶液紫色、紅色等多種顏色熒光素溴試劑黃色斑點示有不飽和化合物2,4二硝基苯肼試劑黃色斑點示有醛、酮化合物005%溴甲酚氯乙醇試劑黃色斑點示有本性化合物雙向展開：取1010cm硅膠CMCNa薄層板一塊，沿起始線的右側(cè)1.5cm處點樣（只點1個原點）。先在石油醚中做第一方向展開，待展開至接近薄層板的終點，取出薄層板，揮去溶劑。再將薄層板調(diào)轉(zhuǎn)90，置于石油醚（3060）：乙酸乙酯（85：15）展開劑中做第二方向展開至接近薄層

31、板終端，取出薄層板，揮去展開劑，同上法顯色。根據(jù)結(jié)果分析揮發(fā)油組成情況。五、注意事項1 采用揮發(fā)油含量測定裝置撮揮發(fā)油，可以初步了解該藥材中揮發(fā)油的含量，但所用的藥材量應(yīng)使蒸出的揮發(fā)油量不少于0.5mL為宜。2 揮發(fā)油測定裝置一般分為兩種，一種為適用于相對密度小于1.0的揮發(fā)油。另一種用于測定相對密度大于1.0的揮發(fā)油。中華人民共和國藥典95版規(guī)定，測定相對密度大于1.0的揮發(fā)油，也在相對密度小于1.0的測定器中進(jìn)行，可在加熱前，預(yù)先加入1mL二甲苯于測定器中，然后進(jìn)行水蒸汽蒸餾，使蒸出的相對密度大于1.0的揮發(fā)油溶于二甲苯中。由于二甲苯的相對密度為0.8969，一般能使揮發(fā)油與二甲苯的混合溶

32、液浮于水面。在計算揮發(fā)油的含量，扣除加入二甲苯的體積即可。3 提取完畢，須待油水完全分層后，再將油放出，注意盡量避免帶出水分。4 起先揮發(fā)油單向二次展開層析時，一般先用極性較大的展開劑展開，然后再用極性較小的展開劑展開，所得的分離效果較好。在第一次展開后，應(yīng)將展開劑完全揮去，再進(jìn)行第二次展開，否則將影響第二次展開的極性，從而影響分離效果。5 揮發(fā)油易揮發(fā)逸失，因此進(jìn)行層析檢識時，操作應(yīng)及時，不宜久放。6 溴甲酚綠試劑顯色時，應(yīng)避免在本性條件下進(jìn)行。七、思考題1、計算八角茴香中揮發(fā)油的含量。（計算公式：揮發(fā)油含量（ML/g）=揮發(fā)油體積/八角茴香重量100%）2、提取揮發(fā)油常用方法有哪幾種？哪種

33、方法較好，為什么？3、水蒸氣蒸餾裝置包括哪幾部分？4、水蒸氣蒸餾對被提純物有何要求？實驗七 秦皮中七葉苷和七葉內(nèi)酯的提取、分離與鑒定一、實驗?zāi)康?. 掌握溶劑法提取分離七葉苷和七葉內(nèi)酯的技能；2.掌握內(nèi)酯類化合物的檢識方法二、實驗原理秦皮中含七葉苷和七葉內(nèi)酯。七葉苷易溶于熱水，可溶于乙醇，微溶于冷水，難溶于乙酸乙酯，不溶于乙醚、氯仿，在稀酸中可水解，水溶液有蘭色熒光；七葉內(nèi)酯易溶于熱乙醇和氫氧化鈉溶液，可溶于乙醇、乙酸乙酯，幾乎不溶于乙醚、氯仿。三、 試劑與儀器試劑：秦皮，無水乙醇，蒸餾水，氯仿，乙酸乙酯，無水硫酸鈉，甲醇，氫氧化鈉，三氯化鐵，濃氨水，甲酸，甲酸乙酯，甲苯。儀器：恒溫水浴，布氏

34、漏斗，抽濾瓶，真空泵，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，分液漏斗，紫外檢測儀，硅膠G薄層板。四、實驗步驟1.提取 稱取秦皮粗粉100g，加95%乙醇300mL，水浴回流兩次，每次1小時，過濾，合并濾液，減壓回收至膏狀，即得總提取物。2.分離 上述浸膏加40mL蒸餾水，加熱溶解，待水液冷卻后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，以等體積氯仿洗滌兩次。將氯仿洗滌過的水液置水浴上加熱除去殘留的氯仿。待水液冷卻后以等體積的乙酸乙酯萃取兩次，合并萃取液。用無水硫酸鈉脫水。減壓回收溶劑至干，殘留物溶于溫?zé)峒状贾?，濃縮至適量，放置析晶，即有黃色針狀結(jié)晶析出，濾取結(jié)晶，用甲醇重結(jié)晶，即得七葉內(nèi)酯。 將乙酸乙酯萃取過的水層濃縮至適量，放置，即有微黃色晶

35、體析出。用甲醇、水反復(fù)結(jié)晶，即得七葉苷白色結(jié)晶。3.鑒定1）化學(xué)檢識（1）觀察熒光：將七葉苷和七葉內(nèi)酯甲醇溶液分別滴在一濾紙上，于254nm觀察熒光顏色。再噴氫氧化鈉溶液，觀察熒光變化；（2）三氯化鐵試驗：取七葉苷和七葉內(nèi)酯少許，分別置試管中，加1mL乙醇溶解，加1%三氯化鐵溶液23滴，觀察顏色。再加濃氨水3滴，觀察顏色變化。2）薄層鑒定吸附劑：硅膠G 樣品：七葉苷和七葉內(nèi)酯展開劑：甲酸-甲酸乙酯-甲苯 （1：4：5）254nm觀察斑點熒光五、思考題1.香豆精提取方法都有哪些？2.分析提取各步驟原理？實驗八 大孔吸附樹脂分離純化白頭翁皂苷一、實驗?zāi)康?掌握大孔吸附樹脂的性質(zhì)和使用原理； 學(xué)習(xí)用

36、大孔吸附樹脂分離天然親水性成分的工藝過程以及工藝參數(shù)優(yōu)化方法。二、實驗原理 白頭翁（PulsatiLla chinenesis）為常用傳統(tǒng)中藥，其味苦、性寒，有清熱解毒、涼血止痢等功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有抗阿米巴原蟲、抗菌、抗滴蟲、抗腫瘤作用。白頭翁中主要含有皂苷類成分。 大孔吸附樹脂是一種不含交換基團(tuán)的具有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑，是一種親脂性物質(zhì)，具有各種不同的表面性質(zhì)，依靠分子中的親脂鍵、偶極離子及氫鍵的作用，可以有效地吸附具有不同化學(xué)性質(zhì)的各種類型化合物，同時也容易解吸附。大孔吸附樹脂按極性強弱分為極性、中極性和非極性三種。大孔吸附樹脂具有吸附速度快，選擇性好，吸附容量大，再生處理

37、簡單，機械強度高等優(yōu)點。根據(jù)反相色譜和分子篩原理，對大分子親水性成分吸附力弱，對非極性物質(zhì)吸附力強，適用于親水性和中等極性物質(zhì)的分離，可除去混合物中的糖和低極性小分子有機物，被分離組分間極性差別越大，分離效果越好。一般用水、含水甲醇或乙醇、丙酮洗脫，最后用濃醇或丙酮洗脫，再生時用甲醇或乙醇浸泡洗滌即可。 本實驗采用D101型大孔吸附樹脂提取分離白頭翁中的皂苷。三、試劑與儀器 試劑：D101型大孔吸附樹脂，乙醇，白頭翁粗粉，正丁醇，醋酸，乙醚，蒸餾水，丙酮，活性炭，棉花、硫酸。 儀器：燒杯，漏斗，濾紙，三角燒瓶，球形冷凝管，索氏提取器，電子天平，恒溫水浴，硅膠薄層板，毛細(xì)管，色譜柱，色譜層析缸。

38、 四、實驗步驟 (1)大孔吸附樹脂的預(yù)處理 取D101型大孔吸附樹脂100g于500mL索氏提取器中，用150mL乙醇回流3h，待回流液1份加3份水無混濁時，取出樹脂瀝干乙醇，放入蒸餾水中，浸泡待用。 (2)皂苷的提取 取粉碎后得到的白頭翁藥材粗粉50g，加入200mL工業(yè)酒精回流2h，過濾，再重復(fù)提取一次，合并濾液，回收乙醇至10mL，加50mL乙醚沉淀，倒出上清液，過濾，沉淀用水溶解，活性炭脫色、過濾、濾液上柱。 (3)色譜分離 取一玻璃柱，下端塞上棉花，濕法裝入已處理好的60g大孔吸附樹脂，上端再加少許棉花，取總皂苷液上柱，用水200mL洗脫，再用20%、50%、95%乙醇各200mL洗

39、脫，至洗脫液中不含皂苷，收集各洗脫液。洗脫液20%乙醇、50%乙醇部分各取10mL于水浴加熱蒸發(fā)濃縮至2mL點樣；95%部分于水浴回收至小體積(約30mL)點樣用。 (4)產(chǎn)品的薄層色譜鑒定 色譜材料：硅膠薄層板。 點樣：20%乙醇濃縮液、50%乙醇濃縮液、95%乙醇濃縮液。 展開劑：正丁醇-醋酸-水(4：1：1)。 展開方式：預(yù)飽和后，上行展開。 顯色：10%硫酸液105顯色。 五、實驗結(jié)果與討論 記錄實驗條件、現(xiàn)象、圖譜、斑點顏色、各試劑用量及產(chǎn)品的重量。六、注意事項 配制展開劑時要充分搖勻。 用乙醚沉淀時要一邊攪拌一邊倒入乙醚，使沉淀完全。 乙醚沸點低，要注意安全。七、思考題1大孔吸附樹

40、脂法提取分離皂苷的原理是什么？有何特點？2為什么要進(jìn)行樹脂的預(yù)處理？實驗九 重結(jié)晶及過濾一、實驗?zāi)康模?、學(xué)習(xí)重結(jié)晶法提純固體有機化合物的原理和方法；2、掌握重結(jié)晶的基本操作； 3、練習(xí)普通過濾、抽氣過濾和熱過濾的操作技術(shù)；4、練習(xí)和掌握固體試劑的取用；5、練習(xí)和掌握直接加熱、固體的溶解和結(jié)晶等操作。 二、實驗原理重結(jié)晶是純化固體化合物的重要方法之一。其原理是利用被提純物質(zhì)與雜質(zhì)在某溶劑中溶解度的不同分離純化的。其主要步驟為：（1）將不純固體樣品溶于適當(dāng)溶劑制成熱的近飽和溶液；（2）如溶液含有有色雜質(zhì)，可加活性炭煮沸脫色，將此溶液趁熱過濾，以除去不溶性雜質(zhì)；（3）將濾液冷卻，使結(jié)晶析出；（4）

41、抽氣過濾，使晶體與母液分離。洗滌、干燥后測熔點，如純度不合要求，可重復(fù)上述操作。必須注意，雜質(zhì)含量過多對重結(jié)晶極為不利，影響結(jié)晶速率，有時甚至妨礙結(jié)晶的生成。重結(jié)晶一般只適用于雜質(zhì)含量約在百分之五以下的固體化合物，所以在結(jié)晶之前應(yīng)根據(jù)不同情況，分別采用其他方法進(jìn)行初步提純，如水蒸氣蒸餾，萃取等，然后再進(jìn)行重結(jié)晶處理。 重結(jié)晶的關(guān)鍵是選擇合適的溶劑，理想溶劑應(yīng)具備以下條件：（1）不與被提純物質(zhì)起化學(xué)反應(yīng)；（2）被提純物質(zhì)在溫度高時溶解度大，而在室溫或更低溫度時，溶解度小；（3）雜質(zhì)在熱溶劑中不溶或難溶，在冷溶劑中易溶；（4）容易揮發(fā)，易與結(jié)晶分離；（5）能得到較好的晶體。除上述條件外，結(jié)晶好、回

42、收率高、操作簡單、毒性小、易燃程度低、價格便宜的溶劑更佳。常用溶劑，如水、乙醇、丙酮、苯等。三、試劑與儀器 試劑：粗苯甲酸，蒸餾水，活性炭。儀器：燒杯，電熱套，保溫漏斗，玻璃板，濾紙，電子天平。四、實驗步驟1、稱1g粗苯甲酸于100mL燒杯中，加入40mL蒸餾水，加熱至沸使其溶解，稍冷，加少量活性炭，繼續(xù)加熱煮沸5min；2、趁熱進(jìn)行熱過濾，冷卻，析晶；3、完全析晶后，抽濾，洗滌2-3次，抽濾至干；4、晾干，稱重并計算產(chǎn)率。六、存在的問題和注意事項存在問題：1、加熱溶解固體時，溶液未注意補水，成了過飽和溶液；2、熱過濾時有晶體析出在濾紙和漏斗頸上；3、活性炭因濾紙破被引入到濾液中；4、冷卻析晶

43、不充分，晶體量太少；5、活性炭吸附不充分，得到的晶體發(fā)黃；。6、析晶時攪拌溶液，得到的晶體成渣狀。注意事項：1、加熱過程中應(yīng)注意補充水分； 2、應(yīng)使活性炭脫色完全；3、注意熱過濾的有關(guān)問題；4、靜置析晶，使晶體析出完全。七、裝置圖菊花形濾紙的折疊法 熱過濾 抽氣過濾八、思考題1、簡述重結(jié)晶的主要步驟及各步的主要目的。2、活性炭為何要在固體物質(zhì)完全溶解后加入？為什么不能在溶液沸騰時加入？3、對有機化合物進(jìn)行重結(jié)晶時，最適宜的溶劑應(yīng)具備哪些條件？4、輔助析晶的措施有哪些？5、使用活性炭應(yīng)注意哪些問題？6、為什么熱水漏斗和未過濾的溶液要繼續(xù)加熱？ 實驗十 簡單蒸餾及分餾一、實驗?zāi)康?、熟悉蒸餾和測定

44、沸點的原理，了解蒸餾和測定沸點的意義；2、掌握蒸餾和測定沸點的操作要領(lǐng)和方法；3、初步掌握蒸餾裝置的裝配和拆卸技能；4、掌握分餾柱的工作原理和常壓下的簡單分餾的實驗操作方法。二、實驗原理液體的分子由于分子運動有從表面逸出的傾向，這種傾向隨著溫度的升高而增大。如果把液體置于密閉的真空體系中，液體分子不斷逸出而在液面上部形成蒸汽，最后使得分子由液體逸出的速度與分子由蒸汽中回到液體中的速度相等，使其蒸汽保持一定的壓力。此時液面上的蒸汽達(dá)到飽和，稱為飽和蒸汽。它對液面所施加的壓力稱為飽和蒸汽壓。實驗證明，液體的蒸汽壓大小只與溫度有關(guān)，即液體在一定溫度下具有一定的蒸汽壓。這是指液體與它的蒸汽平衡時的壓力

45、，與體系中存在的液體和蒸汽的絕對量無關(guān)。當(dāng)液體的蒸氣壓增大到與外界施于液面的總壓力（通常是指大氣壓力）相等時，就有大量氣泡從液體內(nèi)部逸出，即液體沸騰。這時的溫度稱為液體的沸點。純粹的液體有機化合物在一定的壓力下具有一定的沸點（沸程0.5-1.5 oC）。利用這一點，我們可以測定純液體有機物的沸點。又稱常量法。這對于對鑒定純粹的液化有機物有一定的意義。（但是具有固定沸點的液體不一定都是純粹的化合物，因為某些有機化合物常和其它組分形成二元或三元共沸混合物，它們也有一定的沸點。）將液體加熱至沸騰，使液體變?yōu)檎羝缓笫拐羝鋮s凝結(jié)為液體，這兩個過程的聯(lián)合操作稱為蒸餾。蒸餾是提純液體物質(zhì)和分離混合物的

46、一種常用方法。通過蒸餾可以將易揮發(fā)的物質(zhì)和不易揮發(fā)的物質(zhì)分離開來，也可將混合液體中各組分的沸點要相差30以上的物質(zhì)進(jìn)行分離。蒸餾和分餾的基本原理是一樣的，都是利用有機物質(zhì)的沸點不同，在蒸餾過程中低沸點的組分先蒸出，高沸點的組分后蒸出，從而達(dá)到分離提純的目的。不同的是，分餾是借助于分餾柱使一系列的蒸餾不需多次重復(fù)，一次得以完成。簡言之，分餾即多次的簡單蒸餾。在實驗室常采用分餾柱來實現(xiàn)，工業(yè)上采用精餾塔。將幾種具有不同沸點而又可以完全互溶的液體混合物加熱，當(dāng)其總蒸氣壓等于外界壓力時，就開始沸騰氣化，蒸氣中易揮發(fā)液體的成分較在原混合液中為多。在分餾柱內(nèi)，當(dāng)上升的蒸氣與下降的冷凝液互相接觸時，上升的蒸

47、氣部分冷凝放出熱量使下降的冷凝液部分氣化，兩者之間發(fā)生了熱量交換，其結(jié)果，上升蒸氣中易揮發(fā)組分增加，而下降的冷凝液中高沸點組分（難揮發(fā)組分）增加，如此繼續(xù)多次，就等于進(jìn)行了多次的氣液平衡，即達(dá)到了多次蒸餾的效果。這樣靠近分餾柱頂部易揮發(fā)物質(zhì)的組分比率高，而在燒瓶里高沸點組分（難揮發(fā)組分）的比率高。這樣只要分餾柱足夠高，就可將這種組分完全徹底分開。三、試劑與儀器試劑：95%乙醇、丙酮。儀器：圓底燒瓶、蒸餾頭、直形冷凝管、真空接受管（尾接管）、錐形瓶、溫度計導(dǎo)管、溫度計（100）、橡皮管等四、實驗步驟簡單蒸餾操作（樣品：95%的乙醇）1、加料 將待蒸乙醇通過玻璃漏斗小心倒入蒸餾瓶中，不要使液體從支管流出。加入幾粒沸石，塞好帶溫度計的塞子。再檢查一次裝置是否穩(wěn)妥與嚴(yán)密。2、加熱 用水冷凝管時，先打開冷凝水龍頭緩緩?fù)ㄈ肜渌?，然后開始加熱。加熱時可見蒸餾瓶中液體逐漸沸騰，蒸氣逐漸上升，溫度計讀數(shù)也略有上升。當(dāng)蒸氣的頂端達(dá)到水銀球部位時，溫度計讀數(shù)急