轉(zhuǎn)基因技術(shù)與作物育種演示教學(xué)

1、轉(zhuǎn)基因技術(shù)與作物育種v基因工程原理：應(yīng)用人工方法把生物的遺傳物質(zhì)（主要是DNA），在體外進(jìn)行切割、拼接和重組，然后將重組了的DNA導(dǎo)入某種宿主細(xì)胞或個(gè)體中，從而改變它們的遺傳特性；有時(shí)還使新的遺傳物質(zhì)在新的宿主細(xì)胞或個(gè)體中大量表達(dá)，以得到基因產(chǎn)物?；蚬こ痰膭e名基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)操作環(huán)境生物體外操作對(duì)象基 因操作水平DNA分子水平基本過程剪切拼接導(dǎo)入表達(dá)結(jié)果人類需要的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)基因育種的優(yōu)勢v基因資源大大拓寬；v提供了新的育種途徑；v可以對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行定向變異和定向選擇；v提高了選擇效率，加快育種進(jìn)程。一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀v （一）國際轉(zhuǎn)基因植物研究與現(xiàn)狀（一）國際轉(zhuǎn)基因植物研究

2、與現(xiàn)狀全世界轉(zhuǎn)基因的種植面積：1996年的280萬公頃，2001年增加到5260萬公頃，至2005年，種植面積增至9000萬公頃；種植轉(zhuǎn)基因的主要國家：美國、阿根廷、加拿大、中國等；種植主要轉(zhuǎn)基因作物：大豆、玉米、棉花和油菜；轉(zhuǎn)基因作物的主要目標(biāo)：抗除草劑、抗病蟲性；v我國轉(zhuǎn)基因作物：v轉(zhuǎn)Bt基因的抗蟲棉、延遲成熟的轉(zhuǎn)基因番茄、抗病毒病的轉(zhuǎn)基因甜椒等。v如我國轉(zhuǎn)基因抗蟲棉種植面積達(dá)4000多萬畝，而國產(chǎn)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉種植面積達(dá)到70%左右，其中河北、山東、河南、安徽4省實(shí)現(xiàn)了100%的種植。 二、轉(zhuǎn)基因育種的程序（一）農(nóng)業(yè)中主要的目的基因（一）農(nóng)業(yè)中主要的目的基因v抗植物蟲害基因及其利用v抗植物

3、病害基因及其利用v抗非生物脅迫基因及其利用v改善作物品質(zhì)的基因及其利用v改良作物產(chǎn)量的基因及其利用 Bt基因及其應(yīng)用 v蘇云金桿菌產(chǎn)生的具有高度特異性殺蟲活性的蛋白。又稱內(nèi)毒素或殺蟲結(jié)晶蛋白（IPC).v作用原理：作用原理： IPC通常以原毒素形式存在，當(dāng)昆蟲取食IPC后，在昆蟲的消化道內(nèi)，原毒素被活化，活化的IPC能與昆蟲腸道上皮細(xì)胞上面的特異性蛋白結(jié)合。結(jié)合以后的IPC全部或部分嵌合于細(xì)胞膜中，使細(xì)胞膜產(chǎn)生一些孔道，從而導(dǎo)致細(xì)胞由于滲透平衡被破壞而破裂。昆蟲幼蟲將停止進(jìn)食，最終死亡。 蛋白酶抑制劑基因及其應(yīng)用v蛋白酶抑制劑是一類蛋白質(zhì)，在大多數(shù)植物種子和塊莖中，其含量可高達(dá)總蛋白的110。

4、v抗蟲原理：抗蟲原理： 蛋白酶抑制劑與昆蟲消化道內(nèi)蛋白消化酶相結(jié)合，阻斷或減弱蛋白酶對(duì)外源蛋白質(zhì)的水解作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)不能被正常消化；使昆蟲不能正常發(fā)育。 幾丁質(zhì)酶和1，3葡聚糖酶基因v作用原理：作用原理： 幾丁質(zhì)酶存在于植物和微生物中，具有降解幾丁質(zhì)的作用。病原真菌細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)的降解，破壞細(xì)胞新物質(zhì)的沉積，致使病原體死亡。幾丁質(zhì)酶活性的增強(qiáng)也往往伴隨著 1，3葡聚糖酶及其他抗病PR蛋白的形成，共同發(fā)揮植物的防衛(wèi)作用。 耐除草劑基因及其應(yīng)用v耐除草劑基因工程主要有兩種策略：耐除草劑基因工程主要有兩種策略： 1）修飾除草劑作用的靶蛋白，使其對(duì)除草劑不敏感或促其過量表達(dá)以使植物吸收除草劑后仍能進(jìn)

5、行正常代謝； 2）引入酶或酶系統(tǒng)，在除草劑發(fā)生作用前將其降解或解毒。轉(zhuǎn)基因大豆 面包烘烤質(zhì)量的種子貯藏蛋白改良v通過增加HMW谷蛋白亞基的拷貝數(shù)來增加HMW的含量，從而改善加工品質(zhì)；v引入與面包烘烤品質(zhì)密切相關(guān)的HMW谷蛋白亞基，改變亞基類型，通過改善亞基質(zhì)量來改善加工品質(zhì)（二）目的基因的獲得v根據(jù)基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)進(jìn)行基因克??；根據(jù)基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)進(jìn)行基因克隆； 1）分離純化蛋白質(zhì)； 2）氨基酸序列測定； 3）推導(dǎo)核苷酸序列； 4）化學(xué)合成該基因； 5）基因的功能鑒定。v從基因組從基因組DNADNA或或mRNAmRNA序列克隆基因序列克隆基因1、PCR技術(shù)在植物基因克隆中的應(yīng)用2、基因文庫

6、技術(shù)分離目的基因3、mRNA差別顯示技術(shù)分離差別表達(dá)基因 PCR直接擴(kuò)增克隆目的基因vPCR直接擴(kuò)增克隆是一種參考已知基因序列克隆基因的方法。v目前已知很多植物基因的序列，當(dāng)克隆類似基因時(shí)，可先從Genebank庫中找到有關(guān)基因序列，用PCR方法克隆不同植物的基因。 方方 法：法：v根據(jù)已知基因的序列，設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物；從植物中提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；v擴(kuò)增片段的純化；v酶切純化的擴(kuò)增片段及載體，回收酶切片斷；v將兩片段用連接酶連接；v重組體轉(zhuǎn)化大腸桿菌；v用酶切分析和序列分析檢測重組子，并與已知基因序列進(jìn)行比較； （二）目的基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建（二）目的基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建（三）受體材料的選

7、擇受體材料的條件：受體材料的條件：v高效穩(wěn)定的再生能力；v較高的遺傳穩(wěn)定性；v有穩(wěn)定的外植體來源；v對(duì)篩選劑敏感。受體材料的類型：受體材料的類型：v愈傷組織再生系統(tǒng)；v直接分化再生系統(tǒng)；v原生質(zhì)體再生系統(tǒng)；v胚狀體再生系統(tǒng)；v生殖細(xì)胞再生系統(tǒng)。（四）轉(zhuǎn)基因方法的確定和外源基因的轉(zhuǎn)化1 1、載體介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)、載體介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)v葉盤法：葉盤法：用打孔器打出葉園盤，將帶有新鮮傷口的葉園盤與載有目的基因的農(nóng)桿菌進(jìn)行短期共培養(yǎng)，農(nóng)桿菌通過傷口感染將外源目的基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)并整合到植物的基因組中。v真空滲入法：v基因槍轟擊法：基因槍轟擊法：將外源DNA包裹在金粉顆粒表面，借助高壓動(dòng)力射入受體細(xì)胞和組

8、織，當(dāng)微粒上的DNA進(jìn)入細(xì)胞后將整合到植物基因組中并得以表達(dá)。v 化學(xué)刺激法；化學(xué)刺激法；v 高壓電穿孔法；高壓電穿孔法；2、外源基因直接導(dǎo)入法3、種質(zhì)系統(tǒng)介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化特點(diǎn)：v轉(zhuǎn)化過程不是依靠物理化學(xué)過程，而是依靠生物自身的種質(zhì)系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)的；v不需要植物組織、細(xì)胞等離體培養(yǎng)過程；v植物整體水平上的轉(zhuǎn)化；v方法簡便易行；主要方法包括：v花粉管通道法；v子房、幼胚注射法；（五）轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定1 1、轉(zhuǎn)目的基因植物的標(biāo)準(zhǔn)：、轉(zhuǎn)目的基因植物的標(biāo)準(zhǔn)：v有嚴(yán)格的對(duì)照；v有轉(zhuǎn)化當(dāng)代目的基因整合和表達(dá)的分子生物學(xué)證據(jù)；v轉(zhuǎn)化當(dāng)代需有目的基因控制的表型性狀；v有性繁殖作物需有目的基因控制的表型性狀傳遞給后代的證據(jù)。2 2、轉(zhuǎn)化體的篩選、轉(zhuǎn)化體的篩選v抗生素抗性基因：如卡那霉素抗性基因NPTIIv除草劑抗性基因：如抗除草劑的bar基因。3 3、轉(zhuǎn)化體的鑒定、轉(zhuǎn)化體的鑒定v DNA水平的鑒定：southern雜交；v 轉(zhuǎn)錄水平的鑒定：northern雜交；v 翻譯水平的鑒定：western雜交。第二節(jié) 轉(zhuǎn)基因作物品種的選育一、育種目標(biāo)的制訂二、轉(zhuǎn)基因植株的獲得三、轉(zhuǎn)基因作物品種的選育v純系育種v回交育種v雜交育種v雜種品種轉(zhuǎn)基因油菜轉(zhuǎn)基因土豆本