細胞培養(yǎng)2014.3

1、組織培養(yǎng)和組化技術細胞形態(tài)學實驗中心1/93組組 織織 培培 養(yǎng)養(yǎng) 概念:指的是從活體內取出組織在體外模擬其生長 生理環(huán)境即無菌、適當的溫度，pH值和合適 營養(yǎng)條件下，使之生存和生長并維持其結構 和功能的方法。分類： 細胞培養(yǎng) (Cell Culture) 組織培養(yǎng) (Tissue Culture) 器官培養(yǎng) (Organ Culture)細胞培養(yǎng)：細胞培養(yǎng)：將活細胞（尤其是分散的細胞）在體 外培養(yǎng)的方法。組織培養(yǎng)組織培養(yǎng)：從生物體內取出活的組織塊，大小在（O.5 1立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米）在體外進行培養(yǎng)的方法。器官培養(yǎng)器官培養(yǎng)：使用器官原基或器官的一部分或整個器官 (一般指胚胎器官

2、)在體外進行培養(yǎng)的方法。細胞培養(yǎng)的基本概念細胞培養(yǎng)的基本概念 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng) primary culture : : 指從供體取得組織，分離所得到的細胞接種于培養(yǎng)瓶,進行首次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)（初代培養(yǎng)）。 傳傳 代代 passage : : 細胞由原培養(yǎng)瓶內分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶過程稱之為傳代，進行一次分離培養(yǎng)稱之為傳一代。 原代培養(yǎng)期原代培養(yǎng)期: : 從體內取出組織細胞開始培養(yǎng)到第一次進行傳代之前的這一段時期。傳傳 代代 期期: : 一旦原代培養(yǎng)經過分割,重新接種到兩個或兩個以上的器皿內進行培養(yǎng)標志進入傳代培養(yǎng)期。衰衰 退退 期期: : 傳代培養(yǎng)到一定代數時,細胞生命活動明顯減弱, 生長

3、緩慢,很少或不再分裂,給更多的營養(yǎng)也無濟于事,表明培養(yǎng)物進入衰退期。細胞系細胞系 cell linecell line：是指原代培養(yǎng)物經傳代培養(yǎng)后得到的一群 不均一的細胞,可以長期連續(xù)傳代。細胞株細胞株cell straincell strain：通過選擇或克隆化培養(yǎng),從原代培養(yǎng)物或 細胞系中獲得的具有特殊遺傳、生化 性質或特異標志的細胞群。有限細胞系：有限細胞系：在在體外的生存期有限的細胞系。無限細胞系：無限細胞系：在體外可以持續(xù)生存,具有無限的繁殖能力的細胞 系(永生細胞系)。正常細胞、永生細胞和腫瘤細胞的性狀區(qū)別正常細胞、永生細胞和腫瘤細胞的性狀區(qū)別正常細胞正常細胞永生細胞永生細胞腫瘤細

4、胞腫瘤細胞接觸抑制接觸抑制有有有有無無永生性永生性無無有有有有克隆形成率克隆形成率無無弱弱強強核型改變核型改變無無常有常有有有（二倍體）（二倍體）（非整倍體）（非整倍體） （非整倍體）（非整倍體）培養(yǎng)細胞的生長方式培養(yǎng)細胞的生長方式貼附生長：貼附生長： 必須貼附于支持物表面才能生長。見于各種實體瘤細胞、巨噬細胞等懸浮生長懸浮生長： 于懸浮狀態(tài)下即可生長，不需要貼附于支持物表面。 見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細胞培養(yǎng)細胞的形態(tài)培養(yǎng)細胞的形態(tài)成纖維型細胞：起源中胚層間充質的組織，如心肌、平滑肌、 成骨細胞。上皮型細胞：起源內、外胚層的組織，如皮膚、消化管上皮, 肝、胰、肺上皮。游走型細胞：細胞質經常伸出偽

5、足和突起，呈游走或變形運動。多型性細胞：一般神經組織的細胞。成成纖纖維維型型上上皮皮型型游游走走型型多多形形型型相差顯微鏡觀察培養(yǎng)細胞相差顯微鏡觀察培養(yǎng)細胞懸浮的脂肪細胞懸浮的脂肪細胞細胞核的熒光染色細胞核的熒光染色細胞骨架的熒光染色細胞骨架的熒光染色培養(yǎng)細胞雙熒光染色培養(yǎng)細胞雙熒光染色原代細胞培養(yǎng)原代細胞培養(yǎng)1.機械解離細胞法：運用各種物理學處理手段解離組織成為單個細胞。 2.酶學解離細胞法：用蛋白消化酶解離組織，成為單個細胞是體外培養(yǎng)分散組織的基本方法。主要有胰酶蛋白、膠原酶、鏈霉蛋白酶。3 螯合劑解離細胞法：通過結合（螯合）細胞間質中二價陽離子而破壞細胞的連接。如乙二胺四乙酸鈉（EDTA

6、-2Na)。原代細胞培養(yǎng)原代細胞培養(yǎng)取鼠胚組織取鼠胚組織1、脊椎脫臼法、脊椎脫臼法機械解離細胞法機械解離細胞法制成細胞懸液消化培養(yǎng)法消化培養(yǎng)法培養(yǎng)細胞貼壁過程培養(yǎng)細胞貼壁過程血清中有促使細胞貼壁的纖維連接素血清中有促使細胞貼壁的纖維連接素LETS、膠、膠原、糖蛋白（生長基質）等，這些帶正電荷的糖原、糖蛋白（生長基質）等，這些帶正電荷的糖蛋白是促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細胞的蛋白是促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細胞的表面蛋白參與貼附過程。表面蛋白參與貼附過程。 游離期：游離期： 細胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮細胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮 狀態(tài)也稱懸浮期。狀態(tài)也稱懸浮期。 此時細胞質回縮，胞體呈圓球

7、此時細胞質回縮，胞體呈圓球 形。形。1010分鐘分鐘 4 4小時小時 貼壁期：貼壁期： 細胞附著于底物上，游離期細胞附著于底物上，游離期 結束。結束。 細胞株平均在細胞株平均在1010分鐘分鐘 4 4小時貼壁。小時貼壁。 底物：膠原、玻璃、塑料、其它細胞等。底物：膠原、玻璃、塑料、其它細胞等。 潛伏期潛伏期 此時細胞有生長活動，而無細胞分裂。此時細胞有生長活動，而無細胞分裂。 原代細胞持續(xù)約原代細胞持續(xù)約24-96h24-96h； 腫瘤細胞或永生細胞約腫瘤細胞或永生細胞約6-24h6-24h對數生長期對數生長期： 細胞數隨時間變化成倍增長，細胞數隨時間變化成倍增長， 活力最佳，最適合進行實驗研

8、究。活力最佳，最適合進行實驗研究。停止期（平臺期）：停止期（平臺期）： 細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂。細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂。 機制：接觸抑制、密度依賴性、營養(yǎng)液成份。機制：接觸抑制、密度依賴性、營養(yǎng)液成份。每代貼附生長細胞的生長過程每代貼附生長細胞的生長過程細胞培養(yǎng)設施和基本條件 常用儀器設備和耗材常用儀器設備和耗材 無菌室無菌室超凈工作臺，超凈工作臺，COCO2 2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱倒置顯微鏡倒置顯微鏡消毒設備：壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，消毒設備：壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，液氮液氮罐罐酶標儀、微孔板震蕩器酶標儀、微孔板震蕩器自動雙重純水蒸餾器，純水儀，濾器，酸缸自動

9、雙重純水蒸餾器，純水儀，濾器，酸缸耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動吸引器，培養(yǎng)板，耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動吸引器，培養(yǎng)板， 凍存管凍存管無無 菌菌 室室無菌室使用規(guī)則無菌室使用規(guī)則操作操作前將紫外線燈打開前將紫外線燈打開3030分鐘對無菌室消分鐘對無菌室消毒，然后關閉紫外線燈。毒，然后關閉紫外線燈。進入無菌室必須帶好口罩，更換工作服，進入無菌室必須帶好口罩，更換工作服，鞋帽。鞋帽。無菌室的無菌室的設備，物品不得攜出室外。設備，物品不得攜出室外。操作完畢后，認真整理室內物品，搞好清操作完畢后，認真整理室內物品，搞好清潔衛(wèi)生。潔衛(wèi)生。檢查好電源、煤氣閥方可離去。檢查好電源、煤氣閥方可離去。無菌操作無菌操作

10、超超 凈凈 臺臺 超凈工作臺的工作原理是利用鼓風機驅動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內構成無菌環(huán)境。 CO2培養(yǎng)箱設定的條件：培養(yǎng)箱設定的條件： 37 5CO2 作用作用：維持培養(yǎng)液的：維持培養(yǎng)液的 PH值值 7.27.4范圍范圍 NaHCO3+H2O Na+ + OH - - + H2O + CO2COCO2 2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱COCO2 2培養(yǎng)箱使用時注意的問題培養(yǎng)箱使用時注意的問題用螺旋口瓶培養(yǎng)細胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。用螺旋口瓶培養(yǎng)細胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。為了保持箱內濕度為了保持箱內濕度, ,需放置需放置30003

11、000毫升蒸毫升蒸 餾餾 水于槽中水于槽中, , 以避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。以避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。保持培養(yǎng)箱內空氣干凈。定期消毒（保持培養(yǎng)箱內空氣干凈。定期消毒（ 90 90 ，14 h)14 h)。 倒置光顯微鏡顯顯微微鏡鏡各各部部分分名名稱稱目鏡筒目鏡筒熒光燈室熒光燈室透射燈室透射燈室熒光光源熒光光源熒光濾片選擇熒光濾片選擇熒光濾片盒熒光濾片盒調焦（粗調焦（粗/ /細）細）X X方向平臺移動方向平臺移動Y Y方向平臺移動方向平臺移動光路轉換光路轉換透射光源透射光源聚光鏡聚光鏡熒光組件熒光組件集光鏡集光鏡 物鏡物鏡物鏡轉換器物鏡轉換器透射濾片透射濾片目鏡目鏡物物 鏡鏡相差標識相差標識相差標識相差標識ph

12、1相差顯微鏡 由于細胞各部細微結構的折射率和厚度的不同，光波由于細胞各部細微結構的折射率和厚度的不同，光波 通過時，波長和振幅并不發(fā)生變化，僅相位發(fā)生變化通過時，波長和振幅并不發(fā)生變化，僅相位發(fā)生變化 且人眼無法觀察。而相差顯微鏡通過改變這種相位差，且人眼無法觀察。而相差顯微鏡通過改變這種相位差， 并利用光的衍射和干涉現象，把相差變成以明暗并利用光的衍射和干涉現象，把相差變成以明暗顯現顯現 的的振幅差來觀察無色活細胞和未染色的標本。振幅差來觀察無色活細胞和未染色的標本。 相差顯微鏡和普通顯微鏡的區(qū)別是相差顯微鏡和普通顯微鏡的區(qū)別是: :用環(huán)狀光闌代替可用環(huán)狀光闌代替可變光闌，變光闌， 用帶相板

13、的物鏡代替普通物鏡。用帶相板的物鏡代替普通物鏡。高壓蒸汽滅菌器高壓蒸汽滅菌器 濕熱消毒：適用于培養(yǎng)用液、橡膠制品、布類、玻璃濕熱消毒：適用于培養(yǎng)用液、橡膠制品、布類、玻璃 制品和金屬器械。制品和金屬器械。高壓蒸汽消毒高壓蒸汽消毒要求：要求：培養(yǎng)用液、橡膠制品培養(yǎng)用液、橡膠制品 10磅磅10分鐘分鐘布類、玻璃制品和金屬器械。布類、玻璃制品和金屬器械。 15磅磅20分鐘分鐘注意：注意：1.使用高壓蒸汽滅器前仔細閱讀產品說明書，使用高壓蒸汽滅器前仔細閱讀產品說明書， 經相關人員培訓后方能使用，以免發(fā)生意外。經相關人員培訓后方能使用，以免發(fā)生意外。 2.消毒完畢后，待壓力表讀數降為零，才能消毒完畢后，

14、待壓力表讀數降為零，才能 開蓋，小心操作，防止燙傷。開蓋，小心操作，防止燙傷。干干熱熱滅滅菌菌器器干熱滅菌器干熱滅菌器干熱消毒：適用于玻璃器皿的消毒。干熱消毒：適用于玻璃器皿的消毒。要求：要求：160160保持保持9090120120分鐘。分鐘。注意：注意：1.1.使用干熱滅菌器前仔細閱讀產品說明書，經使用干熱滅菌器前仔細閱讀產品說明書，經 相關人員培訓后方能使用，以免發(fā)生意外。相關人員培訓后方能使用，以免發(fā)生意外。 2. 2.消毒完畢后，不要立刻打開箱門，防止消毒完畢后，不要立刻打開箱門，防止 損壞玻璃器皿和影響消毒效果。損壞玻璃器皿和影響消毒效果。電離輻射滅菌放射性核素產生的射線（由60C

15、o產生）或電子加速器產生的加速粒子照射物品以殺滅微生物的方法優(yōu)點：照射時不會升溫，適合不耐熱物品的消毒。 穿透力強可以對密封包裝的物品進行消毒。缺點：誘變作用很強不適合消毒活得生物材料。 液氮罐內部結構內部結構濾濾 器器正壓式濾器正壓式濾器負壓式濾器電電 子子 天天 平平電子天平電子天平電子精密天平電子精密天平 使用前的準備工作使用前的準備工作 請將電子秤置于穩(wěn)固平坦之桌面或臺架使用，勿置請將電子秤置于穩(wěn)固平坦之桌面或臺架使用，勿置于震動不穩(wěn)的桌面或臺架上于震動不穩(wěn)的桌面或臺架上 避免置放于溫度變化過大或空氣流動劇烈之場所，避免置放于溫度變化過大或空氣流動劇烈之場所，如日光直射或冷氣出風口處如

16、日光直射或冷氣出風口處使用獨立電源插座以免其它電器干擾使用獨立電源插座以免其它電器干擾調整電子秤的調整腳，使秤平穩(wěn)且水平儀內氣泡居調整電子秤的調整腳，使秤平穩(wěn)且水平儀內氣泡居圓圈中央圓圈中央當電源開啟時，請勿將物品置放在秤盤上，使用前當電源開啟時，請勿將物品置放在秤盤上，使用前先熱機先熱機1515分鐘以上分鐘以上( (高精度秤必須更長時間高精度秤必須更長時間) ) 首先檢查電源是否連接好。稱重時輕拿輕放，被稱首先檢查電源是否連接好。稱重時輕拿輕放，被稱物品小心加減，不允許散在天平內。物品小心加減，不允許散在天平內。將開關打開后，當屏幕上出現將開關打開后，當屏幕上出現0.0000時，才可將被時，

17、才可將被 稱物品放上，關好拉門，當屏幕左上角的稱物品放上，關好拉門，當屏幕左上角的“0”消失消失時，即為本品的重量。時，即為本品的重量。稱重完后將物品取出，關好拉門，關閉開關，搞好稱重完后將物品取出，關好拉門，關閉開關，搞好清潔衛(wèi)生，方可離開。清潔衛(wèi)生，方可離開。電子天平使用規(guī)則電子天平使用規(guī)則石英玻璃蒸餾器蒸蒸 餾餾 水水去離子水去離子水用樹脂離子交換柱可去掉用樹脂離子交換柱可去掉水中的無機離子，不能有水中的無機離子，不能有效去除有機物。效去除有機物。用于細胞培養(yǎng)時，去離子用于細胞培養(yǎng)時，去離子水必須再蒸餾一次，方能水必須再蒸餾一次，方能配制體外培養(yǎng)的各種液體配制體外培養(yǎng)的各種液體過濾層去處

18、粗雜質過濾層去處粗雜質去有機層去有機層去離子層去離子層去熱源層去熱源層過濾除菌層過濾除菌層 超超 純純 水水純水儀培 養(yǎng) 板培培 養(yǎng)養(yǎng) 瓶瓶常用玻璃器皿清洗常用玻璃器皿清洗浸泡（自來水）、刷洗（洗衣粉，洗潔精）、浸泡（自來水）、刷洗（洗衣粉，洗潔精）、流水沖洗、流水沖洗、 干燥、泡酸（干燥、泡酸（24小時）、流水沖洗、小時）、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、50烘干、包裝、滅菌。烘干、包裝、滅菌。清潔液的配制清潔液的配制細胞培養(yǎng)用液的配制細胞培養(yǎng)用液的配制一緩沖液一緩沖液1.平衡鹽溶液平衡鹽溶液( BSS) 2. Hanks: 適用于適用于密封培養(yǎng)環(huán)境，能起緩沖密封培養(yǎng)環(huán)境，能起

19、緩沖 pH的作用。的作用。 3. D-Hanks: 無無Ca2+、Mg2+的緩沖液的緩沖液 4.PBS: 最最常用的常用的BSS (根據需要根據需要,選擇不選擇不 同的同的BSS)HanksHanks液的配方（液的配方（ g/L)g/L)NaCLNaCL 8.0 8.0KCL 0.4KCL 0.4CaClCaCl2 2 0.140.14MgSOMgSO4 4 7H 7H2 2O 0.2O 0.2NaNa2 2HPOHPO4 4HH2 2O 0.06O 0.06KHKH2 2POPO4 4 0.060.06NaHNaH CO CO3 3 0.350.35葡萄糖葡萄糖 1.001.00酚紅酚紅 0

20、.020.02D-HanksD-Hanks液的配方（液的配方（g/Lg/L）NaCLNaCL 8.0 8.0KCL 0.4KCL 0.4NaNa2 2HPOHPO4 4HH2 2O 0.06O 0.06KHKH2 2POPO4 4 0.060.06NaHCONaHCO3 3 0.350.35酚紅酚紅 0.020.02PBSPBS的配方的配方NaClNaCl 8.0 8.0 g g KClKCl 0.2 0.2 g g NaNa2 2HPOHPO4 4.H.H2 2O 1.56 O 1.56 g g KHKH2 2POPO4 4 0.20 0.20 g g 加加新鮮制成雙蒸水至新鮮制成雙蒸水至1

21、000 ml1000 ml二二. .消化液消化液1.胰蛋白酶胰蛋白酶2.乙二胺四乙酸乙二胺四乙酸二鈉（二鈉（EDTA-2Na）3.膠原酶膠原酶胰蛋白酶胰蛋白酶：胰蛋白酶胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨肽健，除去細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架，從而使細胞分離。架，從而使細胞分離。胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的的BSS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是是0.25 ,0.125%。用濾器過濾除菌。用濾器過濾除菌。胰蛋白酶液濃度越高，作用越強，

22、但超過一胰蛋白酶液濃度越高，作用越強，但超過一定限度會損傷細胞。胰蛋白酶液消化時間：定限度會損傷細胞。胰蛋白酶液消化時間：2 10分鐘。分鐘。含血清培養(yǎng)液終止其對細胞的消化作用含血清培養(yǎng)液終止其對細胞的消化作用膠原酶膠原酶 膠原酶分膠原酶分、型及肝細胞專用型型及肝細胞專用型 活性：活性：125125200u200umgmg，u u代表膠原釋放代表膠原釋放umolumol亮亮 氨酸活性，常用上皮類細胞和原代細胞培養(yǎng)，不同組氨酸活性，常用上皮類細胞和原代細胞培養(yǎng)，不同組 織需選擇不同類型的膠原酶織需選擇不同類型的膠原酶 型膠原酶型膠原酶 : :可用于肝、骨、甲狀腺、心臟、脂肪組織可用于肝、骨、甲狀

23、腺、心臟、脂肪組織型膠原酶型膠原酶: :對組織有廣譜的消化作用對組織有廣譜的消化作用 型膠原酶型膠原酶: :用于分離胰島細胞用于分離胰島細胞三培養(yǎng)基三培養(yǎng)基培養(yǎng)基：是維持體外細胞生存和生長的溶液，培養(yǎng)基：是維持體外細胞生存和生長的溶液， 由由天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基和和合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基組成。組成。.天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基： 血清血清、血漿、和組織提取、血漿、和組織提取液（如液（如雞胚和牛胚浸液雞胚和牛胚浸液） 優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好 缺點缺點: 成分復雜，影響對某些實驗產物的提取成分復雜，影響對某些實驗產物的提取 和和實驗結果的分析。易發(fā)生支原體等污染實驗結

24、果的分析。易發(fā)生支原體等污染 血清優(yōu)點：1)1)提供基本營養(yǎng)物質提供基本營養(yǎng)物質2)2)提供貼壁和擴展因子提供貼壁和擴展因子（纖連蛋白，層粘連蛋白等）纖連蛋白，層粘連蛋白等）3)3)含有含有激素激素及各種生長因子（及各種生長因子（FGFFGF，EGFEGF， PDGF PDGF）4)4)提供結合蛋白提供結合蛋白5)5)對培養(yǎng)中的細胞起保護作用對培養(yǎng)中的細胞起保護作用u血清質量好壞是實驗成敗的關鍵。血清質量好壞是實驗成敗的關鍵。u常用血清有胎牛血清（常用血清有胎牛血清（FBS),小牛血清小牛血清(CS), ,兔兔血清血清, ,馬血清等馬血清等, ,其中以胎牛血清質量最好。其中以胎牛血清質量最好。

25、u優(yōu)質血清的標準：透明，淡黃色，無沉淀物，優(yōu)質血清的標準：透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、支原體、病毒污染。無細菌、支原體、病毒污染。u血清的滅活（消除補體活性）：血清的滅活（消除補體活性）：56 56 ，30 30 分鐘分鐘u血清的消毒：過濾除菌血清的消毒：過濾除菌一般說來含一般說來含5小牛血清的培養(yǎng)基對大多數小牛血清的培養(yǎng)基對大多數細胞可以維持細胞不死但支持細胞生長一般細胞可以維持細胞不死但支持細胞生長一般需加需加 10血清血清血清中不僅存在促細胞生長因子，同對也存在血清中不僅存在促細胞生長因子，同對也存在細胞生長抑制因子或毒性因子，因此在含血清細胞生長抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)

26、基中培養(yǎng)的細胞所反映的生物學特性是細培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞所反映的生物學特性是細胞和復雜血清因子的綜合反應。胞和復雜血清因子的綜合反應。在生長因子、蛋白質工程、基因表達調控等研在生長因子、蛋白質工程、基因表達調控等研究領域，迫切需要用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞究領域，迫切需要用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞無血清培養(yǎng)基(Serum-free medium)能支持動物細胞在體外生長的不含血清的培養(yǎng)基通常由基礎培養(yǎng)基添加已知成份(粘附因子，生長因子，激素,酶抑制劑，微量元素等）。無血清培養(yǎng)基克服了含血清培養(yǎng)基中血清的各種成分含量不確定克服批次間質量差異大，常污染病毒或支原體，給培養(yǎng)物的后加工和提純帶來困難合成培養(yǎng)基合

27、成培養(yǎng)基： 合成培養(yǎng)基是根據細胞生存所需物質的種類和數合成培養(yǎng)基是根據細胞生存所需物質的種類和數量，用人工方法模擬合成的。目前已設計出許多種培量，用人工方法模擬合成的。目前已設計出許多種培養(yǎng)基，如養(yǎng)基，如Hams/F12, MEM、RPMI-1640,DMEM等。等。優(yōu)點優(yōu)點： 標準化生產，組分和含量相對固定成本低。標準化生產，組分和含量相對固定成本低。 缺點：缺點： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞, 生長需要。生長需要。 主要成分主要成分：1)氨基酸氨基酸：是細胞合成蛋白質的原料：是細胞合成蛋白質的原料，有，有12種種 必需氨基酸必需氨基酸，此外谷，此外

28、谷 氨酰胺起到氨酰胺起到很很 重要作用重要作用.2)單糖單糖：細胞有氧酵解和無氧：細胞有氧酵解和無氧酵解，六酵解，六碳糖碳糖是是 主要能源主要能源.3)維生素維生素：扮演輔酶，輔基的角色，必不可少：扮演輔酶，輔基的角色，必不可少。 如生物素如生物素、葉酸、泛酸等葉酸、泛酸等.4)無機無機離子和微量元素離子和微量元素：鈉、鉀、鈣、鎂、硒等：鈉、鉀、鈣、鎂、硒等. 合成培養(yǎng)基種類199,109199,109培養(yǎng)基培養(yǎng)基：19501950年研制成功，是為培養(yǎng)雞胚組織而年研制成功，是為培養(yǎng)雞胚組織而設計的設計的. .HamF10,HamF12HamF10,HamF12培養(yǎng)基培養(yǎng)基：19631963年研

29、制成功，是為培養(yǎng)小鼠年研制成功，是為培養(yǎng)小鼠二倍體細胞設計，同時也適合人類二倍體細胞的培養(yǎng)二倍體細胞設計，同時也適合人類二倍體細胞的培養(yǎng). .RPIM1640RPIM1640培養(yǎng)基培養(yǎng)基：最初為培養(yǎng)小鼠白血病細胞而設計的，：最初為培養(yǎng)小鼠白血病細胞而設計的，現在廣泛應用于腫瘤細胞或正常細胞培養(yǎng)現在廣泛應用于腫瘤細胞或正常細胞培養(yǎng). .MEMMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)基：最限量：最限量EagleEagle培養(yǎng)基，僅有培養(yǎng)基，僅有1212種必需氨基酸，種必需氨基酸，適合特殊細胞培養(yǎng)。適合特殊細胞培養(yǎng)。DMEMDMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)基：是在：是在MEMMEM培養(yǎng)基的基礎上研制的，分為高糖培養(yǎng)基的基礎上研制的，分為

30、高糖型和低糖型。高糖型有利于細胞貼壁。型和低糖型。高糖型有利于細胞貼壁。IMDMIMDM培養(yǎng)基培養(yǎng)基：是對：是對DMEMDMEM的改良，有的改良，有4242種成分，增加氨基酸種成分，增加氨基酸和維生素，并有和維生素，并有HEPESHEPES，適合于培養(yǎng)低密度，生長困難細，適合于培養(yǎng)低密度，生長困難細胞。胞。四抗菌素的使用：四抗菌素的使用：在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內常加適量抗菌素，在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細菌的生長。以抑制可能存在的細菌的生長。通常是青霉素和鏈霉素聯合使用。培養(yǎng)基內通常是青霉素和鏈霉素聯合使用。培養(yǎng)基內青霉素、最終使用濃度為每毫升青霉素、最終使用濃度

31、為每毫升100單位，單位，鏈霉素每毫升鏈霉素每毫升100微克。微克。慶大霉素：每毫升慶大霉素：每毫升100單位，使用方便、廣單位，使用方便、廣譜、穩(wěn)定。譜、穩(wěn)定。五. . pHpH調整液1.碳酸氫鈉 :每升培養(yǎng)液中必需加2克,以保 證培養(yǎng)基在5%CO2環(huán)境下pH穩(wěn)定.2.HEPES:是一種弱酸,對細胞無毒性,當培 養(yǎng)基脫離5%CO2環(huán)境,能維持pH在 7左右,能配成100倍濃縮液,使用 時添加,終濃度在0.01-0.05mol/L.合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基 8095血清血清 520碳酸氫鈉碳酸氫鈉 2.0 g/L青、鏈霉素青、鏈霉素 100u（或或ug）/ml六六完全培養(yǎng)基的組成完全培養(yǎng)基的組成細

32、胞傳代方法細胞傳代方法懸浮懸浮生長細胞傳代生長細胞傳代 離心法離心法傳代：離心（傳代：離心（1000轉轉/分分）去上清，沉）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。 直接直接傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶壁時，將上清傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除培養(yǎng)液去除 l/22/3，然后用吸管直接吹打形成，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。細胞懸液再傳代。 半懸浮生長細胞傳代半懸浮生長細胞傳代（Hela細胞）細胞） 此此類細胞部分呈現貼壁生長現象，但貼壁不類細胞部分呈現貼壁生長現象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細胞從瓶壁脫落下來，進牢，可用直接吹打法使細胞從瓶壁脫落

33、下來，進行傳代。行傳代。貼壁生長細胞傳代貼壁生長細胞傳代 采用采用酶消化法傳代。常用的消化液有酶消化法傳代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液的胰蛋白酶液貼壁生長細胞傳代方法：貼壁生長細胞傳代方法：1 吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液2 加入加入12 ml 0.25的胰蛋白酶液的胰蛋白酶液(以消化液能以消化液能覆蓋整個瓶底為準）覆蓋整個瓶底為準） 靜靜置置210 分鐘（顯微分鐘（顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測）。鏡下動態(tài)監(jiān)測）。3 吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液。吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液。4 用吸管吸取瓶內培養(yǎng)液，反復吹打瓶壁細胞，用吸管吸取瓶內培養(yǎng)液，反復吹打瓶壁細胞，形成細胞懸液。形成細胞懸液。5

34、 吸取吸取1/21/4細胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內。細胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內。6 加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細胞懸液的新培加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細胞懸液的新培養(yǎng)瓶內。養(yǎng)瓶內。7 將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細細 胞胞 計計 數數 培養(yǎng)細胞活力測定培養(yǎng)細胞活力測定細胞活力測定是腫瘤體外研究中應用最廣的技細胞活力測定是腫瘤體外研究中應用最廣的技術手段之一。術手段之一。任何培養(yǎng)瓶內生長的細胞都由死細胞和活細胞任何培養(yǎng)瓶內生長的細胞都由死細胞和活細胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細胞是困難的。組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細胞是困難的。 1 細胞克隆形成率實驗細胞克隆形成率實驗 單個單個細

35、胞在體外增殖細胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細代以上，其后代所組成的細胞群形成肉眼可見的克?。ò盒纬扇庋劭梢姷目寺。?0個細胞以上）。克隆形個細胞以上）。克隆形成率用來表示細胞的增殖能力成率用來表示細胞的增殖能力 克隆克隆形成率比克隆形成數接種細胞形成率比克隆形成數接種細胞數數100% 缺點：操作繁瑣缺點：操作繁瑣 優(yōu)點：精確、可靠優(yōu)點：精確、可靠2 2、臺、臺 盼盼 藍藍 法法活細胞不被染色，死細胞染成藍色，用活細活細胞不被染色，死細胞染成藍色，用活細胞占細胞中的百分比表示細胞恬力胞占細胞中的百分比表示細胞恬力 優(yōu)點：比較實用優(yōu)點：比較實用 缺點：精確度不夠缺點：精確度不夠3 3 四

36、唑鹽（四唑鹽（MTTMTT）比色法）比色法四唑鹽（四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍）商品名為噻唑藍四唑鹽比色法的原理：活細胞中線粒體脫氫酶四唑鹽比色法的原理：活細胞中線粒體脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍紫色產物能將四唑鹽還原成不溶干水的藍紫色產物（formazan)，并沉淀在細胞中，而死細胞沒，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜（有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積）能溶解沉積在細胞中藍紫色結晶物，溶液顏色深淺與所含在細胞中藍紫色結晶物，溶液顏色深淺與所含的的formazan量成正比。再用酶標儀測定量成正比。再用酶標儀測定OD值值MTT法簡單快速、準確，廣泛應用于新藥篩選、

37、法簡單快速、準確，廣泛應用于新藥篩選、細胞毒細胞毒性性試驗試驗、腫瘤放射敏感性實驗等。、腫瘤放射敏感性實驗等。操作步驟操作步驟（1 1）單細胞懸液接種于）單細胞懸液接種于9696孔培養(yǎng)板；孔培養(yǎng)板；2-32-3萬細胞萬細胞/ /孔，每孔培養(yǎng)基總量孔，每孔培養(yǎng)基總量100ul100ul（9696孔培養(yǎng)板每孔培養(yǎng)板每孔容積孔容積370370微升），微升），3737、5 5COCO2 2培養(yǎng)箱中培培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間（根據實驗目的決定培養(yǎng)時間）養(yǎng)一段時間（根據實驗目的決定培養(yǎng)時間）（2 2）加入）加入5mg5mg毫升的毫升的MTTMTT液（液（20ul20ul孔）；繼孔）；繼續(xù)培養(yǎng)續(xù)培養(yǎng)4 4小時。

38、小時。（3 3）吸出孔內培養(yǎng)液后，加入）吸出孔內培養(yǎng)液后，加入DMSODMSO液（液（150ul150ul孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩1010分鐘，使結晶物溶解。分鐘，使結晶物溶解。（4 4）酶標儀檢測各孔）酶標儀檢測各孔ODOD值（檢測波長為值（檢測波長為570 570 nmnm）。記錄結果，繪制細胞生長曲線）。記錄結果，繪制細胞生長曲線細胞凍存和復蘇細胞凍存和復蘇 細胞低溫冷凍貯存是細胞室的常規(guī)工作。細胞凍存與細胞傳代保存相比可以減少人力、經費，減少污染，減少細胞生物學特性變化。凍存和復蘇的原則：慢凍快融凍存和復蘇的原則：慢凍快融當細胞冷到零度以

39、下，可以產生以下變化：細胞器脫水，細當細胞冷到零度以下，可以產生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質濃度升高，并在細胞內形成冰晶。胞中可溶性物質濃度升高，并在細胞內形成冰晶。 如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內不致產生大的冰如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內不致產生大的冰晶；相反結晶就大，大結晶會造成細胞膜、細胞器的損傷晶；相反結晶就大，大結晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。和破裂。復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶。重結晶。慢慢 凍凍 程程 序序標準程序：標準程序： 當溫度在當溫度在-25 -25 以上時，以上時， 1 12 /min2 /min 當溫度達當溫度達-25 -25 以下時，以下時， 5 510 /min10 /min 當溫度達當溫度達-100-100時，可迅速放入液氮中時，可迅速放入液氮中細胞凍存器細胞凍存器簡易程序簡易程序： 將凍存管置將凍存管置4 4冷藏室冷藏室2 2小時，小時， 移置移置-20-20 冷凍室冷