基因工程第七章 DNA定點誘變

1、第七章 DNA定點誘變site-directed mutagenesis of cloned DNA定點誘變隨機誘變(molecular evolution) 易錯PCR(erro-prone PCR) DNA重排(DNA shuffing)體外隨機引發(fā)重組(random-priming in vitro recombination)交錯延伸(stagger extension process，StEP)突變方式突變類型單個堿基的置換 (base substitution)簡單的插入或缺失 (insertion or deletion)系統(tǒng)的缺失、插入或成串堿基的置換第一節(jié) 寡核苷酸介導的誘變

2、oligonucleotide-mediated mutagenesis 70年代初 174 DNA(ss DNA 5386bp), 當用帶琥珀突變的 ss DNA與變性的野生型DNA片段一起轉染細菌時, 觀察到“標記獲救”現(xiàn)象,即產(chǎn)生帶野生型基因組的噬菌體野生型DNA片段突變體174 DNA+退火異源雙鏈體宿主編碼的錯配修復系統(tǒng)全長的野生型基因組可利用突變的DNA片段將突變引入到野生型DNA中M. Smith1993年諾貝爾化學獎加拿大生物化學家 1932年出生于英國，畢業(yè)于英國曼徹斯特大學，1956年移居加拿大?，F(xiàn)任加拿大溫哥哥華大不列顛哥倫比亞大學生物技術實驗室主任。 1978年發(fā)明了寡

3、聚核苷酸定點誘變技術。利用寡聚核苷酸定點誘變技術，可以人為地通過基因的改變來修飾、改造某一已知的蛋白質，從而可以研究蛋白質的結構及其與功能的關系、蛋白質分子之間的相互作用。一、Kunkel 法 或稱“U”法 dut- dUTP酶(dUTPase)缺陷，細胞不能把dUTP轉化為dUMP, 因此細胞內dUTP的含量大為增加，其中一些 dUTP可摻入DNA中正常情況下由胸苷嘧啶占據(jù)的位置一、Kunkel 法 或稱“U”法1背景知識 dut- dUTP酶(dUTPase)缺陷，細胞不能把dUTP轉化為dUMP, 因此細胞內dUTP的含量大為增加，其中一些 dUTP可摻入DNA中正常情況下由胸苷嘧啶占據(jù)

4、的位置一、Kunkel 法 或稱“U”法ung- UDG酶缺陷, UDG酶尿嘧啶(uracil) -N-糖基化酶(glycosylase)可除去摻入DNA中的尿嘧啶殘基1背景知識E.coli (dut- / ung- ) 合成的 DNA含有尿嘧啶，M13噬菌體DNA中將含有20-30個尿嘧啶堿基E.coli CJ236 dut, ung, thi, relA; pCJ105(Cmr) pCJ105 is a F plasmid ss DNA 制備載體ss DNA 制備載體單鏈噬菌體載體 phagemid載體UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUInsert target DNA轉化 E.co

5、li CJ236M13K07感染Isolate phagemid ss DNA與突變寡核苷酸退火T4 DNA polymeraseDNA ligase轉化MV1190 (dut+/ung+)2原理原理只有突變鏈能復制2原理原理2原理原理Insert target DNA2原理原理UUUUUInsert target DNA轉化 E.coli CJ2362原理原理UUUUUUUUUUInsert target DNA轉化 E.coli CJ236M13K07感染2原理原理UUUUUUUUUUInsert target DNA轉化 E.coli CJ236M13K07感染Isolate phage

6、mid ss DNA與突變寡核苷酸退火2原理原理UUUUUUUUUUUUUUUInsert target DNA轉化 E.coli CJ236M13K07感染Isolate phagemid ss DNA與突變寡核苷酸退火2原理原理UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUInsert target DNA轉化 E.coli CJ236M13K07感染Isolate phagemid ss DNA與突變寡核苷酸退火T4 DNA polymeraseDNA ligase2原理原理UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUInsert target DNA轉化 E.coli CJ236M13K07感染

7、Isolate phagemid ss DNA與突變寡核苷酸退火T4 DNA polymeraseDNA ligase轉化E.coli MV1190 (dut+/ung+)2原理原理UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUInsert target DNA轉化 E.coli CJ236M13K07感染Isolate phagemid ss DNA與突變寡核苷酸退火T4 DNA polymeraseDNA ligase2原理原理只有突變鏈能復制轉化E.coli MV1190 (dut+/ung+)UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUInsert target DNA轉化 E.coli CJ2

8、36M13K07感染Isolate phagemid ss DNA與突變寡核苷酸退火T4 DNA polymeraseDNA ligase2原理原理只有突變鏈能復制轉化E.coli MV1190 (dut+/ung+)(1) DNA polymerase T4 T7 Klenow 65% 11/13 36% 突變率 (84.6%) 3. 酶(1) DNA polymerase T4 T7 Klenow (可能會替換引物) 65% 11/13 36% 突變率 (84.6%) 3. 酶(1) DNA polymerase T4 T7 Klenow (可能會替換引物) 65% 11/13 36% 突

9、變率 (84.6%) (2) ligase 3U/13l 可有可無，有則效率高 3. 酶(1) DNA polymerase T4 T7 Klenow (可能會替換引物) 65% 11/13 36% 突變率 (84.6%) (2) ligase 3U/13l 可有可無，有則效率高 (3) T4 gene 32 protein 提高含二級結構的ssDNA的突變率3. 酶4. primers要求5端磷酸化 引物的終極條件：與靶DNA正確配對特異性地與靶DNA序列退火 A. 單核苷酸置換插入 or 缺失5端完全配對，使得上游(引物)起始的DNA合成不容易將誘變寡核苷酸取代，約需8-10bp3端所形成

10、的雜交體足以引導DNA合成。如果錯配核苷酸太靠近3端，3端將不能形成穩(wěn)定的雜交體，易被外切活性降解。所以3端需有7-9bp完全配對;為便于篩選，應選用可形成穩(wěn)定雜交體而長度最短的誘變寡核苷酸。一般17-19bp, 錯配在中央，使得完全配對的雜交體與錯配雜交體之間的熱穩(wěn)定性差異足夠大。 B. 多處缺失或變換2個bp以上的oligo 兩側需12-15bp 側翼雙鏈區(qū)的Tm應約為35-40 Tm=4(G+C)+2(A+T) =36 ( 3 each)突變區(qū)域大, 效率越低(兩側形成穩(wěn)定雜交體的能力是突變區(qū)長度的函數(shù) 越低）5. 模板/結果 靶DNA盡可能短，應測序確定其突變 二、二、Altered

11、Sites II in vitro mutagenesis system位點選擇定點誘變法 三、三、Transformer Site-Directed mutagenesis轉化子誘變法 Synthesize second strandDigest DNA (primary digestion)Transform E.coli mutS to propagate plasmidsIsolate and digest (Second digestion)Transform E.coliIsolate DNA四 、 PCR定點誘變1同源重組法2DpnI法3.重疊延伸 Overlap extensi

12、on對于兩個具有部分重疊序列的DNA片段，在經(jīng)過變性和復性后，兩個DNA片段之間通過同源序列形成部分雜合的雙鏈，在DNA聚合酶作用下，雜合雙鏈可互為引物和模板，引導DNA的合成，從而形成雜合DNA雙鏈五、SOE 重疊延伸剪接術 Splicing by overlap extension可用于將兩個 DNA片段在所期望的位點進行連接 設計一個寡聚體引物，其序列包含兩個部分，“引發(fā)”和“重疊”部分，引發(fā)部分在3末端，起引物作用；重疊部分在5末端，與待融合的DNA片段序列互補。 設計另一個引物，該引物與上一個引物完全互補ATGATGATGATGATGATGEcoRIBamHIBamHIATGEcoR

13、IATGBamHIATGEcoRIPCRPCR重疊延伸PCR第二節(jié) 嵌套缺失第二節(jié) 嵌套缺失1. 外切核酸酶III的消化Exonuclease III5353532. BAL 31的消化 主要活性為3外切核酸酶活性，可從線性DNA兩條鏈的3端去掉除單核苷酸， 還是一個內切核酸 (單鏈，nick, gap) 依賴 Ca+ EGTA可抑制活性AABA digestionvectorinsertBAL 31B digestionDeleted inserts cloned to plasmid vector3. DNase I 的消化內切酶，可優(yōu)先嘧啶核苷酸水解 ds or ss DNAMg2+:

14、獨立作用于每條DNA鏈，位點隨機Mn2+: 大致在同一位置切割dsDNA 產(chǎn)生平端 或1-2個核苷酸突出ccc DNADNase I, Mn+ (low concentration)A digestionKlenow re-ligationEcoRIHindIIIStyIStyIScaIClaIHindIIISalIFspIClaIFspIKpnIEcoRI 1 660 950 1850 2100 2260 2700 3400 3430 3800 6000 6600 22306.6kbpR-1600 (1.6kb)pR-2260 (2.26kb)pR-2450 (2.45kb)pR-2570 (2.57kb)pR-2700 (2.7kb)pR-3300 (3.3kb)pR-3400 (3.4kb)pR-3740 (3.74kb)pD