第六章免疫比濁分析

1、第六章免疫比濁分析第六章免疫比濁分析第1頁，共45頁。v 免疫比濁分析是將液相內(nèi)的沉淀反應(yīng)免疫比濁分析是將液相內(nèi)的沉淀反應(yīng)與現(xiàn)代光學(xué)儀器和自動分析技術(shù)相結(jié)合的與現(xiàn)代光學(xué)儀器和自動分析技術(shù)相結(jié)合的一項分析技術(shù)。一項分析技術(shù)。第2頁，共45頁。第二節(jié)第二節(jié) 自動化免疫比濁分析自動化免疫比濁分析 第一節(jié)第一節(jié) 免疫比濁的原理免疫比濁的原理 一、透射免疫比濁法一、透射免疫比濁法 二、散射免疫比濁法二、散射免疫比濁法 三、免疫膠乳比濁法三、免疫膠乳比濁法 四、免疫比濁分析的影響因素和臨床四、免疫比濁分析的影響因素和臨床應(yīng)用應(yīng)用第3頁，共45頁。第一節(jié)第一節(jié) 免疫濁度分析原理免疫濁度分析原理 抗原、抗體在

2、特定的電解質(zhì)溶液中反應(yīng)，形成小分子免抗原、抗體在特定的電解質(zhì)溶液中反應(yīng)，形成小分子免疫復(fù)合物（疫復(fù)合物（19S19S19S），使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。這種），使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。這種濁度可用儀器檢測，用吸光度表示。濁度可用儀器檢測，用吸光度表示。第4頁，共45頁。第一節(jié)第一節(jié) 免疫濁度分析原理免疫濁度分析原理 在抗體稍微過量且固定的情況下，形成的免疫復(fù)合物在抗體稍微過量且固定的情況下，形成的免疫復(fù)合物量隨抗原量的增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增大，即量隨抗原量的增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增大，即待測抗原量與反應(yīng)溶液的濁度呈正相關(guān)。待測抗原量與反應(yīng)溶液的濁度呈正相關(guān)。 第5頁，共45頁。免疫比濁技術(shù)

3、分類：免疫比濁技術(shù)分類：透射免疫比濁法透射免疫比濁法（turbidimetric immunoassay）散射免疫比濁法散射免疫比濁法（nephelometry immunoassay）速率散射比濁法速率散射比濁法終點散射比濁法終點散射比濁法第6頁，共45頁。第7頁，共45頁。 一定波長的入射光線通過抗原抗體反應(yīng)后的溶液時一定波長的入射光線通過抗原抗體反應(yīng)后的溶液時，由于，由于溶液溶液中的免疫復(fù)合物微粒對光線的吸收、反射和中的免疫復(fù)合物微粒對光線的吸收、反射和折射而使透射光減少，可用折射而使透射光減少，可用吸光度表示吸光度表示。 在一定范圍內(nèi)，吸光度與免疫復(fù)合物量呈正相關(guān)，而形成在一定范圍內(nèi)，

4、吸光度與免疫復(fù)合物量呈正相關(guān)，而形成的免疫復(fù)合物量與參與反應(yīng)的抗原和抗體的量呈函數(shù)關(guān)系。的免疫復(fù)合物量與參與反應(yīng)的抗原和抗體的量呈函數(shù)關(guān)系。一、免疫透射比濁法一、免疫透射比濁法（一）原理：（一）原理：第8頁，共45頁。抗原抗體反應(yīng)曲線抗原抗體反應(yīng)曲線第9頁，共45頁。 1. 1.將待檢標(biāo)本和抗原參考品作適當(dāng)稀釋。將待檢標(biāo)本和抗原參考品作適當(dāng)稀釋。（二）操作方法（二）操作方法 2. 2.將待測標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液（將待測標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液（5 5個濃度抗原標(biāo)準(zhǔn)品）與個濃度抗原標(biāo)準(zhǔn)品）與適當(dāng)過量的抗血清混合，在一定條件下，抗原抗體反應(yīng)完適當(dāng)過量的抗血清混合，在一定條件下，抗原抗體反應(yīng)完成后，在成后，

5、在340nm340nm處測定各管吸光度。處測定各管吸光度。 3.按按log-logit轉(zhuǎn)換或轉(zhuǎn)換或y=ax3+bx2+cx+d方程進行曲線擬合，制方程進行曲線擬合，制備劑量備劑量-反應(yīng)曲線，由計算機處理，計算出抗原濃度。反應(yīng)曲線，由計算機處理，計算出抗原濃度。第10頁，共45頁。 待測的抗原抗體復(fù)合物分子量足夠大。待測的抗原抗體復(fù)合物分子量足夠大。 抗原抗體復(fù)合物數(shù)量足夠多?？乖贵w復(fù)合物數(shù)量足夠多。 具有充分的反應(yīng)時間，只能測定抗原抗具有充分的反應(yīng)時間，只能測定抗原抗體反應(yīng)的第二階段。體反應(yīng)的第二階段。 高親和力的抗體，并保證抗體過量。高親和力的抗體，并保證抗體過量。（三）技術(shù)要求（三）技術(shù)

6、要求 第11頁，共45頁。（四）方法評價（四）方法評價 優(yōu)點優(yōu)點: : 靈敏度高，穩(wěn)定性好，操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確靈敏度高，穩(wěn)定性好，操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確 不足不足: : 抗體用量較大；抗體用量較大； 溶液中存在的抗原抗體復(fù)合物分子應(yīng)足夠大溶液中存在的抗原抗體復(fù)合物分子應(yīng)足夠大 透射比濁測定在抗原抗體反應(yīng)的第二階段，檢透射比濁測定在抗原抗體反應(yīng)的第二階段，檢 測需在抗原抗體反應(yīng)達到平衡后進行，耗時較長。測需在抗原抗體反應(yīng)達到平衡后進行，耗時較長。 第12頁，共45頁。 粒子對光線的散射作用是溶液中的微粒子受到光線粒子對光線的散射作用是溶液中的微粒子受到光線照射后，微粒子對光線產(chǎn)生反射和折射而形成散射

7、光。照射后，微粒子對光線產(chǎn)生反射和折射而形成散射光。 懸浮微粒對光散射形成的散射光強度與微粒的大小、懸浮微粒對光散射形成的散射光強度與微粒的大小、數(shù)量、入射光的波長和強度、測量角度等因素密切相關(guān)數(shù)量、入射光的波長和強度、測量角度等因素密切相關(guān)。二、免疫散射比濁法二、免疫散射比濁法( (一一) ) 原理原理第13頁，共45頁。 不同大小的微粒形成的散射光分布不同。不同大小的微粒形成的散射光分布不同。 當(dāng)微粒直徑小于入射光的波長的十分之一時，當(dāng)微粒直徑小于入射光的波長的十分之一時，散射光的強度在各個方向的分布均勻一致散射光的強度在各個方向的分布均勻一致，稱，稱RayleighaeRayleigha

8、e散射。散射。 當(dāng)微粒直徑大于或等于入射光的波長時，前向散射光當(dāng)微粒直徑大于或等于入射光的波長時，前向散射光遠遠強于后向散射光遠遠強于后向散射光，稱，稱MileMile散射。散射。第14頁，共45頁。第15頁，共45頁。 其中光線偏轉(zhuǎn)的角度與發(fā)射光的波長和抗原抗體其中光線偏轉(zhuǎn)的角度與發(fā)射光的波長和抗原抗體復(fù)合物的大小和多少密切相關(guān)。復(fù)合物的大小和多少密切相關(guān)。 當(dāng)固定檢測角度與發(fā)射光的波長時，散射光的強度當(dāng)固定檢測角度與發(fā)射光的波長時，散射光的強度與復(fù)合物的含量成與復(fù)合物的含量成正比正比，即待測的抗原越多，形成，即待測的抗原越多，形成的復(fù)合物越多，散射光就越強。的復(fù)合物越多，散射光就越強。第1

9、6頁，共45頁。 應(yīng)選擇應(yīng)選擇適當(dāng)適當(dāng)?shù)墓庠磸姸取⒎磻?yīng)時間、測量角度及的光源強度、反應(yīng)時間、測量角度及光源的波長。光源的波長。 另外，要注意保證抗原濃度合適。另外，要注意保證抗原濃度合適。 此外，還要選擇適宜的離子強度、此外，還要選擇適宜的離子強度、pHpH值等。值等。( (二二) ) 技術(shù)要求技術(shù)要求第17頁，共45頁。 速率散射比濁法是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的一速率散射比濁法是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的一種動態(tài)測定方種動態(tài)測定方法。法。 所謂速率是指抗原抗體反應(yīng)在單位時間內(nèi)形成免疫復(fù)合所謂速率是指抗原抗體反應(yīng)在單位時間內(nèi)形成免疫復(fù)合物的量（不是免疫復(fù)合物累積的量），連續(xù)測定各時間復(fù)合物的量（不是免疫復(fù)合

10、物累積的量），連續(xù)測定各時間復(fù)合物形成的速率與其產(chǎn)生的散射光信號聯(lián)系在一起，形成動態(tài)物形成的速率與其產(chǎn)生的散射光信號聯(lián)系在一起，形成動態(tài)的速率散射比濁法，每項檢測僅的速率散射比濁法，每項檢測僅12min即可完成。即可完成。 ( (三三) )速率散射比濁法速率散射比濁法（rate nephelometry）第18頁，共45頁。累計時間復(fù)合物產(chǎn)生總量產(chǎn)生速率510152025303540455055608132560150230300360415450480500512359080706055453020 抗原抗體復(fù)合物形成時間與速率的關(guān)系抗原抗體復(fù)合物形成時間與速率的關(guān)系第19頁，共45頁。 當(dāng)

11、抗體的濃度固定于一定范圍時，當(dāng)抗體的濃度固定于一定范圍時，復(fù)合物形成的復(fù)合物形成的速率峰值的高低與抗原的含量成正比，隨著時間的延長，速率峰值的高低與抗原的含量成正比，隨著時間的延長，免疫復(fù)合物的量逐漸增免疫復(fù)合物的量逐漸增多，抗原抗體結(jié)合速度的峰值多，抗原抗體結(jié)合速度的峰值在一定的時間出現(xiàn)。通過微機處理即可得到待測蛋白在一定的時間出現(xiàn)。通過微機處理即可得到待測蛋白成份的含量。成份的含量。第20頁，共45頁。第21頁，共45頁。 速率散射比濁法速率散射比濁法峰值出現(xiàn)的時間峰值出現(xiàn)的時間與抗體濃度及純與抗體濃度及純度直接相關(guān)，需選用抗體純度及親和力交高的試劑。度直接相關(guān)，需選用抗體純度及親和力交高

12、的試劑。 此外，要保證待測樣本血清的性狀符合要求，此外，要保證待測樣本血清的性狀符合要求，如嚴重脂血等即為不合格樣本。如嚴重脂血等即為不合格樣本。技術(shù)要求技術(shù)要求第22頁，共45頁。( (三三) )方法評價方法評價 散射比濁法是目前臨床應(yīng)用較多的一種方法，本法自散射比濁法是目前臨床應(yīng)用較多的一種方法，本法自動化程度高，具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、精密等優(yōu)點。動化程度高，具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、精密等優(yōu)點。采用抗原過量檢測方法，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。但儀采用抗原過量檢測方法，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。但儀器和試劑價格比較貴器和試劑價格比較貴, 對抗體的質(zhì)量要求很高。對抗體的質(zhì)量要求很高。第23頁，共45頁。 用

13、抗體致敏的大小適中、均勻一致的膠乳顆粒用抗體致敏的大小適中、均勻一致的膠乳顆粒（一般為（一般為0.2 m），），在遇到相應(yīng)抗原時，膠乳顆粒上在遇到相應(yīng)抗原時，膠乳顆粒上的抗體與抗原特異結(jié)合，引起膠乳顆粒凝聚的抗體與抗原特異結(jié)合，引起膠乳顆粒凝聚 ，使透射，使透射光和散射光即出現(xiàn)顯著變化。光和散射光即出現(xiàn)顯著變化。三、免疫膠乳比濁法三、免疫膠乳比濁法（一）（一）原理：原理：第24頁，共45頁。三、免疫膠乳比濁法三、免疫膠乳比濁法（一）（一）原理：原理：第25頁，共45頁。第二節(jié)第二節(jié) 自動化免疫比濁分析自動化免疫比濁分析第26頁，共45頁。（一）（一）BNBN特種蛋白分析測定系統(tǒng)特種蛋白分析測定

14、系統(tǒng) 該系統(tǒng)的測定方法是透射免疫比濁法的一該系統(tǒng)的測定方法是透射免疫比濁法的一種改良。以發(fā)光二極管作為光源，檢測前向角種改良。以發(fā)光二極管作為光源，檢測前向角13132424度的散射光，然后利用硅化光電二極管接收度的散射光，然后利用硅化光電二極管接收散射光信號，經(jīng)過微電腦處理，與標(biāo)準(zhǔn)曲線進行散射光信號，經(jīng)過微電腦處理，與標(biāo)準(zhǔn)曲線進行比較，最后轉(zhuǎn)換成待檢物質(zhì)的濃度。比較，最后轉(zhuǎn)換成待檢物質(zhì)的濃度。一、主流免疫比濁設(shè)備概況一、主流免疫比濁設(shè)備概況1.測定原理測定原理第27頁，共45頁。 系統(tǒng)由分析儀、計算機、條碼讀取器、打印機系統(tǒng)由分析儀、計算機、條碼讀取器、打印機四部分組成，其中四部分組成，其中

15、分析儀分析儀是主要組成部分，包括散是主要組成部分，包括散射測濁儀、自動加樣系統(tǒng)、運輸裝置和比色杯裝射測濁儀、自動加樣系統(tǒng)、運輸裝置和比色杯裝置。置。 2.儀器基本組成儀器基本組成第28頁，共45頁。BNBN、BN100特種蛋白分析分析系統(tǒng)特種蛋白分析分析系統(tǒng)第29頁，共45頁。本系統(tǒng)屬于速率散射比濁分析法，在抗體過量的前提下本系統(tǒng)屬于速率散射比濁分析法，在抗體過量的前提下，光束通過抗原抗體復(fù)合物時所產(chǎn)生的散射光速率變化，光束通過抗原抗體復(fù)合物時所產(chǎn)生的散射光速率變化大小與抗原濃度成正比。大小與抗原濃度成正比。 速率的峰值通過電腦處理系統(tǒng)轉(zhuǎn)換成待測抗原的濃度速率的峰值通過電腦處理系統(tǒng)轉(zhuǎn)換成待測抗

16、原的濃度。1.測定原理測定原理（二）（二）ARRAYARRAY分析系統(tǒng)分析系統(tǒng)第30頁，共45頁。 ARRAY ARRAY系統(tǒng)由分析儀、電腦處理系統(tǒng)、打印機構(gòu)成，系統(tǒng)由分析儀、電腦處理系統(tǒng)、打印機構(gòu)成，其主要構(gòu)成部分為分析儀，由加液系統(tǒng)、散射測濁其主要構(gòu)成部分為分析儀，由加液系統(tǒng)、散射測濁儀、儀、4040孔樣本轉(zhuǎn)盤、孔樣本轉(zhuǎn)盤、2020孔試劑轉(zhuǎn)盤、軟盤驅(qū)動器等孔試劑轉(zhuǎn)盤、軟盤驅(qū)動器等組成。組成。2.儀器基本組成儀器基本組成第31頁，共45頁。Array360Array360、IMMAGEIMMAGE特種蛋白分析分析系統(tǒng)特種蛋白分析分析系統(tǒng)第32頁，共45頁。二、免疫比濁分析的主要影響因素二、免

17、疫比濁分析的主要影響因素1 1抗原抗體比例抗原抗體比例 抗原抗體比例要適當(dāng)。抗原抗體比例要適當(dāng)。2 2抗體的純度與效價抗體的純度與效價 診斷試劑應(yīng)盡可能選擇診斷試劑應(yīng)盡可能選擇高純度與高效價的抗體。高純度與高效價的抗體。3 3免疫復(fù)合物的大小及穩(wěn)定性免疫復(fù)合物的大小及穩(wěn)定性 溶液中免疫復(fù)溶液中免疫復(fù)合物顆粒的分散度盡可能相同，顆粒應(yīng)該不容易合物顆粒的分散度盡可能相同，顆粒應(yīng)該不容易相互聚集。相互聚集。第33頁，共45頁。4 4增聚劑增聚劑 利用增聚劑破壞抗原抗體的水化層，促進利用增聚劑破壞抗原抗體的水化層，促進反應(yīng)的進行。反應(yīng)的進行。5. 5. 離子強度離子強度 PBSPBS是較好的反應(yīng)液是較

18、好的反應(yīng)液 。 返回章目錄返回章目錄第34頁，共45頁?？乖^量檢測抗原過量檢測 (1) 抗體適當(dāng)過量抗體適當(dāng)過量 (2) 對抗原過量進行閾值限定對抗原過量進行閾值限定 第35頁，共45頁。第36頁，共45頁。 免疫比濁分析法主要用于特定蛋白系列檢測。如免疫球免疫比濁分析法主要用于特定蛋白系列檢測。如免疫球蛋白蛋白IgG、IgA、IgM、鏈、鏈、鏈、免疫球蛋白亞類；補體鏈、免疫球蛋白亞類；補體C3、C4；血漿蛋白如前白蛋白；血漿蛋白如前白蛋白(PAB)、白蛋白、白蛋白(ALB)、1-抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶(1-AT)、2-微球蛋白微球蛋白(2-MG)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF)、銅藍蛋白、銅藍

19、蛋白(CER)、結(jié)合珠蛋白、結(jié)合珠蛋白(HP)、，、，C-反應(yīng)蛋白反應(yīng)蛋白(CRP)、載脂蛋白、載脂蛋白ApoAI、ApoB、脂蛋白、脂蛋白(a)、類風(fēng)濕因子、類風(fēng)濕因子(RF)、尿微量蛋白系列、尿微量蛋白系列和某些治療性藥物濃度等。和某些治療性藥物濃度等。 三、臨床應(yīng)用三、臨床應(yīng)用第37頁，共45頁。小小 結(jié)結(jié) 經(jīng)典的免疫沉淀反應(yīng)通常是在抗原抗體反應(yīng)經(jīng)典的免疫沉淀反應(yīng)通常是在抗原抗體反應(yīng)的終點進行結(jié)果判斷，存在操作繁瑣、費時、敏的終點進行結(jié)果判斷，存在操作繁瑣、費時、敏感度低及難以自動化等缺陷。自動化免疫比濁分感度低及難以自動化等缺陷。自動化免疫比濁分析儀器的問世解決了以上的諸多問題。析儀器

20、的問世解決了以上的諸多問題。第38頁，共45頁。 目前，透射免疫比濁法和散射免疫比濁等方法已常規(guī)目前，透射免疫比濁法和散射免疫比濁等方法已常規(guī)運用于臨床特定體液蛋白質(zhì)的檢測，相關(guān)儀器已廣泛應(yīng)運用于臨床特定體液蛋白質(zhì)的檢測，相關(guān)儀器已廣泛應(yīng)用于國內(nèi)各級醫(yī)院，成為臨床免疫檢測的重要手段之一。用于國內(nèi)各級醫(yī)院，成為臨床免疫檢測的重要手段之一。返回章目錄返回章目錄第39頁，共45頁。思考題 1.名詞解釋：透射免疫比濁法、散射免疫比濁法 2.免疫比濁分析的基本原理是什么？有哪些類型？ 3.簡述免疫比濁分析的主要影響因素。第40頁，共45頁。一、選擇題一、選擇題 1.1.速率散射比濁法之所以能比傳統(tǒng)的沉淀

21、反應(yīng)試驗速率散射比濁法之所以能比傳統(tǒng)的沉淀反應(yīng)試驗大大地縮短時間，主要是因為大大地縮短時間，主要是因為 A.A.在抗原抗體反應(yīng)的第一階段判定結(jié)果在抗原抗體反應(yīng)的第一階段判定結(jié)果 B.B.不需復(fù)雜的儀器設(shè)備不需復(fù)雜的儀器設(shè)備 C.C.使用低濃度的瓊脂或瓊脂糖使用低濃度的瓊脂或瓊脂糖 D.D.反應(yīng)的敏感度高反應(yīng)的敏感度高第41頁，共45頁。2.2.透射免疫比濁法透射免疫比濁法A.A.測定光線通過反應(yīng)混合液時，被其中測定光線通過反應(yīng)混合液時，被其中ICIC反射的光的強度反射的光的強度B.B.測定光線通過反應(yīng)混合液時，被其中測定光線通過反應(yīng)混合液時，被其中ICIC折射的光的強度折射的光的強度C.C.測

22、定光線通過反應(yīng)混合液時，被其中測定光線通過反應(yīng)混合液時，被其中ICIC吸收的光的強度吸收的光的強度 D.D.測定光線通過反應(yīng)混合液時，透過的光的強度測定光線通過反應(yīng)混合液時，透過的光的強度3.3.散射免疫比濁法檢測的原理散射免疫比濁法檢測的原理A.A.測定光線通過反應(yīng)混合液時，被其中測定光線通過反應(yīng)混合液時，被其中ICIC反射的光的強度反射的光的強度B.B.測定光線通過反應(yīng)混合液時，被其中測定光線通過反應(yīng)混合液時，被其中ICIC折射的光的強度折射的光的強度 C.C.測定光線通過反應(yīng)混合液時，被其中測定光線通過反應(yīng)混合液時，被其中ICIC吸收的光的強度吸收的光的強度D.D.測定光線通過反應(yīng)混合液時，透過的光的強度測定光線通過反應(yīng)混合液時，透過的光的強度第42頁，共45頁。 4.4.單向瓊脂擴散法可用于單向瓊脂擴散法可用于 A.A.抗體定性抗體定性 B. B.抗體定量抗體定量 C.C.抗原定性抗原定性 D. D.抗原定量抗原定量 5.5.雙向瓊脂擴散試驗，兩種受檢抗原的性質(zhì)完全雙向瓊脂擴散試驗，兩種受