氨基酸的定量測定

1、氨基酸的定量測定一、氨基酸的一般定量測定一、氨基酸的一般定量測定1、甲醛滴定法2、電位滴定法3、茚三酮比色法4、非水溶液滴定法5、鄰苯二甲醛法6、三硝基苯磺酸法7、乙酰丙酮法二、個別氨基酸的定量測定二、個別氨基酸的定量測定1、賴氨酸的測定2、色氨酸的測定3、苯丙氨酸的測定4、酪氨酸的測定5、脯氨酸的測定6、羥脯氨酸的測定7、胱氨酸的測定8、谷氨酸的測定一、氨基酸的一般定量測定一、氨基酸的一般定量測定1 1、甲醛滴定法、甲醛滴定法原理：氨基酸具有酸性的羧基（原理：氨基酸具有酸性的羧基（COOHCOOH）和堿性的氨基）和堿性的氨基（NH2NH2），它們相互作用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。當），它們相

2、互作用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。當加入甲醛溶液時，加入甲醛溶液時，NH2NH2與甲醛結(jié)合，從而使其堿性消失。與甲醛結(jié)合，從而使其堿性消失。這樣就可以用強堿標準溶液來滴定這樣就可以用強堿標準溶液來滴定COOHCOOH，并用間接的方，并用間接的方法測定氨基酸總量。法測定氨基酸總量。1 1、甲醛滴定法、甲醛滴定法特點：簡單易行、快速方便，與亞硝酸氮氣容量法分析結(jié)果相近特點：簡單易行、快速方便，與亞硝酸氮氣容量法分析結(jié)果相近 應(yīng)用：脯氨酸與甲醛作用時產(chǎn)生不穩(wěn)定的化合物，使結(jié)果偏低應(yīng)用：脯氨酸與甲醛作用時產(chǎn)生不穩(wěn)定的化合物，使結(jié)果偏低 酪氨酸含有酚羧基，滴定時也會消耗一些堿而致使結(jié)果偏高酪氨酸含有酚羧基

3、，滴定時也會消耗一些堿而致使結(jié)果偏高 溶液中若有銨存在也可與甲醛反應(yīng)，往往使結(jié)果偏高溶液中若有銨存在也可與甲醛反應(yīng)，往往使結(jié)果偏高試劑：試劑：40%40%中性甲醛溶液（以百里酚酞作指示劑，用氫氧化鈉溶液將中性甲醛溶液（以百里酚酞作指示劑，用氫氧化鈉溶液將 40% 40%甲醛中和至淡藍色）甲醛中和至淡藍色） 1g/L 1g/L百里酚酞乙醇溶液百里酚酞乙醇溶液 1g/L 1g/L中性紅中性紅50%50%乙醇溶液乙醇溶液 0.1mol/L 0.1mol/L氫氧化鈉標準溶液氫氧化鈉標準溶液 1 1、甲醛滴定法、甲醛滴定法操作方法：吸取含氨基酸操作方法：吸取含氨基酸2030mg2030mg的樣品溶液的樣

4、品溶液2 2份，分別置于份，分別置于250mL250mL錐形瓶中，各加錐形瓶中，各加50mL50mL蒸餾水，其中一份加入蒸餾水，其中一份加入3 3滴中性紅滴中性紅指示劑，用指示劑，用0.1mol/L0.1mol/L氫氧化鈉標準溶液滴定至由紅色變?yōu)殓鷼溲趸c標準溶液滴定至由紅色變?yōu)殓晟珵榻K點；另一份加入珀色為終點；另一份加入3 3滴百里酚酞指示劑及中性甲醛滴百里酚酞指示劑及中性甲醛20mL20mL，搖勻，靜置搖勻，靜置1min1min，用，用0.1mol/L0.1mol/L氫氧化鈉標準溶液滴定至淡藍氫氧化鈉標準溶液滴定至淡藍色為終點。分別記錄兩次所消耗的氫氧化鈉標準溶液體積。色為終點。分別記錄

5、兩次所消耗的氫氧化鈉標準溶液體積。1 1、甲醛滴定法、甲醛滴定法計算結(jié)果：計算結(jié)果： 氨基酸態(tài)氮含量氨基酸態(tài)氮含量= = 式中：式中：cc氫氧化鈉標準溶液的濃度，氫氧化鈉標準溶液的濃度，mol/Lmol/L V1 V1用中性紅作指示劑滴定時消耗氫氧化鈉標準溶液體積，用中性紅作指示劑滴定時消耗氫氧化鈉標準溶液體積，mLmL V2 V2用百里酚酞作指示劑滴定時消耗氫氧化鈉標準溶液體積，用百里酚酞作指示劑滴定時消耗氫氧化鈉標準溶液體積，mLmL m m測定用樣品溶液相當于樣品的質(zhì)量，測定用樣品溶液相當于樣品的質(zhì)量，g g 0.014 N2 0.014 N2毫摩爾質(zhì)量，毫摩爾質(zhì)量，g/mmolg/mm

6、ol%100014. 0)(12mcVV211 1、甲醛滴定法、甲醛滴定法注意事項：注意事項：此法適用于測定食品中的游離氨基酸此法適用于測定食品中的游離氨基酸固體樣品應(yīng)先進行粉碎，準確稱樣后用水萃取，然后測定萃取液；液固體樣品應(yīng)先進行粉碎，準確稱樣后用水萃取，然后測定萃取液；液體試樣如醬油、飲料等可直接吸取試樣進行測定。萃取可在體試樣如醬油、飲料等可直接吸取試樣進行測定。萃取可在5050水浴中水浴中進行進行0.5h0.5h即可。即可。若樣品顏色較深，可加適量活性炭脫色后再測定，或用電位滴定法進若樣品顏色較深，可加適量活性炭脫色后再測定，或用電位滴定法進行測定。行測定。與本法類似的還有單指示劑（

7、百里酚酞）甲醛滴定法，此法用標準堿與本法類似的還有單指示劑（百里酚酞）甲醛滴定法，此法用標準堿完全中和完全中和COOHCOOH時的時的pHpH為為8.59.58.59.5，但分析結(jié)果稍偏低，即雙指示劑法的，但分析結(jié)果稍偏低，即雙指示劑法的結(jié)果更準確。結(jié)果更準確。2 2、電位滴定法、電位滴定法原理原理: :根據(jù)氨基酸的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的堿性，使根據(jù)氨基酸的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，將酸度計的玻璃電極及甘汞電極同時插入被羧基顯示出酸性，將酸度計的玻璃電極及甘汞電極同時插入被測液中構(gòu)成原電池，用氫氧化鈉標準溶液滴定，依據(jù)酸度計指測液中構(gòu)成原電池，用氫氧化鈉標準

8、溶液滴定，依據(jù)酸度計指示的示的pHpH判斷滴定終點。判斷滴定終點。儀器：酸度計儀器：酸度計 磁力攪拌器磁力攪拌器 微量滴定管微量滴定管試劑：試劑：20%20%中性甲醛溶液中性甲醛溶液 0.05mol/L 0.05mol/L氫氧化鈉標準溶液氫氧化鈉標準溶液2 2、電位滴定法、電位滴定法操作方法：操作方法： 吸取含氨基酸約吸取含氨基酸約20mg20mg的樣品溶液于的樣品溶液于100mL100mL容量瓶中，加水至標線，容量瓶中，加水至標線，混勻后吸取混勻后吸取20.0mL20.0mL置于置于200mL200mL燒杯中，加水燒杯中，加水60mL60mL，開動磁力攪拌器，開動磁力攪拌器，用用0.05mo

9、l/L0.05mol/L氫氧化鈉標準溶液滴定至酸度計指示氫氧化鈉標準溶液滴定至酸度計指示pH8.2pH8.2，記錄消耗，記錄消耗氫氧化鈉標準溶液的體積（氫氧化鈉標準溶液的體積（mLmL），供計算總酸含量。），供計算總酸含量。 加入加入10.0mL10.0mL甲醛溶液，混勻，再加上述氫氧化鈉標準溶液繼續(xù)甲醛溶液，混勻，再加上述氫氧化鈉標準溶液繼續(xù)滴定至滴定至pH9.2pH9.2，記錄消耗氫氧化鈉標準溶液的體積（，記錄消耗氫氧化鈉標準溶液的體積（mLmL）。）。 同時取同時取80mL80mL蒸餾水置于另一蒸餾水置于另一200mL200mL潔凈燒瓶中，先用氫氧化鈉標潔凈燒瓶中，先用氫氧化鈉標準溶液調(diào)

10、至準溶液調(diào)至pH8.2pH8.2，再加入，再加入10.0mL10.0mL中性甲醛溶液，用中性甲醛溶液，用0.05mol/L0.05mol/L氫氧氫氧化鈉標準溶液滴定至化鈉標準溶液滴定至pH9.2pH9.2，作為試劑空白試驗。，作為試劑空白試驗。2 2、電位滴定法、電位滴定法結(jié)果計算：結(jié)果計算： 氨基酸態(tài)氮含量氨基酸態(tài)氮含量= =式中：式中：V1V1樣品稀釋液在加入甲醛后滴定至終點（樣品稀釋液在加入甲醛后滴定至終點（pH9.2pH9.2）所消耗氫氧化）所消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，鈉標準溶液的體積，mLmL V2 V2空白試驗加入甲醛后滴定至終點所消耗的氫氧化鈉標準溶液的空白試驗加入甲醛后滴定至

11、終點所消耗的氫氧化鈉標準溶液的體積，體積，mLmL c c氫氧化鈉標準溶液的濃度，氫氧化鈉標準溶液的濃度，mol/Lmol/L m m測定用樣品溶液相當于樣品的質(zhì)量，測定用樣品溶液相當于樣品的質(zhì)量，g g 0.014 N2 0.014 N2毫摩爾質(zhì)量，毫摩爾質(zhì)量，g/mmolg/mmol%100100/20014. 0)(21mcVV212 2、電位滴定法、電位滴定法說明：說明：本法準確快速，可用于各類樣品游離氨基酸含量測定本法準確快速，可用于各類樣品游離氨基酸含量測定渾濁和色深樣液可不經(jīng)處理而直接測定渾濁和色深樣液可不經(jīng)處理而直接測定3 3、茚三酮比色法、茚三酮比色法原理：氨基酸在堿性溶液中

12、能與茚三酮作用，生成藍紫色化合物（除脯氨原理：氨基酸在堿性溶液中能與茚三酮作用，生成藍紫色化合物（除脯氨酸外均有此反應(yīng)），可用吸光光度法測定。酸外均有此反應(yīng)），可用吸光光度法測定。 該藍紫色化合物的顏色深淺該藍紫色化合物的顏色深淺與氨基酸含量成正比，其最大吸收波長為與氨基酸含量成正比，其最大吸收波長為750nm750nm，故據(jù)此可以測定樣品中，故據(jù)此可以測定樣品中氨基酸含量。氨基酸含量。儀器：可見分光光度計儀器：可見分光光度計試劑：試劑：20g/L20g/L茚三酮溶液茚三酮溶液pH8.04pH8.04磷酸鹽緩沖溶液磷酸鹽緩沖溶液氨基酸標準溶液（氨基酸標準溶液（200g/mL200g/mL）3

13、3、茚三酮比色法、茚三酮比色法操作方法：操作方法：標準曲線繪制：準確吸取標準曲線繪制：準確吸取200g/mL200g/mL的氨基酸標準溶液的氨基酸標準溶液0.00.0、0.50.5、1.01.0、1.51.5、2.02.0、2.52.5、3.0mL3.0mL（相當于（相當于0 0、100100、200200、300300、400400、500500、600g600g氨氨基酸），分別置于基酸），分別置于25mL25mL容量瓶或比色管中，各加水補充至容積為容量瓶或比色管中，各加水補充至容積為4.0mL4.0mL，然，然后加入茚三酮和磷酸鹽緩沖溶液各后加入茚三酮和磷酸鹽緩沖溶液各1mL1mL，混合均

14、勻，于水浴上加熱，混合均勻，于水浴上加熱15min15min，取出迅速冷卻至室溫，加水至標線，搖勻。靜置取出迅速冷卻至室溫，加水至標線，搖勻。靜置15min15min后，在后，在570nm570nm波長下，波長下，以試劑空白為參比液測定其余各溶液的吸光度以試劑空白為參比液測定其余各溶液的吸光度A A。以氨基酸的微克數(shù)為橫坐。以氨基酸的微克數(shù)為橫坐標，吸光度標，吸光度A A為縱坐標，繪制標準曲線。為縱坐標，繪制標準曲線。樣品測定：吸取澄清的樣品溶液樣品測定：吸取澄清的樣品溶液1 14mL4mL，按標準曲線制作步驟，在相同，按標準曲線制作步驟，在相同條件下測定吸光度條件下測定吸光度A A值，測得的

15、值，測得的A A值在標準曲線上可查得對應(yīng)的氨基酸質(zhì)量。值在標準曲線上可查得對應(yīng)的氨基酸質(zhì)量。3 3、茚三酮比色法、茚三酮比色法結(jié)果計算：結(jié)果計算： 氨基酸含量氨基酸含量= = （mg/100gmg/100g）式中：式中：mm從標準曲線上查得的氨基酸的含量，從標準曲線上查得的氨基酸的含量，gg m1 m1測定的樣品溶液相當于樣品的質(zhì)量，測定的樣品溶液相當于樣品的質(zhì)量，g g10010001mm注意事項：注意事項：通常采用的樣品處理方法為：準確稱取粉碎樣品通常采用的樣品處理方法為：準確稱取粉碎樣品5 510g10g或吸取樣液或吸取樣液樣品樣品5 510mL10mL置于燒杯中，加入置于燒杯中，加入5

16、0mL50mL蒸餾水和蒸餾水和5g5g左右活性炭，加熱煮沸，左右活性炭，加熱煮沸，過濾，用過濾，用303040mL40mL熱水洗滌活性炭，收集濾液于熱水洗滌活性炭，收集濾液于100mL100mL容量瓶中，加水容量瓶中，加水至標線，搖勻備測。至標線，搖勻備測。茚三酮受陽光、空氣、溫度、濕度等影響而被氧化呈淡紅色或深紅茚三酮受陽光、空氣、溫度、濕度等影響而被氧化呈淡紅色或深紅色，使用前須進行純化，方法如下：色，使用前須進行純化，方法如下： 取取10g10g茚三酮溶于茚三酮溶于40mL40mL熱水中，加入熱水中，加入1g1g活性炭，搖動活性炭，搖動1 1分鐘，靜置分鐘，靜置3030分鐘，過濾，將濾液

17、放入冰箱中過夜，即出現(xiàn)藍色結(jié)晶，過濾，用分鐘，過濾，將濾液放入冰箱中過夜，即出現(xiàn)藍色結(jié)晶，過濾，用2mL2mL冷水洗滌結(jié)晶，置于干燥器中干燥，裝瓶備用。冷水洗滌結(jié)晶，置于干燥器中干燥，裝瓶備用。3 3、茚三酮比色法、茚三酮比色法4 4、非水溶液滴定法、非水溶液滴定法原理：氨基酸的非水溶液滴定法是氨基酸在冰醋酸中用高氯酸原理：氨基酸的非水溶液滴定法是氨基酸在冰醋酸中用高氯酸的標準溶液滴定其含量。根據(jù)酸堿的質(zhì)子學(xué)說：一切能給出質(zhì)的標準溶液滴定其含量。根據(jù)酸堿的質(zhì)子學(xué)說：一切能給出質(zhì)子的物質(zhì)為酸，能接受質(zhì)子的物質(zhì)為堿；弱堿在酸性溶劑中堿子的物質(zhì)為酸，能接受質(zhì)子的物質(zhì)為堿；弱堿在酸性溶劑中堿性顯得更強

18、，而弱酸在堿性溶劑中酸性顯得更強，因此本來在性顯得更強，而弱酸在堿性溶劑中酸性顯得更強，因此本來在水溶液中不能滴定的弱堿或弱酸，如果選擇適當?shù)娜軇┦蛊鋸娝芤褐胁荒艿味ǖ娜鯄A或弱酸，如果選擇適當?shù)娜軇┦蛊鋸姸仍黾?，則可以順利地滴定。氨基酸有氨基和羧基，在水中呈度增加，則可以順利地滴定。氨基酸有氨基和羧基，在水中呈現(xiàn)中性，假如在冰醋酸中就顯示出堿性，因此可以用高氯酸等現(xiàn)中性，假如在冰醋酸中就顯示出堿性，因此可以用高氯酸等強酸進行滴定。強酸進行滴定。本法適用于氨基酸成品的含量測定，允許測定的范圍是幾十毫本法適用于氨基酸成品的含量測定，允許測定的范圍是幾十毫克的氨基酸?？说陌被?。4 4、非水溶液滴

19、定法、非水溶液滴定法操作方法：操作方法：直接法（適用于能溶解于冰醋酸的氨基酸）：精確稱取氨基酸樣品直接法（適用于能溶解于冰醋酸的氨基酸）：精確稱取氨基酸樣品50mg50mg左右，溶解于左右，溶解于20mL20mL冰醋酸中，加兩滴甲基紫指示劑，用高氯酸標冰醋酸中，加兩滴甲基紫指示劑，用高氯酸標準液滴定，終點為紫色剛消失，呈現(xiàn)藍色。空白管為不含氨基酸的冰準液滴定，終點為紫色剛消失，呈現(xiàn)藍色?？瞻坠転椴缓被岬谋姿?，滴定至同樣終點顏色。醋酸，滴定至同樣終點顏色。 氨基酸含量氨基酸含量= =式中：式中：V VHClOHClO4 4所消耗的高氯酸標準溶液的體積所消耗的高氯酸標準溶液的體積 c cHC

20、lOHClO4 4所消耗的高氯酸標準溶液的濃度所消耗的高氯酸標準溶液的濃度 M M被測氨基酸的摩爾質(zhì)量被測氨基酸的摩爾質(zhì)量 m m被測氨基酸的質(zhì)量被測氨基酸的質(zhì)量%10044mMcVHClOHClO4 4、非水溶液滴定法、非水溶液滴定法回滴法（適用于不易溶解于冰醋酸而能溶解于高氯酸的氨基酸）：精確稱取氨回滴法（適用于不易溶解于冰醋酸而能溶解于高氯酸的氨基酸）：精確稱取氨基酸樣品基酸樣品3040mg 3040mg 左右，溶解于左右，溶解于5mL5mL高氯酸標準溶液中，加高氯酸標準溶液中，加2 2滴甲基紫指示劑，剩滴甲基紫指示劑，剩余的酸以醋酸鈉溶液滴定，顏色變化由黃，經(jīng)過綠、藍至初次出現(xiàn)不褪的紫

21、色為余的酸以醋酸鈉溶液滴定，顏色變化由黃，經(jīng)過綠、藍至初次出現(xiàn)不褪的紫色為終點。終點。 氨基酸含量氨基酸含量= =（含有兩個氨基的氨基酸，如賴氨酸、胱氨酸和精氨酸在此計算式中還應(yīng)該除以（含有兩個氨基的氨基酸，如賴氨酸、胱氨酸和精氨酸在此計算式中還應(yīng)該除以2 2）式中：式中：V VHClOHClO4 4所消耗的高氯酸標準溶液的體積所消耗的高氯酸標準溶液的體積 c cHClOHClO4 4所消耗的高氯酸標準溶液的濃度所消耗的高氯酸標準溶液的濃度 V VNaACNaAC所消耗的醋酸鈉溶液的體積所消耗的醋酸鈉溶液的體積 c cNaACNaAC所消耗的醋酸鈉溶液的濃度所消耗的醋酸鈉溶液的濃度 M M被測

22、氨基酸的摩爾質(zhì)量被測氨基酸的摩爾質(zhì)量 m m被測氨基酸的質(zhì)量被測氨基酸的質(zhì)量%100)(44mMcVcVNaACNaACHClOHClO4 4、非水溶液滴定法、非水溶液滴定法注意事項：注意事項：(1)(1)能溶解于冰醋酸的氨基酸，可以用直接法測定的有：丙能溶解于冰醋酸的氨基酸，可以用直接法測定的有：丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、組氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯氨酸、精氨酸、甘氨酸、組氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和蘇氨酸。不易溶解丙氨酸、色氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和蘇氨酸。不易溶解于冰醋酸，但能溶解于高氯酸可以回滴法測定的有：賴氨于冰醋酸，但能溶解于高氯酸可以回滴法測定的有：賴

23、氨酸、絲氨酸、胱氨酸和半胱氨酸。酸、絲氨酸、胱氨酸和半胱氨酸。(2)(2)谷氨酸和天冬氨酸在高氯酸溶液中也不能溶解，可以將谷氨酸和天冬氨酸在高氯酸溶液中也不能溶解，可以將樣品溶解于樣品溶解于2mL 2mL 甲酸中，再加甲酸中，再加20mL 20mL 冰醋酸，直接用標準的冰醋酸，直接用標準的高氯酸溶液滴定。高氯酸溶液滴定。5 5、鄰苯二甲醛法（、鄰苯二甲醛法（OPTOPT法）法）原理：原理： 鄰苯二甲醛在鄰苯二甲醛在 2-2-巰基乙醇存在下，于堿性溶液中與氨基酸作用產(chǎn)生熒巰基乙醇存在下，于堿性溶液中與氨基酸作用產(chǎn)生熒光化合物，最適的激發(fā)光和發(fā)射光波長分別為光化合物，最適的激發(fā)光和發(fā)射光波長分別為

24、340 340 和和455nm455nm。 各種氨基酸顯現(xiàn)的熒光強度不同，其相對熒光強度由大到小大致順序各種氨基酸顯現(xiàn)的熒光強度不同，其相對熒光強度由大到小大致順序如下：天冬氨酸，異亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，組氨酸，亮氨酸，絲氨如下：天冬氨酸，異亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，組氨酸，亮氨酸，絲氨酸，纈氨酸，谷氨酸，蘇氨酸，甘氨酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，賴酸，纈氨酸，谷氨酸，蘇氨酸，甘氨酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，賴氨酸，酪氨酸，氨酸，酪氨酸，NH3NH3，脯氨酸和半胱氨酸。，脯氨酸和半胱氨酸。 本法可用于測定游離氨基酸的含量。靈敏度較茚三酮法高本法可用于測定游離氨基酸的含量。靈敏度較茚三酮法

25、高 100 100 倍以上，倍以上，可測到可測到 molmol氨基酸。如用于血清中氨基酸。如用于血清中-氨基氮的測定，每次血清氨基氮的測定，每次血清用量只需用量只需5 510L10L。與另一種熒光試劑（螢光胺）一樣，空白無熒光，只。與另一種熒光試劑（螢光胺）一樣，空白無熒光，只有與氨基酸結(jié)合才產(chǎn)生熒光。缺點是與脯氨酸不產(chǎn)生熒光，鄰苯二甲醛與有與氨基酸結(jié)合才產(chǎn)生熒光。缺點是與脯氨酸不產(chǎn)生熒光，鄰苯二甲醛與半胱氨酸熒光值太低。熒光胺已用于氨基酸自動分析定量分析，但由于試半胱氨酸熒光值太低。熒光胺已用于氨基酸自動分析定量分析，但由于試劑昂貴及個別氨基酸反應(yīng)不滿意，目前還未普遍應(yīng)用。劑昂貴及個別氨基酸

26、反應(yīng)不滿意，目前還未普遍應(yīng)用。410) 11 . 0(5 5、鄰苯二甲醛法（、鄰苯二甲醛法（OPTOPT法）法）操作：操作： 以血清中游離氨基酸測定為例。以血清中游離氨基酸測定為例。 血清的去蛋白處理：血清或肝素血的血漿加等體積血清的去蛋白處理：血清或肝素血的血漿加等體積0.6mol/L0.6mol/L三三氯醋酸，混勻，靜置氯醋酸，混勻，靜置10min10min后，后，30004000r/min30004000r/min離心離心10min10min。取上清。取上清液用水稀釋液用水稀釋5 5倍，相當于原血清的倍，相當于原血清的1010倍稀釋液。倍稀釋液。 分別吸?。好拷M兩份。分別吸?。好拷M兩份。

27、測定管：稀釋測定管：稀釋1010倍的血清上清液倍的血清上清液100L100L，加水至，加水至300L300L標準管：標準管：1mmol1mmol谷氨酸標準溶液谷氨酸標準溶液25L25L，加，加0.06mol/L0.06mol/L三氯醋酸三氯醋酸100L100L。加水至。加水至300L300L空白管：空白管：0.06mol/L0.06mol/L三氯醋酸三氯醋酸100L100L，加水至，加水至300L300L。 分別加分別加3mLOPT3mLOPT溶液于上述樣品中，迅速搖勻，立即進行熒光測溶液于上述樣品中，迅速搖勻，立即進行熒光測定。使用熒光分光光度計，激發(fā)光波長定。使用熒光分光光度計，激發(fā)光波長

28、340nm340nm，發(fā)射光波長，發(fā)射光波長455nm455nm。6 6、三硝基苯磺酸法、三硝基苯磺酸法原理：原理： 三硝基苯磺酸（三硝基苯磺酸（TNBSTNBS）是定量測定氨基酸的重要試劑之一。）是定量測定氨基酸的重要試劑之一。TNBS TNBS 在偏堿性的條件下與氨基酸反應(yīng)，先形成中間絡(luò)合物。在偏堿性的條件下與氨基酸反應(yīng)，先形成中間絡(luò)合物。 中間絡(luò)合物在光譜上有中間絡(luò)合物在光譜上有2 2個吸收值相近的高峰，分別位于個吸收值相近的高峰，分別位于355nm 355nm 和和420nm 420nm 附近。然而溶液一旦酸化，中間絡(luò)合物轉(zhuǎn)化成三硝基苯附近。然而溶液一旦酸化，中間絡(luò)合物轉(zhuǎn)化成三硝基苯-

29、 -氨氨基酸（基酸（TNP-TNP-氨基酸），氨基酸），420nm 420nm 處的吸收值顯著下降，而處的吸收值顯著下降，而350nm 350nm 附近附近的吸收峰則移至的吸收峰則移至340nm 340nm 處。處。 利用利用 TNBS TNBS 與氨基酸反應(yīng)的這一特性，可在與氨基酸反應(yīng)的這一特性，可在420nm 420nm 處（偏堿性處（偏堿性溶液中）或在溶液中）或在340nm340nm（偏酸性溶液中）對氨基酸進行定量測定。在（偏酸性溶液中）對氨基酸進行定量測定。在340nm 340nm 處，各氨基酸的吸收度大致相近，而在處，各氨基酸的吸收度大致相近，而在420nm 420nm 處的吸光度因

30、處的吸光度因氨基酸種類而異；在加入適量氨基酸種類而異；在加入適量 時，吸收值升高。時，吸收值升高。 本法允許的測定范圍是本法允許的測定范圍是 0.050.050.4mol 0.4mol 氨基酸。氨基酸。23SO6 6、三硝基苯磺酸法、三硝基苯磺酸法操作方法：操作方法：偏堿性溶液，測偏堿性溶液，測420nm420nm處吸光值。待測氨基酸樣品溶液處吸光值。待測氨基酸樣品溶液1mL1mL，加，加40g/LNaHCO3 1mL40g/LNaHCO3 1mL、1g/LTNBS 1mL1g/LTNBS 1mL、0.01mol/LNa2SO3 1mL0.01mol/LNa2SO3 1mL，混合后，混合后于于

31、40 40 反應(yīng)反應(yīng)2h2h，在，在420nm420nm處測定?？瞻滓哉麴s水代替待測液。處測定?？瞻滓哉麴s水代替待測液。 標準曲線制作：標準氨基酸溶液標準曲線制作：標準氨基酸溶液0.10.8mL0.10.8mL，補充水至，補充水至1mL1mL，與，與上述樣品同樣操作步驟。上述樣品同樣操作步驟。偏酸性溶液，測偏酸性溶液，測340nm340nm處吸光值。待測氨基酸樣品溶液處吸光值。待測氨基酸樣品溶液1mL1mL，加，加40g/LNaHCO3 1mL40g/LNaHCO3 1mL、1g/LTNBS 1mL1g/LTNBS 1mL，混合后于，混合后于40 40 反應(yīng)反應(yīng)2h2h，加，加1mol/L1m

32、ol/L鹽酸鹽酸1mL1mL，混合后在，混合后在340nm340nm處測定?？瞻滓哉麴s水代替待測液。處測定?？瞻滓哉麴s水代替待測液。 標準曲線制作：標準氨基酸溶液標準曲線制作：標準氨基酸溶液0.10.8mL0.10.8mL，補充水至，補充水至1mL1mL，與，與上述樣品同樣操作步驟。上述樣品同樣操作步驟。7 7、乙酰丙酮和甲醛熒光法、乙酰丙酮和甲醛熒光法原理：原理： 氨基酸與乙酰丙酮和甲醛反應(yīng)，生成氨基酸與乙酰丙酮和甲醛反應(yīng)，生成 N-N-取代基取代基2,6-2,6-二甲基二甲基-3,5-3,5-二乙?；阴；?,4-1,4-二氫吡啶，產(chǎn)生黃二氫吡啶，產(chǎn)生黃- -綠色熒光，可用熒光分析法檢測

33、。綠色熒光，可用熒光分析法檢測。試劑：試劑：混合試劑：取混合試劑：取1mol/L 1mol/L 乙酸鈉溶液乙酸鈉溶液10mL10mL，加入乙酰丙酮溶液，加入乙酰丙酮溶液0.4mL 0.4mL 和和30%30%甲醛溶液甲醛溶液1mL1mL，用水稀釋至，用水稀釋至30mL30mL。操作方法：操作方法： 取氨基酸液取氨基酸液 1mL1mL，加入混合試劑，加入混合試劑1mL1mL，用棉花塞滿試管口，避光于，用棉花塞滿試管口，避光于100100下加熱下加熱10min10min，冷卻，加水，冷卻，加水2mL2mL，然后測定熒光值。，然后測定熒光值。 與標準相比較求出樣品中的氨基酸含量。與標準相比較求出樣品

34、中的氨基酸含量。比較：比較：甲醛滴定法：食品中的游離氨基酸甲醛滴定法：食品中的游離氨基酸電位滴定法：各類樣品的游離氨基酸電位滴定法：各類樣品的游離氨基酸茚三酮比色法：？茚三酮比色法：？非水溶液滴定法：氨基酸成品的含量測定非水溶液滴定法：氨基酸成品的含量測定鄰苯二甲醛法：游離氨基酸，比茚三酮法靈敏鄰苯二甲醛法：游離氨基酸，比茚三酮法靈敏三硝基苯磺酸法：？三硝基苯磺酸法：？乙酰丙酮和甲醛熒光法：？乙酰丙酮和甲醛熒光法：？二、個別氨基酸的定量測定二、個別氨基酸的定量測定1 1、賴氨酸的測定、賴氨酸的測定原理：原理： 用銅離子阻礙游離氨基酸的用銅離子阻礙游離氨基酸的-氨基氨基, ,使賴氨酸的使賴氨酸的

35、-氨基可以氨基可以自由地與自由地與1-1-氟氟-2,4 -2,4 二硝基苯二硝基苯(FDNB)(FDNB)反應(yīng)反應(yīng), ,生成生成-DNP-DNP-賴氨酸。經(jīng)賴氨酸。經(jīng)酸化和用二乙基醚提取酸化和用二乙基醚提取, ,在波長在波長390nm 390nm 處有吸收峰處有吸收峰, ,從而求出樣品中從而求出樣品中游離賴氨酸的含量。游離賴氨酸的含量。1 1、賴氨酸的測定、賴氨酸的測定操作方法：操作方法：向各燒瓶中加入向各燒瓶中加入25mL 25mL 磷酸銅懸浮液，然后再加磷酸銅懸浮液，然后再加10%10%丙氨酸丙氨酸1.0mL,1.0mL,振搖振搖15min15min。吸取。吸取10%FDNB 10%FDN

36、B 溶液溶液0.5mL.0.5mL.置于各處理燒瓶中置于各處理燒瓶中, ,將燒瓶置沸水中加熱將燒瓶置沸水中加熱15min15min。 取出燒瓶取出燒瓶, ,立即加入立即加入1mol/LHCl 1mol/LHCl 溶液溶液25mL,25mL,并不斷搖動使之酸化和分散均并不斷搖動使之酸化和分散均勻。勻。 燒瓶中的溶液冷卻至室溫?zé)恐械娜芤豪鋮s至室溫, ,用水稀釋至用水稀釋至100mL.100mL.取約取約40mL 40mL 懸浮液進行離心。懸浮液進行離心。 用用25mL 25mL 二乙基醚提取上清液二乙基醚提取上清液3 3 次，除去醚。并將溶液收集于有刻度試次，除去醚。并將溶液收集于有刻度試管中管

37、中, ,于于65 65 水浴中加熱水浴中加熱15min15min，以除去殘留的醚。并記錄溶液的毫升數(shù)。，以除去殘留的醚。并記錄溶液的毫升數(shù)。吸取上述各處理液吸取上述各處理液10mL10mL，分別與，分別與95%95%乙醇溶液乙醇溶液10mL 10mL 混合，用濾紙過濾?；旌?，用濾紙過濾。用試劑空白液凋零，測定樣液用試劑空白液凋零，測定樣液A390nmA390nm，與賴氨酸，與賴氨酸-HCl -HCl 標準液對照，求標準液對照，求出樣品中賴氨出樣品中賴氨 酸酸-HCl -HCl 的含量。的含量。 本法在本法在 0 040mg/L 40mg/L 賴氨酸溶液范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。賴氨酸溶液范圍內(nèi)呈良

38、好線性關(guān)系。 1 1、賴氨酸的測定、賴氨酸的測定說明說明： 添加一定量的中性氨基酸如丙氨酸，增加總氨基酸的添加一定量的中性氨基酸如丙氨酸，增加總氨基酸的濃度，有助于賴氨酸濃度，有助于賴氨酸-HCl -HCl 濃度濃度 具有良好的線性關(guān)系。具有良好的線性關(guān)系。 用醚提取酸性溶液，可將所有中性或酸性的用醚提取酸性溶液，可將所有中性或酸性的DNP-DNP-氨基氨基酸衍生物除去，并把酸衍生物除去，并把FDWB FDWB 的產(chǎn)物破壞，否則這些產(chǎn)物在的產(chǎn)物破壞，否則這些產(chǎn)物在390nm 390nm 處存在干擾。處存在干擾。 2 2、色氨酸的測定、色氨酸的測定原理原理 ：樣品中的蛋白質(zhì)經(jīng)堿水解后，游離的色氨

39、酸與甲醛和含鐵離子的三氯樣品中的蛋白質(zhì)經(jīng)堿水解后，游離的色氨酸與甲醛和含鐵離子的三氯乙酸溶液作用，生乙酸溶液作用，生 成哈爾滿化合物（成哈爾滿化合物（norharmannorharman），具有特征熒光值，），具有特征熒光值，可以進行定量測定?？梢赃M行定量測定。試劑試劑：(1)0.3mmol/L (1)0.3mmol/L 三氯化鐵三氯化鐵- -三氯乙酸溶液：稱取三氯化鐵三氯乙酸溶液：稱取三氯化鐵(FeCl3(FeCl36H2O)41mg6H2O)41mg，加入，加入10%10%三氯乙酸溶液溶解并定三氯乙酸溶液溶解并定容容至至500mL500mL。 (2)2%(2)2%甲醛：量取甲醛溶液甲醛：量

40、取甲醛溶液(36%(36%38%)5.5mL38%)5.5mL，加水至，加水至100mL100mL。 (3)(3)色氨酸標準溶液：稱取色氨酸標準溶液：稱取10mg10mg色氨酸，用色氨酸，用0.1mol/LNaOH 0.1mol/LNaOH 溶液溶解并溶液溶解并定容至定容至100mL, 100mL, 置棕色瓶中備用置棕色瓶中備用, ,使用時用水稀釋成使用時用水稀釋成1mg/L1mg/L的標準溶液的標準溶液2 2、色氨酸的測定、色氨酸的測定操作方法：操作方法： 稱取樣品粉末稱取樣品粉末100100200mg200mg于離心管中，加入于離心管中，加入4mL4mL乙醚乙醚, ,搖勻后過夜，搖勻后過夜

41、，以以3000r/min3000r/min速度離心。將乙醚提取液移入試管內(nèi)速度離心。將乙醚提取液移入試管內(nèi), ,并用乙醚洗滌殘渣并用乙醚洗滌殘渣3 3次，收集乙醚液于試管中，于次，收集乙醚液于試管中，于4040水浴除去醚。殘留物中加入水浴除去醚。殘留物中加入6.25mol/L6.25mol/L NaOH4mLNaOH4mL，火焰封口，于，火焰封口，于110110水解水解161624h24h。水。水 解液用解液用4mol/L HCl 4mol/L HCl 溶液調(diào)節(jié)至溶液調(diào)節(jié)至pH6pH68 8 后后, ,用水定容至用水定容至50mL,50mL,過濾備用。過濾備用。 吸取濾液吸取濾液0.2mL0.

42、2mL，加入，加入2%2%甲醛甲醛0.2mL0.2mL和和0.3mmol/L0.3mmol/L三氯化鐵三氯化鐵- -三氯乙三氯乙酸混合液酸混合液2mL2mL，搖勻后于，搖勻后于100100水浴中加熱水浴中加熱1h1h，取出，冷卻后用水定容，取出，冷卻后用水定容至至10mL10mL。在激發(fā)波長為。在激發(fā)波長為365nm365nm，發(fā)射波長，發(fā)射波長449nm449nm條件下，測定樣品的熒條件下，測定樣品的熒光強度，與色氨酸標樣作對照，求出樣品中色氨酸含量。光強度，與色氨酸標樣作對照，求出樣品中色氨酸含量。 本法在本法在0 010mg/L10mg/L色氨酸溶液范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系色氨酸溶液范圍內(nèi)呈

43、良好線性關(guān)系。3 3、苯丙氨酸的測定、苯丙氨酸的測定原理：原理：苯丙氨酸與茚三酮及銅鹽反應(yīng)生成熒光復(fù)合物，其熒光復(fù)合苯丙氨酸與茚三酮及銅鹽反應(yīng)生成熒光復(fù)合物，其熒光復(fù)合物在激光波長物在激光波長365nm365nm、發(fā)射波長、發(fā)射波長490nm490nm處可以產(chǎn)生最大熒光強處可以產(chǎn)生最大熒光強度，與標準氨基酸對照，可求出樣品中苯丙氨酸的含量，檢度，與標準氨基酸對照，可求出樣品中苯丙氨酸的含量，檢測時加入測時加入L-L-亮氨酸亮氨酸-L-L-丙氨酸二肽能增強這一反應(yīng)。丙氨酸二肽能增強這一反應(yīng)。試劑試劑（1 1）二肽）二肽茚三酮試劑茚三酮試劑試劑試劑 A A：5 5m mmol/L mol/L 亮丙

44、二肽溶液：稱取亮丙二肽溶液：稱取 L L亮氨酸亮氨酸LL丙氨酸丙氨酸 1mg 1mg 溶于溶于 1mL 1mL 水中水中 ，臨用時配制。臨用時配制。試劑試劑 B B：3030m mmol/L mol/L 茚三酮溶液：稱取茚三酮茚三酮溶液：稱取茚三酮 534mg 534mg 溶于溶于 100mL 100mL水中水中，冰箱內(nèi)貯存。，冰箱內(nèi)貯存。試劑試劑 C C：0.6mol/L 0.6mol/L 琥珀酸鹽緩沖液：稱取琥珀酸琥珀酸鹽緩沖液：稱取琥珀酸 7.086g 7.086g，加水約，加水約 25mL 25mL，加入，加入4.8mol/LNaOH 4.8mol/LNaOH 溶液調(diào)至溶液調(diào)至 pH5

45、.88 pH5.88，加水至，加水至 100mL 100mL，冰箱內(nèi)貯存。，冰箱內(nèi)貯存。 臨用前將試劑臨用前將試劑 A A、B B、C C 按按 1+2+5 1+2+5 體積比混合。體積比混合。（2 2）銅試劑）銅試劑試劑試劑 A A：25mmol/L 25mmol/L 碳酸鈉碳酸鈉0.4mmol/L 0.4mmol/L 酒石酸鉀鈉溶液：稱取無水碳酸鈉酒石酸鉀鈉溶液：稱取無水碳酸鈉2.662.66g g、酒石、酒石酸鉀鈉（含酸鉀鈉（含 4 4 份結(jié)晶水）份結(jié)晶水）113mg 113mg 加水至加水至 1000mL 1000mL。試劑試劑 B B：0.8mol/L 0.8mol/L 硫酸銅溶液：

46、稱取硫酸銅（硫酸銅溶液：稱取硫酸銅（CuSO4CuSO45H2O5H2O）100g100g，溶于，溶于 500mL 500mL水中。水中。 臨用前將試劑臨用前將試劑 A A、B B 兩液按兩液按 3+2 3+2 體積比混合。體積比混合。（3 3）苯丙氨酸標準溶液）苯丙氨酸標準溶液：稱取苯丙氨酸稱取苯丙氨酸配制成配制成6.6m6.6mg/Lg/L氨基酸氨基酸標準溶液。標準溶液。3 3、苯丙氨酸的測定、苯丙氨酸的測定3 3、苯丙氨酸的測定、苯丙氨酸的測定操作方法：操作方法：血清的去蛋白處理：吸取新鮮血清血清的去蛋白處理：吸取新鮮血清50100uL50100uL和等體積和等體積0.6mol/L0.6

47、mol/L三氯三氯乙酸溶液混合，靜置乙酸溶液混合，靜置10min10min后，以后，以4000r/min4000r/min速度離心速度離心10min10min，吸取上，吸取上清液用水精確稀釋清液用水精確稀釋5 5倍。倍。樣品測定：吸取血清稀釋液樣品測定：吸取血清稀釋液100uL100uL置于樣品管中，另吸取苯丙氨酸置于樣品管中，另吸取苯丙氨酸標準液標準液25uL25uL，加，加0.06mol/L0.06mol/L三氯乙酸溶液三氯乙酸溶液100uL100uL，然后兩管均加水至，然后兩管均加水至200uL200uL，同時作試劑空白分析。再向各管加入，同時作試劑空白分析。再向各管加入 0.3mL 0

48、.3mL 二肽二肽茚三酮試茚三酮試劑。放在劑。放在7575水浴中保溫水浴中保溫80min80min。取出冷卻，加入。取出冷卻，加入2.5mL2.5mL銅試劑，振搖銅試劑，振搖均勻，均勻，90min90min內(nèi)在激發(fā)波長為內(nèi)在激發(fā)波長為385nm385nm、發(fā)射波長、發(fā)射波長472nm472nm條件下，測定樣條件下，測定樣品的熒光值，與苯丙氨酸標樣作對照，求出樣品游離苯丙氨酸的含量。品的熒光值，與苯丙氨酸標樣作對照，求出樣品游離苯丙氨酸的含量。4 4、酪氨酸的測定、酪氨酸的測定原理：原理： 酪氨酸和酪氨酸和1-1-亞硝酸亞硝酸-2-2-萘酚反應(yīng)，生成有色化合物，此化合物在硝酸和亞硝酸鈉萘酚反應(yīng)，

49、生成有色化合物，此化合物在硝酸和亞硝酸鈉存在的條件下加熱，產(chǎn)生穩(wěn)定的熒光物質(zhì)，可用熒光法定量測定。存在的條件下加熱，產(chǎn)生穩(wěn)定的熒光物質(zhì)，可用熒光法定量測定。操作方法：操作方法：樣品去蛋白處理：吸取新鮮血清樣品去蛋白處理：吸取新鮮血清50100uL50100uL和等體積和等體積0.6mol/L0.6mol/L三氯醋酸溶液混合，三氯醋酸溶液混合，4000r/min4000r/min離心離心10min10min，吸取上清液用水精確稀釋，吸取上清液用水精確稀釋5 5倍，即得稀釋倍，即得稀釋1010倍的樣品溶液。倍的樣品溶液。樣品測定：分別吸取樣液樣品測定：分別吸取樣液100uL100uL于具塞試管于具

50、塞試管1 1；標準酪氨酸溶液；標準酪氨酸溶液25uL25uL和和0.06mol/L0.06mol/L三三氯醋酸溶液氯醋酸溶液100uL100uL于具塞試管于具塞試管2,0.06mol/L2,0.06mol/L三氯醋酸溶液三氯醋酸溶液100uL100uL于具塞試管于具塞試管3 3，各管用水，各管用水補充容積至補充容積至200uL200uL。 將各管置于將各管置于5555水浴數(shù)分鐘，加入新配制的亞硝酸萘酚試劑水浴數(shù)分鐘，加入新配制的亞硝酸萘酚試劑0.3mL0.3mL，搖勻，搖勻，5555保保溫溫20min20min，保溫后加水，保溫后加水2.5mL2.5mL，搖勻后再加三氯乙酸溶液，搖勻后再加三氯

51、乙酸溶液3mL3mL。充分振搖以便將多余的。充分振搖以便將多余的試劑抽提入二氯乙烷溶液中，試劑抽提入二氯乙烷溶液中，4000r/min4000r/min離心離心10min10min，將上層水溶液移至另一試管內(nèi)，將上層水溶液移至另一試管內(nèi)，在在180min180min內(nèi)，于激發(fā)波長為內(nèi)，于激發(fā)波長為468nm468nm、發(fā)射波長為、發(fā)射波長為555nm555nm處，測定樣品的熒光強度，與氨處，測定樣品的熒光強度，與氨基酸標樣對照，求出樣品氨基酸含量?；針藰訉φ?，求出樣品氨基酸含量。 本法在本法在00.2mol/L00.2mol/L酪氨酸范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。酪氨酸范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。5

52、5、脯氨酸的測定、脯氨酸的測定原理：原理： 在丙酮溶劑中，脯氨酸與吲哚醌反應(yīng)形成藍色化合物，在丙酮溶劑中，脯氨酸與吲哚醌反應(yīng)形成藍色化合物，能用以測定蛋白質(zhì)水解能用以測定蛋白質(zhì)水解液中的脯氨酸含量，液中的脯氨酸含量，在一定條件下，可以在其他氨基酸存在下直接進行測定，在一定條件下，可以在其他氨基酸存在下直接進行測定，不受不受羥脯氨酸的干擾。羥脯氨酸的干擾。試劑：試劑：pH3.9pH3.9檸檬酸鹽緩沖液；檸檬酸鹽緩沖液；0.75g/L0.75g/L吲哚醌丙酮溶液；水飽和酚溶液。吲哚醌丙酮溶液；水飽和酚溶液。操作方法操作方法： 稱取蛋白質(zhì)樣品稱取蛋白質(zhì)樣品5mg5mg，加，加6mo1/L HCl6mo1/L HCl溶液溶液2mL2mL，封管后于，封管后于140140水解水解4h4h。啟封，。啟封，加蒸餾水稀釋至鹽酸濃度達加