基于新型量子點多功能探針的電化學(xué)傳感器

1、第二章 基于新型量子點多功能探針的電化學(xué)傳感器1引言在過去的十年，量子點由于其獨特的性質(zhì)和在生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用而引起人們越來越高的研究興趣1。自從硅量子點的電致化學(xué)發(fā)光（ECL）被Bard2首次發(fā)現(xiàn)后，半導(dǎo)體納米材料的ECL得到了很大的關(guān)注3,4,5，基于QD的ECL分析技術(shù)已經(jīng)迅速發(fā)展到許多領(lǐng)域6,7,8。在眾多的DNA檢測技術(shù)中，電致化學(xué)發(fā)光技術(shù)具有很多優(yōu)勢，如成本低廉，分析范圍廣，背景信號低，靈敏度高等，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物傳感器 9,10,11。而且，適體作為單鏈核酸可以與蛋白質(zhì)分子或靶細(xì)胞特異性結(jié)合，近幾年，量子點ECL也應(yīng)用于目標(biāo)適體檢測 12-16 。然而，基于量子點的ECL信號還不高

2、，迫切需要探索新技術(shù)增強量子點的ECL信號。Dendrimers是高度分支的樹枝狀大分子，末端具有很多官能團(tuán)，容易功能化 17,18 。據(jù)報道，樹枝狀聚合物納米簇已經(jīng)合成，并應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞的活體檢測 19。而且，樹枝狀高分子/ CdSe-ZnS量子點納米結(jié)構(gòu)也被應(yīng)用于癌細(xì)胞的ECL檢測中20。DNA雜交檢測在分子生物學(xué)、疾病診斷、基因表達(dá)研究等領(lǐng)域非常重要 21 。而且，癌癥是當(dāng)今最緊迫的影響健康的問題。根據(jù)報道，對癌細(xì)胞的靈敏監(jiān)測能提供一種監(jiān)控疾病發(fā)展的簡單和有效的方法 22-24 。因此，研究對癌細(xì)胞精確和靈敏的識別和檢測對癌癥的診斷和治療具有非常重要的作用。值得注意的是，近幾年基于適體對

3、腫瘤細(xì)胞的特異性識別和檢測技術(shù)已經(jīng)成為熱點研究領(lǐng)域 25-27 。因此，我們提出了用樹枝狀量子點納米簇作為多功能探針，通過電化學(xué)和電致化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測DNA和癌細(xì)胞。CNTs/ 金納米粒子以其表面積大、穩(wěn)定性高、生物活性好等優(yōu)勢成為了固定生物分子的一種可靠的放大平臺。特別是dendrimer/QDs 納米簇作為信號放大探針應(yīng)用于電致化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)檢測DNA和細(xì)胞的方法中。而且，利用磁性納米粒子固定細(xì)胞適體，極大簡化了分離過程。本文提供了一種高靈敏度，高選擇性，簡便、低損耗的精確檢測DNA和癌細(xì)胞的方法和技術(shù)。2實驗部分2.1 材料和儀器2.1.1材料所有合成的寡核苷酸均從上海生工生物工程技術(shù)

4、服務(wù)有限公司（中國）購買。寡核苷酸的序列如下：DNA Sequence C-DNA 5-SH-TAC AGA GGG T CTC CTC CCG GTG-3random DNA： 5- SH-ATG TCT CCCA CTC CTC CCG GTG-3 Target DNA: 5-GCC GCT CAC ACG ATA CCT AAT GTG CACCGG GAG GAG ACC-3Two base mismatch: 5-GCC GCT CAC ACG ATA CCT AAT GTG CACCCG GAG GAC ACC-3noncomplementary sequences: 5- GA

5、GGA TAG TTC GGT GGC TGT TCA GGG T CTC CTC CCG GTG-3C-aptamer 5- GCC GCT CAC ACG ATA TAC AGA ACA CCG GGA GGA TAG TTC GGT GGC TGT TCAG GGT TTT HS-3first-probe DNA (p1-DNA): 5-TAT CGT GTG AGC GGC TTT TTT- NH2-3bio-bar-code DNA (bbc-DNA)：5-GCT CAT ATG GAC CTC TTT TTT- NH2-3表2-1 方案1的DNA序列Table 2-1 The Se

6、quences of the DNA in Scheme 1氧化鎘(CdO, 99.99%),醋酸鎘(99.9%, powder),硒粉(99.9%, powder), 硫磺(99.9%, powder), 三辛基磷 (TOP, 90%), 油酸 (OA, 90%), 1-十八烯 (ODE, 90%),巰基丙酸 (MPA, 99.8%) 和6-巰基-1-己醇 (MCH) 是從Aldrich公司購買的。第五代樹枝狀高分子聚合物 (ethylenediamine core, generation 5)溶劑從 Sigma-Aldrich (上海) 貿(mào)易有限公司購買的。乙基-（3-二甲基丙基）碳二亞胺

7、鹽酸（EDC）從Sigma購買的。Fe3O4-Au核殼磁性納米粒子(MNPs， Fe3O4Au) (50 nm)從陜西Lifegen有限公司購買的。羧基修飾的磁性納米粒子(500 nm, 10 mg/mL)和磁力架從天津市倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心購買的。多壁碳納米管(CNTs, CVD method, purity 95%, diameter 3060 nm, length 0.515 m)從國藥化學(xué)試劑公司購買的。氯金酸(HAuCl4)和檸檬酸三鈉從上海試劑公司購買的。所有的其他試劑均為分析純。所有實驗均用二次水。多種pH值的磷酸鹽緩沖溶液(PBS, 0.1 M)通過混合不同量的NaH2PO4

8、 and Na2HPO4原液。細(xì)胞：Ramos 細(xì)胞和 CEM細(xì)胞都是從中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院購買。 細(xì)胞是在補充了10 胎牛血清（FBS）和100 IU/mL青霉素 - 鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在每次實驗前，用細(xì)胞計數(shù)器對細(xì)胞密度進(jìn)行測定。之后，大約一百萬細(xì)胞分散到RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基緩沖液中，在3000 rpm下離心5分鐘, 三次分散到培養(yǎng)基后，分散到1 mL的細(xì)胞緩沖液中。整個過程，細(xì)胞保持在冰浴4 C.2.1.2實驗裝置電化學(xué)和電致化學(xué)發(fā)光信號是用MPI-A電致化學(xué)發(fā)光分析儀（西安瑞邁電子科技公司），采用三電極系統(tǒng)測得的。金電極作為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，

9、Pt電極為對電極。檢測過程中，光電倍增管（PMT）的光波長為200-800V，光電倍增管電壓為500800V。電化學(xué)阻抗譜（EIS）用CHI 660C電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司，中國），使用與ECL檢測相同的三電極系統(tǒng)。透射電子顯微鏡圖（TEM）是用JEOL JSM-6700F型儀器（日立）記錄的。光致發(fā)光譜（PL）是用RF-540型分光光度計（島津）測得。場發(fā)射掃描電子顯微鏡（ FE- SEM）用JEOL JSM-6700F。2.2 CdSe-CdS量子點的合成根據(jù)文獻(xiàn)28-29，0.0514 g of CdO，1.066 g 的醋酸鎘, 17.6 mmol 油酸和 20 mL 十八烯放

10、入到250 ml的圓底燒瓶中。將混合物加熱到150 C，通氮氣除氣，進(jìn)一步加熱到300 C。在這個溫度下，將事先準(zhǔn)備好的溶液迅速注射到反應(yīng)的燒瓶中。溶液是將0.0315 g 硒粉和 0.128 g 硫粉溶解到3mL的三辛基磷中。注射后，反應(yīng)燒瓶的溫度控制在300 C保持45分鐘，然后冷卻到室溫。合成的量子點加入20 mL氯仿和過量的丙酮純化3次，最終重新溶解到甲苯溶液中。2.3可溶于水的量子點的制備根據(jù)文獻(xiàn)30用巰基丙酸(MPA)替換附著在量子點表面油酸的方法如下：取10 mL分散在氯仿中的量子點加入到100 mL的圓底燒瓶中，向溶液中加入2 mL巰基丙酸。獲得的反應(yīng)混合物加熱到60 oC 1

11、小時，冷卻至室溫。用離心機6000 rpm將包裹巰基丙酸的量子點離心分離出來，用氯仿純化兩次，最終溶解到10 mL pH= 8的二次水中，這樣就獲得了可溶于水的量子點。2.4制備 PAMAM dendrimer NCs/CdSe-CdS QD-DNA探針根據(jù)文獻(xiàn)31將樹枝狀納米簇準(zhǔn)備好。取200L 2mg/ml 的PAMAM 大分子， 通過加入200 L NHS-PEG-NHS (250 mM 溶解于 DMSO)交聯(lián)6個小時，未交聯(lián)上的聚合物通過多次洗滌清除。然后，向100 L 量子點溶液(pH=7.4 PBS)中加入0.1 M EDC (50 L) 和 0.025 M NHS (50 L)，

12、對量子點活化1小時。活化好的量子點溶液與樹枝狀納米簇溶液按照3:1的比例進(jìn)行混合，反應(yīng)至少2小時后，用離心機4000 rpm離心5分鐘。移去上清液，沉淀再次溶解到200 L PBS中。接著，將200 L 1.0 10-6 M 生物條碼DNA (bbc)-DNA和20 L 1.0 10-6 M 探針DNA加入到混合溶液中，溫和的攪拌，在37 oC下孵育過夜。2.5制備可溶性PDDA-CNTs碳納米管(CNTs)采用在硫酸和硝酸3:1的混合物中超聲攪拌3小時的化學(xué)方法制得。獲得的CNTs通過離心分離，用蒸餾水反復(fù)洗滌，直到pH值為7。將0.5 mg/mL CNTs 溶解于含0.5 M NaCl 的

13、0.25% PDDA 水溶液中，超聲30分鐘進(jìn)行分散，最終獲得均勻的黑色懸濁液。2.6制備用于DNA檢測的ECL傳感器用于ECL檢測DNA和細(xì)胞的dendrimer NCs/CdSe-CdS QD探針的制備原理和步驟如下圖:圖2-1 dendrimer NCs/CdSe-CdS QD探針的制備示意圖Figure 2-1 Schematic fabrication procedure of the dendrimer NCs/CdSe-CdS QD probe在砂紙上將金電極（直徑為4 mm） 用1.0-, 0.3- 和 0.05-m的-Al2O3拋光粉拋光，用二次蒸餾水沖洗后，進(jìn)行超聲處理。在

14、電極修飾之前，將裸金電極在0.5 M的硫酸溶液中，在電壓0.2 至 1.5 V之間進(jìn)行掃描，直到出現(xiàn)穩(wěn)定的、可重復(fù)的循環(huán)伏安峰為止。然后依次用無水乙醇、二次水徹底沖洗電極表面，并用氮氣吹干。接著，將電極沉浸于GNPs溶液中30分鐘。用氮氣吹干后，將電極沉浸在1.0 10-6 M 巰基修飾的 cDNA溶液中，室溫下過夜，然后在1 mM MCH溶液中沉浸1.5小時，來封住未被覆蓋的金電極表面，從而避免可能發(fā)生的非特異性結(jié)合。三明治式的雜交按照以下兩步進(jìn)行操作：首先，修飾了cDNA-的金電極在適當(dāng)濃度的tDNA溶液中37 C孵育1.5小時，用0.1 M PBS作為緩沖溶液。然后，將修飾了tDNA/c

15、DNA/Au的電極拿出來，沉浸在包含有dendrimer NCs-QDs探針的0.1 M PBS緩沖液中，37 C孵育1小時，這樣就得到了用tDNA制備的三明治結(jié)構(gòu)。在每一次雜交步驟后，電極都要用0.1 M PBS緩沖溶液進(jìn)行沖洗，除去非特異性吸附的序列，然后進(jìn)行ECL測量，檢測DNA的濃度。2.7 ECL 檢測將修飾好的電極放入到0.1 M K2S2O8 和 0.1 M KCl溶液的0.1 M PBS (pH 7.4)中，在0-1.5 V的電壓范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。測量ECL信號與DNA濃度的關(guān)系。2.8 MNPs-probe 生物復(fù)合物的制備首先，取20 L 的 Fe3O4Au MNPs加入到1

16、.5 mL微量離心管中，用500 L PBS緩沖溶液沖洗三次。第二，將MNPs分散到pH 為7.4的PBS緩沖溶液中，取50 L of 1.0 10-6 M巰基修飾的適體加入其中。巰基修飾的適體在加入到Fe3O4Au之前用TCEP (10 mM)活化1小時。在室溫下輕輕震蕩16小時后，適體-Fe3O4Au共軛物再在溶液(0.3 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.2)中老化24小時。多余的試劑用磁力架清除，接下來加入100 L dendrimers-QDs-DNA 探針溶液，37oC下孵育2小時即可得到MNPs-探針生物復(fù)合物。2.9細(xì)胞的電化學(xué)實驗MNPs-探針生物復(fù)合

17、物放到100 L含有不同數(shù)量細(xì)胞的PBS溶液中，室溫下孵育50分鐘。接著，從MNPs-探針生物復(fù)合物上解除的dendrimer NCs/QDs-探針通過磁力架從溶液中分離出來，用電化學(xué)的方法進(jìn)行檢測。向分離出來的量子點探針溶液中加入200 L 0.5 mol/L HNO3溶液?；旌?分鐘后，溶有Cd2+ 的溶液轉(zhuǎn)移到2.5 mL 0.1 M pH=5.3 HAC-NaAC 支持電解質(zhì)溶液中，溶液中含有1.810-4 M HgCl2。對照實驗方法相同，只是沒有目標(biāo)細(xì)胞。溶解Cd2+的溶出伏安測量在玻璃碳電極上原位合成的汞膜上完成（在混合均勻的HAC-NaAC緩沖溶液里），沉積電位-1.4 V，沉

18、積時間300 s。陽極溶出伏安法掃描在15秒間歇周期，-0.8 到 -0.5 V (vs. Ag/AgCl)之間完成（沒有攪拌），脈沖電壓50 mV，脈沖頻率50 ms。陽極溶出峰位于0.67 V，電流值是分析響應(yīng)信號。3.結(jié)果與討論3.1 PAMAM dendrimer nanocluster/CdSe-CdS QD-DNA probe的特性描述Figure 2-2顯示的是CdSe-CdS QDs的光致發(fā)光(PL)的光譜。PL的發(fā)射峰在628 nm (ex = 500 nm)，證明了量子限制效應(yīng)32。Figure 2B 顯示CdSe-CdS QDs的透射電鏡（TEM）圖片，CdSe-CdS

19、納米粒子的平均粒徑大約在10 nm。圖2-2 圖A為CdSe-CdS的熒光譜圖(PL)。圖B為CdSe-CdS的投射電鏡(TEM)圖。Figure 2-2 A showed the photoluminescence (PL) spectra of the CdSe-CdS QDs.B showed the transmission electron microscope (TEM) image of the CdSe-CdS QDs 圖2-1為dendrimers/QDs-DNA 探針的制備流程。在樹枝狀聚合物交聯(lián)成更大的納米簇后，CdSe-CdS 量子點共價結(jié)合到納米簇上33，接著氨基DN

20、A結(jié)合到量子點納米結(jié)構(gòu)上。制備的dendrimers NCs/QDs-DNA 探針的直徑大概在200 nm。343.2 Dendrimer 納米簇/QDs 的ECL行為圖2-3 dendrimer nanoclusters/QDs ECL-電壓曲線Figure 2-3 showed the ECLpotential curves of the dendrimer nanoclusters/QDs圖2-3 顯示的是dendrimer 納米簇/QDs ECL-電壓曲線。插圖是dendrimer 納米簇/QDs在電極上的循環(huán)伏安圖（CV），兩個陰極峰分別在0.83 V (C1) 和 1.27 V (

21、C2)處。在陰極掃描過程中，一個ECL峰出現(xiàn)在1.49 V處，是量子點與S2O82-的反應(yīng)的結(jié)果。下面為ECL的機理35。QD+e-QD-(1)S2O82-+e-SO42-+SO4-(2)QD-+SO4-QD*+SO42-(3)QD*QD+h(4)3.3 DNA檢測的ECL生物傳感器的制備和表征DNA的ECL生物傳感器的制作原理在圖2-4 (B)顯示。首先將PDDA-CNTs組裝到電極表面，帶負(fù)電的金納米粒子通過靜電吸附到PDDA-CNTs電極上。接著巰基修飾的適體DNA通過金納米粒子固定在電極上。在目標(biāo)DNA (t-DNA)與捕獲DNA部分雜交后，dendrimers nanocluster

22、s/QDs-DNA 信號探針與目標(biāo)DNA進(jìn)行三明治雜交。通過dendrimers-QDs 探針的ECL信號可定量目標(biāo)DNA的濃度。圖2-4 ECL生物傳感器的制作原理圖Figure 2-4 Schematic of the fabrication principle for ECL biosensing如圖2-4 B，利用電化學(xué)阻抗譜(EIS)表征DNA傳感器的制備程序。對PDDA-CNTs/Gold NPs修飾的金電極，得到一條接近直線的阻抗圖(curve a)，說明PDDA-CNTs和Gold NPs都是極好的導(dǎo)電性材料。然后，電極組裝了c-DNA，并且用MCH進(jìn)行了封板，得到一個大界面的

23、電極阻抗圖(curve b)。隨后，t-DNA 與 c-DNA進(jìn)行雜交，得到一個更大的阻抗圖(curve c)。在t-DNA與dendrimers/QDs-DNA 信號探針進(jìn)一步識別結(jié)合后，阻抗變得更大。這些結(jié)果說明傳感器組裝成功。圖2-5 DNA傳感器組裝過程的電化學(xué)阻抗譜(EIS)Figure 2-5 electrochemical impedance spectroscopy (EIS) of the fabrication process of the DNA biosensor圖2-6電極在不同的組裝階段典型的SEM圖Figure 2-6 the typical SEM images

24、 of the electrode at different immobilization stagesSEM為ECL傳感器的組裝成功提供了進(jìn)一步的證據(jù)。圖2-6展示的就是電極在不同的組裝階段典型的SEM圖。可以觀察到，PDDA-CNTs大部分是以小束或者單管的形式組裝在電極上(A)。相比之下，在金納米粒子組裝到電極上之后，能夠觀察到形貌的明顯不同(B)。圖2-6 C展示的是組裝到電極上的捕獲DNA的表面形貌，像有一層薄霧分散在表面。最后，在dendrimer /QDs-DNA信號探針與tDNA雜交后，在電極表面能夠看到很多小的納米粒子和更明顯的薄霧，這說明ECL生物傳感器成功組裝。3.4 D

25、NA檢測的ECL生物傳感器圖2-7 A 顯示的是DNA傳感器對應(yīng)不同濃度的t-DNA時的ECL信號。在最優(yōu)條件下，ECL信號隨目標(biāo)DNA濃度的增大而增大，在0.01到10 pmol L-1范圍內(nèi)，ECL信號的變化與目標(biāo)DNA濃度的對數(shù)成線性關(guān)系 (圖2-7 B)。檢測限為3.2 fmol L-1。與其它沒有信號放大的電化學(xué)方法相比36，該方法顯示了更低的檢測限，比一些放大技術(shù)更優(yōu)越37。圖2-7（A）DNA傳感器對應(yīng)不同濃度的t-DNA時的ECL信號。（B）DNA檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 2-7 (A) ECL signals of the DNA biosensor that were r

26、esponsive to different t-DNA concentrations. (B) Standard curve for DNA detection通過將dendrimer nanoclusters/QDs-DNA探針分別與完全互補的tDNA、個別不匹配的DNA和完全不匹配的DNA序列雜交來研究DNA傳感器的選擇性。個別不匹配序列的ECL信號明顯比完全互補序列的信號弱，而且完全不匹配的序列沒有反應(yīng)。結(jié)果證明DNA傳感器具有好的選擇性。圖 2-8 生物傳感器對不同DNA序列的ECL響應(yīng)(0.01 pM) ：(a)目標(biāo)互補DNA ，(b) 單堿基不匹配的DNA, (c) 完全錯配的D

27、NA。（空白已扣除）Figure 2-8. ECL responses of the biosensor for different DNA sequences (0.01 pM). (a) The complementary target DNA, (b) single-base mismatched DNA, (c) completely mismatched DNA. The blank was deducted.3.5基于Fe3O4Au-aptamer and dendrimer nanoclusters/QDs信號探針的癌細(xì)胞的電化學(xué)檢測圖2-9 C 檢測目標(biāo)細(xì)胞的原理圖Figure

28、 2-9. Schematic of the fabrication principle for detection of target cells進(jìn)一步用dendrimer nanoclusters/QDs 做為信號探針，通過電化學(xué)技術(shù)檢測癌細(xì)胞。檢測目標(biāo)細(xì)胞的制作原理見圖2-9 C。首先在Fe3O4-Au 磁性納米粒子表面連接巰基修飾的適體，然后加入dendrimer/QDs-DNA信號探針，與適體進(jìn)行雜交。在有目標(biāo)細(xì)胞存在時，由于細(xì)胞與適體的識別作用，雙鏈適體/DNA解鏈，dendrimer/QDs-DNA探針從磁性納米粒子上釋放出來。釋放的dendrimer/QDs-DNA通過磁力從混

29、合物中分離出來。通過高靈敏的溶出伏安法(ASV)，依據(jù)量子點溶解的Cd2+的電化學(xué)信號，可定量目標(biāo)細(xì)胞的濃度。圖2-10 (A) 通過ASV 技術(shù)檢測細(xì)胞的電化學(xué)響應(yīng)。細(xì)胞濃度為: (a) 0, (b)160, (c) 320, (d) 640, (e) 960, (f) 1920, (g) 3840, (h) 7680, (i) 15360 cells mL-1. (B) 通過ASV 技術(shù)檢測細(xì)胞的校正曲線，細(xì)胞濃度為: 160, 320, 640, 960, 1920, 3840, 7680, 15360 cells mL-1。Figure 2-10 (A) Electrochemical

30、 responses for detection of cells by ASV technique. The concentrations of cells: (a) 0, (b)160, (c) 320, (d) 640, (e) 960, (f) 1920, (g) 3840, (h) 7680, (i) 15360 cells mL-1. (B) Calibration curves plotted on a logarithm scale for detection of cells by ASV technique. The concentrations of cells: 160

31、, 320, 640, 960, 1920, 3840, 7680, 15360 cells mL-1.圖2-10 (A)顯示的是對應(yīng)不同濃度目標(biāo)細(xì)胞的脈沖伏安信號。在最優(yōu)條件下，脈沖伏安峰大約在0.69V，峰電流隨細(xì)胞濃度的增加逐漸增加，證明該方法可以確定細(xì)胞濃度。細(xì)胞檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線在圖2-9(B)，在160 到 15360 cells mL-1范圍內(nèi)，峰電流的變化與細(xì)胞濃度的對數(shù)成正比，相關(guān)系數(shù)R為0.992?；貧w方程為I (A) = -66.33 + 33.798 LogC,I為電流強度，C為細(xì)胞濃度(cell mL-1)。通過重復(fù)測量5組320 cells mL-1的細(xì)胞，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為7.2，說明該方法具有良好的重現(xiàn)性。細(xì)胞濃度的檢測限為89 cells mL-1。為準(zhǔn)確評價該檢測細(xì)胞的ASV方法技術(shù)，用CEM對照細(xì)胞進(jìn)行了控制實驗。相同細(xì)胞濃度(960 cells mL-1)的條件下，重復(fù)相同的方法，和無細(xì)胞的空白實