細胞計數(shù)及觀察

1、細胞培養(yǎng)（四）細胞培養(yǎng)（四） 暨暨 南南 大大 學學 醫(yī)醫(yī) 學學 院院 生物化學教研室生物化學教研室 費費 嘉嘉細胞培養(yǎng)的應用價值細胞培養(yǎng)是生命科學研究中常用的、基本的技術(shù)細胞培養(yǎng)是生命科學研究中常用的、基本的技術(shù) 體外細胞培養(yǎng)使長時間直接觀察活細胞的形態(tài)結(jié)體外細胞培養(yǎng)使長時間直接觀察活細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動的動態(tài)過程，故可用于細胞學、遺構(gòu)和生命活動的動態(tài)過程，故可用于細胞學、遺傳學、免疫學、實驗醫(yī)學和腫瘤學等多種學科的傳學、免疫學、實驗醫(yī)學和腫瘤學等多種學科的研究工作；研究工作； 該方法能排除神經(jīng)體液因素的影響及肝腎解毒功該方法能排除神經(jīng)體液因素的影響及肝腎解毒功能的干擾，觀察某些因素和藥

2、物對培養(yǎng)細胞的直能的干擾，觀察某些因素和藥物對培養(yǎng)細胞的直接作用。接作用。 節(jié)約經(jīng)費節(jié)約經(jīng)費 可生產(chǎn)生物制品、單克隆抗體和基因工程可生產(chǎn)生物制品、單克隆抗體和基因工程制品等多種產(chǎn)品制品等多種產(chǎn)品 細胞培養(yǎng)方法的缺點 培養(yǎng)細胞失去體內(nèi)細胞的制約和整體的調(diào)節(jié)作用，培養(yǎng)細胞失去體內(nèi)細胞的制約和整體的調(diào)節(jié)作用，細胞形態(tài)和功能會發(fā)生一定程度的改變。細胞形態(tài)和功能會發(fā)生一定程度的改變。 培養(yǎng)方法、試劑對細胞形態(tài)和功能有一定影響。培養(yǎng)方法、試劑對細胞形態(tài)和功能有一定影響。 長期體外培養(yǎng)細胞，由于反復傳代、凍存和操作長期體外培養(yǎng)細胞，由于反復傳代、凍存和操作等因素的影響，可能發(fā)生染色體非整倍體改變，等因素的影

3、響，可能發(fā)生染色體非整倍體改變，呈永生化或癌變的特征。呈永生化或癌變的特征。細胞計數(shù)細胞計數(shù)細胞生長狀況的觀察細胞生長狀況的觀察- - 細胞數(shù)目測定技術(shù)細胞數(shù)目測定技術(shù) 原理：計數(shù)室的邊長為原理：計數(shù)室的邊長為1 1mmmm，中間平臺下陷中間平臺下陷0.10.1mmmm，蓋上蓋片后計數(shù)室的容積為蓋上蓋片后計數(shù)室的容積為 0.1 0.1mmmm3 3。根根據(jù)在顯微鏡下觀察到的細胞數(shù)目，換算成單位體據(jù)在顯微鏡下觀察到的細胞數(shù)目，換算成單位體積中細胞的數(shù)量，以細胞數(shù)積中細胞的數(shù)量，以細胞數(shù)/ /毫升表示毫升表示 。 實驗程序：實驗程序： 制備樣品制備樣品 取懸浮細胞或細胞懸液，稀釋取懸浮細胞或細胞懸

4、液，稀釋到一定比例。到一定比例。檢查記數(shù)板檢查記數(shù)板 （1 1） 擦洗擦洗 （2 2） 沖洗沖洗 （3 3） 鏡檢鏡檢 加樣加樣 先將蓋玻片安放在計數(shù)室上面，然后搖先將蓋玻片安放在計數(shù)室上面，然后搖勻樣品取懸液，從蓋玻片邊緣滴加細胞懸液，勻樣品取懸液，從蓋玻片邊緣滴加細胞懸液，連續(xù)連續(xù)2323次，直至充滿計數(shù)板和蓋玻片間的次，直至充滿計數(shù)板和蓋玻片間的空隙?？障?。Freshney) 計數(shù)計數(shù) （1 1） 找計數(shù)室找計數(shù)室 在低倍顯微鏡下尋找計數(shù)板在低倍顯微鏡下尋找計數(shù)板上的大方格網(wǎng)位置。上的大方格網(wǎng)位置。（2 2） 轉(zhuǎn)高倍鏡轉(zhuǎn)高倍鏡 使細胞和計數(shù)室線條均清晰使細胞和計數(shù)室線條均清晰為止。然后將

5、計數(shù)室一角的中格移至視野中。為止。然后將計數(shù)室一角的中格移至視野中。（3 3）計數(shù)）計數(shù) 計算計數(shù)板的四角大格內(nèi)的細胞數(shù)，計算計數(shù)板的四角大格內(nèi)的細胞數(shù)，壓線者只計算左側(cè)和上方的，右和下的不計算壓線者只計算左側(cè)和上方的，右和下的不計算在內(nèi)。在內(nèi)。 （4 4） 清洗清洗 細胞數(shù)計算公式：細胞數(shù)計算公式：細胞數(shù)細胞數(shù)/ /毫升培養(yǎng)液毫升培養(yǎng)液 = = 注意事項注意事項： 1 1、 加液時勿使液體漫過蓋玻片或出現(xiàn)氣泡。加液時勿使液體漫過蓋玻片或出現(xiàn)氣泡。 2 2、 鏡下計數(shù)，有時偶爾有兩個以上細胞組成鏡下計數(shù)，有時偶爾有兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算。的細胞團，應按單個細胞計算。 3 3

6、、 如細胞團占如細胞團占10%10%以上，說明消化不充分，以上，說明消化不充分，或細胞數(shù)少于或細胞數(shù)少于200200個個/10/10平方毫米或多于平方毫米或多于500500個個/10/10平方毫米時，均說明稀釋不當，需重新置備細胞平方毫米時，均說明稀釋不當，需重新置備細胞懸液，再重新計數(shù)。懸液，再重新計數(shù)。 Hand Tally Counter 培養(yǎng)細胞一代生存期培養(yǎng)細胞一代生存期 所謂細胞“一代”一詞，系僅指從細胞接種并培養(yǎng)一段時間，直到下次傳代。這已成為培養(yǎng)工作中的一種習慣說法。 如某一細胞系為第153代細胞，即指該細胞系已傳代153次。 細胞一代與細胞世代（Generation）或倍增D

7、oubling不同，在細胞一代中，細胞能倍增36次。 細胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下三個階段： 1潛伏期 2指數(shù)增生期 3停滯期1 1潛伏期（潛伏期（Latent PhaseLatent Phase） 細胞接種培養(yǎng)后，先經(jīng)過一個在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時細胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。 接著是細胞附著或貼附于底物表面上，稱貼壁期，懸浮期結(jié)束。 細胞貼壁后，還需要經(jīng)過一個潛伏階段，才進入生長和增殖期，這一階段稱為細胞潛伏期。 細胞處在潛伏期時，可有運動活動，但基本無增殖，分裂相鮮見。 當細胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時，標志細胞已進入指數(shù)增生期。 細胞潛伏期與細胞接種密度、細胞種類和培養(yǎng)基性質(zhì)等

8、密切相關(guān)。v初代培養(yǎng)細胞潛伏期長，約2496小時或更長，連續(xù)細胞系和腫瘤細胞潛伏期短，僅624小時。v細胞接種密度大時潛伏期短。 這是細胞增值最旺盛的階段，細胞分裂相增多。 指數(shù)增生期細胞分裂相數(shù)量可作為判定細胞生長旺盛與否的一個重要標志。 一般以細胞分裂指數(shù)（Mitotic Index：MI）表示，即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數(shù)。 體外培養(yǎng)細胞分裂指數(shù)受細胞種類、培養(yǎng)液成分、pH、培養(yǎng)箱溫度等多種因素的影響。v一般細胞的分裂指數(shù)介于0.1%0.5%，初代細胞分裂指數(shù)低，連續(xù)細胞和腫瘤細胞分裂指數(shù)可高達3%5%。vpH和培養(yǎng)液血清含量變動對細胞分裂指數(shù)有很大影響。 指數(shù)增生期是細胞一代

9、中活力最好的時期，因此是進行各種實驗最好的和最主要的階段。 在接種細胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)35天后，隨細胞數(shù)量不斷增多、生長空間漸趨減少、最后細胞相互接觸匯合成片。細胞接觸抑制（細胞接觸抑制（Contact InhibitionContact Inhibition） 細胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細胞，由于細胞的相互接觸能抑制細胞的運動，這種現(xiàn)象稱接觸抑制。 惡性細胞無接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)別正常與癌細胞標志之一。細胞密度抑制（細胞密度抑制（Density InhibitionDensity Inhibition） 腫瘤細胞由于無接觸抑制能繼續(xù)移動和增殖，導致細胞向三維空

10、間擴展，使細胞發(fā)生堆積。 細胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營養(yǎng)充分，細胞仍然能夠進行增殖分裂，因此細胞數(shù)量仍在增多。 當細胞密度進一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，細胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制，導致細胞分裂停止。3 3停滯期（停滯期（Stagnate PhaseStagnate Phase） 細胞數(shù)量達飽和密度后，細胞遂停止增殖，進入停滯期。此時細胞數(shù)量不再增加，故也稱平頂期（Plateau）。 停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時需做分離培養(yǎng)即傳代，并且傳代應越早越好。細胞生長相關(guān)指標 細胞群體倍增

11、時間細胞群體倍增時間:在對數(shù)生長期，在對數(shù)生長期，細胞數(shù)量增加一倍的時間 TD=t*log2/(logNt-logNo) 細胞分裂指數(shù)細胞分裂指數(shù)(MI)：1000個細胞中細胞分裂相的數(shù)目二、細胞傳代二、細胞傳代 -將培養(yǎng)的細胞分散后，從一個容器以適將培養(yǎng)的細胞分散后，從一個容器以適當比率轉(zhuǎn)移到另一個或幾個容器中擴大培當比率轉(zhuǎn)移到另一個或幾個容器中擴大培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。 傳代培養(yǎng)的累積次數(shù)就是細胞的代數(shù)。傳代培養(yǎng)的累積次數(shù)就是細胞的代數(shù)。一）、懸浮細胞的傳代培養(yǎng)一）、懸浮細胞的傳代培養(yǎng)步驟：步驟： 1 1輕輕振蕩培養(yǎng)液，懸起細胞，后倒出輕輕振蕩培養(yǎng)液，懸起細胞，后倒出/ /

12、吸出細吸出細胞培養(yǎng)液胞培養(yǎng)液 2. 10002. 1000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/ /分離心分離心5-105-10minmin，棄去培養(yǎng)基。棄去培養(yǎng)基。 3. 3. 加入新鮮的培養(yǎng)基，重懸細胞沉淀，細胞懸液加入新鮮的培養(yǎng)基，重懸細胞沉淀，細胞懸液計數(shù)，取適量細胞懸液加到新培養(yǎng)液中，置計數(shù)，取適量細胞懸液加到新培養(yǎng)液中，置3737孵箱中培養(yǎng)。孵箱中培養(yǎng)。二二) )、貼壁細胞的傳代培養(yǎng)、貼壁細胞的傳代培養(yǎng)步驟：步驟： 1 1 倒去細胞培養(yǎng)液。倒去細胞培養(yǎng)液。 2 2 清洗清洗 PBSPBS 3 3 消化消化 0.25% 0.25%胰蛋白酶胰蛋白酶 4 4 終止消化終止消化 細胞培養(yǎng)液（含血清）細胞培養(yǎng)液（含血清）

13、5. 5. 離心收集細胞離心收集細胞 500 1000 500 1000 rpmrpm 6. 6. 傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng) 5 510105 5細胞細胞/ /mlml消消 化化 在光學顯微鏡下觀察，當細胞變圓，細胞與細胞在光學顯微鏡下觀察，當細胞變圓，細胞與細胞間互不相聯(lián)，表明消化時間已到。如細胞仍連成間互不相聯(lián)，表明消化時間已到。如細胞仍連成片，表明消化時間未到。片，表明消化時間未到。 翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，肉眼觀察細胞單層，見細胞單層薄翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，肉眼觀察細胞單層，見細胞單層薄膜出現(xiàn)針孔大小空隙時即可傾去消化液。膜出現(xiàn)針孔大小空隙時即可傾去消化液。 如見大量細胞片狀脫落，已消化過頭，則不能傾如見大量細胞片

14、狀脫落，已消化過頭，則不能傾倒消化液而直接進行下一步操作。倒消化液而直接進行下一步操作。二、活細胞的觀察二、活細胞的觀察 細胞活力細胞活力 - - 在細胞群體中活細胞所占的百分比叫在細胞群體中活細胞所占的百分比叫做細胞活力做細胞活力v由組織中分離細胞一般也要檢查活力，以了解由組織中分離細胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細胞是否有損傷作用。分離的過程對細胞是否有損傷作用。v復蘇后的細胞也要檢查活力，了解凍存和復蘇復蘇后的細胞也要檢查活力，了解凍存和復蘇的效果。的效果。 ( (一一) )臺盼蘭染色操作步驟：臺盼蘭染色操作步驟： 1 1、制備細胞懸液。制備細胞懸液。2 2、以、以1 1：1 1

15、的比例加入的比例加入0.4%0.4%臺盼蘭染液，染色臺盼蘭染液，染色2 2一一3 3分鐘。分鐘。3 3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。4 4、鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞、鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數(shù)，計算細胞活力。數(shù)，計算細胞活力。 死細胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深死細胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈蘭色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。無色透明狀。 ( (二二) )染色法染色法原理：利用活原生質(zhì)體有選擇吸收外界物質(zhì)原理：利用活原生質(zhì)體有選擇吸收外界物質(zhì)的特性，用染料處理時，活原生質(zhì)體

16、不吸收染的特性，用染料處理時，活原生質(zhì)體不吸收染料，細胞未染上顏色，而死細胞立即吸附大量料，細胞未染上顏色，而死細胞立即吸附大量染料而染上顏色。染料而染上顏色。細胞活力（細胞活力（%）= = 未染色的細胞數(shù)未染色的細胞數(shù)/ /觀察的細胞總觀察的細胞總數(shù)數(shù) 100 100（三）相差顯微鏡直接觀察法（三）相差顯微鏡直接觀察法 相差顯微鏡（相差顯微鏡（phasecontrast microscopephasecontrast microscope）由由P PZernikeZernike于于19321932年發(fā)明，并因此獲年發(fā)明，并因此獲19531953年諾年諾貝爾物理獎。貝爾物理獎。 這種顯微鏡最大

17、的特點是可以觀察未經(jīng)染色這種顯微鏡最大的特點是可以觀察未經(jīng)染色的標本和活細胞。的標本和活細胞。 基本原理：把透過標本的可見光的光程差變成基本原理：把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。 操作方法：直接將培養(yǎng)的細胞（細胞培養(yǎng)瓶、操作方法：直接將培養(yǎng)的細胞（細胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿）放置在相差顯微鏡的光路中，即可直培養(yǎng)皿）放置在相差顯微鏡的光路中，即可直接觀察。接觀察。 相差顯微鏡觀察注意事項：相差顯微鏡觀察注意事項：v1 1、培養(yǎng)器皿質(zhì)量過關(guān)、培養(yǎng)器皿質(zhì)量過關(guān) v2 2、原代培養(yǎng)的細胞或

18、將要傳代的細胞進行相、原代培養(yǎng)的細胞或?qū)⒁獋鞔募毎M行相差顯微鏡觀察和照相時，最好在換液后進行。差顯微鏡觀察和照相時，最好在換液后進行。v3 3、無菌觀念、無菌觀念 （四）（四）MTTMTT法法 原理：活細胞中的琥珀酸脫氫酶能將原理：活細胞中的琥珀酸脫氫酶能將MTTMTT還原還原成不溶于水的藍色產(chǎn)物成不溶于水的藍色產(chǎn)物-甲臜，并沉淀在細甲臜，并沉淀在細胞中，其量與細胞數(shù)呈正比，也與細胞活力呈胞中，其量與細胞數(shù)呈正比，也與細胞活力呈正比。但死細胞沒有這一功能。正比。但死細胞沒有這一功能。- - 區(qū)分活細胞和死細胞。區(qū)分活細胞和死細胞。 DMSODMSO能溶解沉積在細胞中的藍色結(jié)晶，溶能溶解沉積在細胞中的藍色結(jié)晶，溶液顏色的深淺與所含的甲臜的量成正比。液顏色的深淺與所含的甲臜的量成正比。- - 廣泛用于新藥篩選、細胞毒性實驗、腫瘤廣泛用于新藥篩選、細胞毒性實驗、腫瘤放射敏感性實驗等。放射敏感性實驗等。 MTTMTT法操作步驟：法操作步驟： l l、配制配制MTTMTT溶液。溶液。2 2、