園藝植物生物技術(shù)課后習(xí)題答案

1、第一章至第五章一、 主要名詞和概念：一1.  植物細(xì)胞全能性：植物體的每一個(gè)具有完整細(xì)胞核的細(xì)胞都具有該物種全部遺傳物質(zhì)，在一定條件下具有發(fā)育成為完整植物體的潛在能力。2. 脫分化：將已分化的不分裂的靜止細(xì)胞放在培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，細(xì)胞重新進(jìn)去分裂狀態(tài)，一個(gè)成熟細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚鸂顟B(tài)的過(guò)程。3. 再分化：經(jīng)脫分化的組織或細(xì)胞在一定的培養(yǎng)條件下可轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N不同的細(xì)胞類型，形成完整植株的過(guò)程。4. 器官發(fā)生途徑：由外植體或愈傷組織誘導(dǎo)形成不定根或不定芽，再獲得再生植株的方法5. 體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑：在組織培養(yǎng)中起源于一個(gè)非合子細(xì)胞，經(jīng)過(guò)胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過(guò)程，形成具有雙極性的胚狀結(jié)構(gòu)而發(fā)育成再生

2、植株的途徑。6. 外植體：由活體植物體上切去下來(lái)的，用于組織培養(yǎng)的各種接種材料。包括各種器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體等。7. 褐化現(xiàn)象：指在外植體誘導(dǎo)初分化或再分化過(guò)程中，自身組織從表面想培養(yǎng)基釋放褐色物質(zhì)以至培養(yǎng)基逐漸變成褐色，外植體也隨之進(jìn)一步變褐而死亡的現(xiàn)象。8. 看護(hù)培養(yǎng)：利用活躍生長(zhǎng)的愈傷組織來(lái)看護(hù)單個(gè)細(xì)胞，使其持續(xù)分裂和增殖的培養(yǎng)方法。9. 分批培養(yǎng)；把細(xì)胞分散在一定容積的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)物增值到一定量時(shí)，轉(zhuǎn)接繼代，建立起單細(xì)胞培養(yǎng)物。10. 連續(xù)培養(yǎng)：利用特質(zhì)的培養(yǎng)容器進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的一種培養(yǎng)方式。11. 體細(xì)胞雜交：使分離出來(lái)的不同親本的原生質(zhì)體，在人工控制條件下，相互融

3、合成一體，形成雜種細(xì)胞，并進(jìn)一步發(fā)育成雜種植株的技術(shù)。12. 雄核發(fā)育：在適宜的離體培養(yǎng)條件下，花粉（小孢子）的發(fā)育可偏離活體時(shí)的正常發(fā)育轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育，經(jīng)胚狀體途徑或器官發(fā)生途徑形成完整植株。13. 雌核發(fā)育：以未受精子房或胚珠為外植體誘導(dǎo)單倍體的方法。14. 非整倍體：生物體的核內(nèi)染色體數(shù)不是染色體基數(shù)整數(shù)倍，而發(fā)生個(gè)別染色體數(shù)目增減的生物體。15. 代換系：生物體的染色體被異源種屬染色體所代換的品系。16. 易位系：某染色體的一個(gè)區(qū)段移接在非同源的另一個(gè)染色體上，具有發(fā)生染色體易位的品種。17. 附加系：將同種或異種的染色體導(dǎo)入受體中，叫做染色體附加。具有附加染色體的品種或品系叫附加系。

4、18. 限制生長(zhǎng)保存：改變培養(yǎng)物生長(zhǎng)的外界環(huán)境條件，限制離體保存材料的生長(zhǎng)速度，使細(xì)胞生長(zhǎng)至最小限度，但不死亡，從而達(dá)到延長(zhǎng)繼代培養(yǎng)的目的。19. 超低溫保存：指在-80（干冰溫度）至-196（液氮溫度）甚至更低溫度下保存生物材料。20. 體細(xì)胞無(wú)性系變異：將植物外植體在組織培養(yǎng)過(guò)程中，由于受到非生物因子的誘導(dǎo)發(fā)生變異，進(jìn)而導(dǎo)致再生植株發(fā)生遺傳變異的現(xiàn)象。二、 各章需掌握的主要內(nèi)容1. 植物組織培養(yǎng)的類型有哪些？（1） 按照外植體類型：胚胎培養(yǎng)；器官培養(yǎng)；組織培養(yǎng)；細(xì)胞培養(yǎng)；原生質(zhì)體培養(yǎng)（2） 按照培養(yǎng)基性質(zhì)：固體培養(yǎng)；液體培養(yǎng)；（3） 按照培養(yǎng)方法： 精制培養(yǎng)；震蕩培養(yǎng)；看護(hù)培養(yǎng)；飼喂培養(yǎng)；

5、微室培養(yǎng)2.植株再生途徑主要有哪些？（1）經(jīng)由成愈傷組織再生植株；（2）經(jīng)由胚狀體再生植株3.完整的植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室包括哪些部分？每一部分具有哪些功能？需要配備哪些儀器設(shè)備？自己能獨(dú)立設(shè)計(jì)一個(gè)組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室。（1） 準(zhǔn)備室，接種室，培養(yǎng)室（2） A：準(zhǔn)備室配置培養(yǎng)基B：接種室采用無(wú)菌操作把材料接種到培養(yǎng)基上C：培養(yǎng)室在無(wú)菌和適宜的培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。4.培養(yǎng)基的組成成分包括哪些？常用的植物激素和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有哪些？需掌握化學(xué)名稱和縮寫符號(hào)。（1） 無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)，有機(jī)營(yíng)養(yǎng)，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，糖類，水，瓊脂（2） 生長(zhǎng)素AUX，細(xì)胞分裂素CTK，赤霉素GA，脫落酸ABA5.莖尖培養(yǎng)的概念，以種苗繁殖為

6、目的的莖尖培養(yǎng)包括哪些階段？各階段對(duì)培養(yǎng)基條件有哪些要求？（1） 莖尖培養(yǎng)：把莖尖分生組織或包括此分生組織的莖尖分離進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)。（2） 無(wú)菌培養(yǎng)體系的建立芽的增殖中間繁殖體的增殖誘導(dǎo)生根試管苗的移植（3） 一般用MS培養(yǎng)基，之后根據(jù)發(fā)育方向配制培養(yǎng)基6.莖尖分生組織培養(yǎng)脫毒的原理是什么？影響脫毒效果的主要因素有哪些？病毒檢測(cè)方法有哪些？其他脫毒方法還有哪些？（1） 感染病毒后，植株體內(nèi)病毒的分布并不均勻，病毒的數(shù)量隨植株部位及年齡而異，越靠近經(jīng)頂端的區(qū)域，病毒感染率越低，生長(zhǎng)點(diǎn)則幾乎不含或含病毒很少。（2） 莖尖大小，取穗大小，取樣時(shí)間，溫度，持續(xù)時(shí)間，濕度和光照，前處理（3） 莖尖培養(yǎng)脫毒

7、，微體嫁接脫毒，熱處理脫毒（4） 花器官等培養(yǎng)脫毒，珠心胚培養(yǎng)脫毒，合并使用熱處理、莖尖培養(yǎng)或微莖尖嫁接脫毒7.種苗離體快繁中污染發(fā)生的原因主要有哪些？如何控制污染的發(fā)生？（1） A：材料內(nèi)部滅菌處理不好B：正常滅菌條件下，內(nèi)生菌能夠存活C：來(lái)自寄生植物的污染D：培養(yǎng)基中材料超過(guò)一塊相互污染（2） A：嚴(yán)格保證無(wú)菌操作的規(guī)范性，對(duì)培養(yǎng)基接種工具及接種室的嚴(yán)格消毒處理B：抗生素對(duì)細(xì)菌操作污染的防治C：真菌污染的防治D：常用防治污染方法8.原生質(zhì)體分離中材料預(yù)處理方法有哪些？原生質(zhì)體分離常用的酶類有哪些？原生質(zhì)體如何分離和如何純化？原生質(zhì)體培養(yǎng)方法有哪些？（1） 低溫處理；等滲溶液處理（2） 纖維

8、素酶；半纖維素酶；果膠酶；崩潰酶（3） A：分離：取材酶液配制酶解處理使酶解后的混合物穿過(guò)鎳絲網(wǎng)B：純化：離心法：利用比重原理，低速離心使原生質(zhì)體沉于底部 漂浮法：根據(jù)原生體與細(xì)胞碎片或細(xì)胞器比重的不同來(lái)分離原生質(zhì)體 界面法：采用兩種不同密度的溶液，離心后使完整的原生質(zhì)體處在兩液相的界面（4） 平板培養(yǎng)法；看護(hù)培養(yǎng)法；微室培養(yǎng)法；液體淺層培養(yǎng)法；固-液體雙層培養(yǎng)法9.原生質(zhì)體融合方法有哪些？雜種細(xì)胞如何篩選？（1） A：化學(xué)誘導(dǎo)融合：鹽類融合法；高pH高鈣離子法；PEG法B：物理誘導(dǎo)融合：顯微操作；離心震蕩；激光照射；電融合（2） A：顯微篩選技術(shù)：熒光染料標(biāo)記，異硫氰酸熒光素（發(fā)綠色熒光），

9、堿性蕊香紅熒 光素（發(fā)紅色熒光）B：互補(bǔ)選擇法：利用兩個(gè)親本具有不同的遺傳和生理特征，在特定培養(yǎng)條件下，只有發(fā)生互補(bǔ)作用的雜種細(xì)胞才能生長(zhǎng)的選擇方法C：遺傳標(biāo)記篩選技術(shù)：基因互補(bǔ)篩選，利用隱性非等位基因互補(bǔ)篩選體細(xì)胞雜種10.離體小孢子發(fā)育(雄核發(fā)育)途徑有哪些？花粉分離方法有哪些？影響花藥和花粉培養(yǎng)的主要因素有哪些？培養(yǎng)適宜時(shí)期是哪個(gè)時(shí)期？預(yù)處理方法有哪些？（1） 小孢子發(fā)育途徑；營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育途徑；生殖細(xì)胞發(fā)育途徑；生殖細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞共同發(fā)育途徑（2） 花粉漂浮自然釋放法；人工擠壓法；機(jī)械法（3） 供體植株基因型；小孢子發(fā)育時(shí)期；供體植株生理狀態(tài)；預(yù)處理；培養(yǎng)及成分；培 養(yǎng)條件；接種密度和方

10、向（4） 一般來(lái)說(shuō)是小孢子發(fā)育到單核期左右（第一次有絲分裂前）（5） 低溫；熱激；化學(xué)藥劑；高滲透壓；離心11.植物染色體加倍方法有哪些？化學(xué)方法誘導(dǎo)加倍常用試劑有哪些？影響加倍的因素包括哪些？多倍體鑒定方法有哪些？（1） 機(jī)械損傷；各種射線；高速離心；異常溫度（2） 秋水仙素；氨磺靈；氟樂(lè)靈（3） 外植體；加倍劑類型；加倍劑濃度和處理時(shí)間；加倍劑的加入時(shí)間；助劑（4） A：形態(tài)學(xué)鑒定：各自獨(dú)特的外觀B：細(xì)胞學(xué)鑒定：染色體計(jì)數(shù)法C：生理生化鑒定：各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量、酶活性的測(cè)定D：分子生物學(xué)鑒定：分子原位雜交；分子標(biāo)記12.限制生長(zhǎng)保存方法有哪些？超低溫保存的基本程序是什么？（1） 低溫保存；

11、干燥保存；生長(zhǎng)抑制保存；高滲透壓保存（2） 材料準(zhǔn)備預(yù)處理冷凍處理冷凍儲(chǔ)存解凍再培養(yǎng)13.體細(xì)胞無(wú)性系變異的來(lái)源有哪些？無(wú)性系變異的發(fā)生與哪些因素有關(guān)？（1） A：外植體細(xì)胞中預(yù)先存在而在再生植株中表現(xiàn)出來(lái)的變異；B：組織培養(yǎng)過(guò)程中誘導(dǎo)產(chǎn)生的變異（2） A：染色體數(shù)目變異：整倍型變異；非整倍型變異B：體細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)變異C：基因突變：核基因突變；細(xì)胞質(zhì)基因突變D：轉(zhuǎn)座因子的活化：轉(zhuǎn)座因子的激活也是導(dǎo)致植物體細(xì)胞無(wú)性系高頻率變異的主要原因之一。轉(zhuǎn)座因子是指能在基因組中移動(dòng)和修飾基因表達(dá)的DNA序列E：DNA甲基化狀態(tài)的改變第六章 園藝植物的染色體工程1.園藝植物單倍體制備有哪些途徑？答：（1）雄

12、配子途徑。采用花藥培養(yǎng)或花粉培養(yǎng)，使小孢子改變?cè)瓉?lái)的配子體發(fā)育途徑，轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育途徑，形成花粉胚或花粉愈傷組織，最后形成花粉植株，從中鑒定出單倍體植株并使之加倍成純合二倍體。（2）雌配子途徑。使園藝植物的胚囊中具有單倍性染色體構(gòu)成的細(xì)胞，如未受精的子房或胚珠，在適當(dāng)?shù)臈l件下發(fā)育成單倍體植株。2.離體條件下，雄（雌）核發(fā)育各有哪些發(fā)育途徑？答：雄核：（1）小孢子發(fā)育途徑 （2）營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育途徑 （3）生殖細(xì)胞發(fā)育途徑 （4）生殖細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞共同發(fā)育途徑。雌核：（1）助細(xì)胞或胚囊的無(wú)配子生殖產(chǎn)生單倍體 （2）卵細(xì)胞、助細(xì)胞和反足細(xì)胞發(fā)育產(chǎn)生單倍體 （3）非正常發(fā)育的大孢子四分體產(chǎn)生單倍體。3.

13、試述花藥（花粉）培養(yǎng)的全過(guò)程及主要影響因素。答：基本程序應(yīng)包括外植體選擇、預(yù)處理、表面滅菌、接種、培養(yǎng)、再生植株、單倍體植株鑒定、染色體加倍及獲得純合二倍體等步驟。影響因素：（1） 供體植株基因型。（2） 小孢子發(fā)育時(shí)期。一般來(lái)說(shuō)單核期最適合。（3） 供體植株的生理狀態(tài)。內(nèi)源激素水平。（4） 預(yù)處理。（5） 培養(yǎng)基成分。（6） 培養(yǎng)條件。溫度、光照。（7） 接種密度和方向。4.采用秋水仙素誘導(dǎo)園藝植物多倍體有哪些方法？答：（1）浸種法；（2）浸芽法；（3）滴苗法；（4）涂抹法；（5）套罩法；（6）毛細(xì)管法。5.創(chuàng)制園藝植物易位系、代換系和附加系分別有哪些方法？答：（1）易位系。包括常規(guī)方法誘導(dǎo)

14、的輻射誘導(dǎo)和雜交誘導(dǎo)，和組織培養(yǎng)誘導(dǎo)中的胚拯救、細(xì)胞培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)。6.試述園藝植物單倍體、多倍體和非整倍體的主要鑒定方法和輔助鑒定方法。答：（1）形態(tài)學(xué)鑒定。生長(zhǎng)勢(shì)，分枝數(shù)，葉片形狀、大小、顏色，花蕾數(shù)量、形狀，果實(shí)形狀等都可以作為鑒定的依據(jù)。 （2）細(xì)胞學(xué)鑒定。染色體計(jì)數(shù)法、流式細(xì)胞分析法、核型分析法、氣孔大小及保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目鑒定法、染色中心直徑和異染色質(zhì)數(shù)目法、花粉發(fā)育過(guò)程和花粉活力觀察法、減數(shù)分裂行為觀察法等。 （3）生理生化鑒定。通過(guò)對(duì)各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量、各種酶活性等方面的測(cè)定來(lái)對(duì)園藝植物染色體工程產(chǎn)物進(jìn)行輔助鑒定。 （4）分子生物學(xué)鑒定。分子原位雜交，分子標(biāo)記等。7.目前園

15、藝植物染色體工程還存在著哪些問(wèn)題？你認(rèn)為應(yīng)該如何解決？答：（1）單倍體。發(fā)展相對(duì)緩慢，至今仍有很多空白。發(fā)展方向：解決有些物種誘導(dǎo)率、可重復(fù)性差，很難實(shí)際應(yīng)用的問(wèn)題；探明通過(guò)胚狀體途徑誘導(dǎo)雄核發(fā)育和雌核發(fā)育的適宜條件；找到克服花藥培養(yǎng)中的白化現(xiàn)象，二倍體組織的生長(zhǎng)對(duì)單倍體誘導(dǎo)的影響等問(wèn)題的有效措施。 （2）多倍體。多倍體基因組發(fā)生了廣泛的遺傳變化，其基因平衡遭到破壞，存在一些缺陷，還有嵌合體問(wèn)題。發(fā)展方向：找出園藝植物各自的適宜倍性，研究和解決多倍體的缺陷、嵌合體問(wèn)題。 （3）非整數(shù)倍體。尚處在初級(jí)階段，成果有限。發(fā)展方向：努力拓展園藝植物的研究范圍，加強(qiáng)生物技術(shù)在園藝植物非整倍體制備中的應(yīng)用

16、。8.你怎么看待園藝植物染色體工程的前景？第七章 植物基因工程的基礎(chǔ)知識(shí)與技術(shù)1.簡(jiǎn)述DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模式的要點(diǎn)及其與DNA生物學(xué)功能的關(guān)系。答：（1）生物的遺傳信息儲(chǔ)存于DNA的核苷酸序列中； （2）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性主要由互補(bǔ)堿基對(duì)之間的氫鍵和堿基堆積力來(lái)維持； （3）DNA雙鏈經(jīng)過(guò)盤繞壓縮使松弛型DNA更為緊密，體積變得更小，在細(xì)胞的生命活動(dòng)中更能保持DNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。2.比較RNA和DNA在結(jié)構(gòu)上的異同點(diǎn)。答：（1）基本單位不同，DNA為脫氧核苷酸、RNA為核糖核苷酸 （2）DNA的五碳糖為脫氧核糖，RNA的五碳糖為核糖 （3）DNA的堿基為腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶，RNA

17、的為腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶 （4）與DNA相比，RNA種類繁多，分子質(zhì)量相對(duì)較小，通常以單鏈形式存在，RNA沒(méi)有形成雙螺旋，但也可以有局部的二級(jí)結(jié)構(gòu)或三級(jí)結(jié)構(gòu)。3.試述RNA的種類及其生物學(xué)作用。答：（1）mRNA。直接指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成。 （2）tRNA。攜帶相應(yīng)的氨基酸將其轉(zhuǎn)運(yùn)到核糖體上以供蛋白質(zhì)合成。 （3）rRNA。蛋白質(zhì)合成工廠核糖體的組成成分。4.基因工程常用的工具酶有哪些？答：（1）限制性內(nèi)切酶。一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子總某一特定核苷酸序列，并能對(duì)核酸內(nèi)部的磷酸二酯鍵進(jìn)行切割的一種內(nèi)切核酸酶。 （2）DNA連接酶。催化連接分離的DNA片段。 （3）DNA聚合酶。限制性核酸內(nèi)

18、切酶切割DNADNA連接酶生成3- 5磷酸二酯鍵DNA聚合酶探針標(biāo)記、補(bǔ)平3末端反轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5磷酸化、探針標(biāo)記末端轉(zhuǎn)移酶3末端多聚尾堿性磷酸酶3切除末端磷酸基DNA外切酶3末端切除單核苷酸噬菌體DNA外切酶5末端切除單核苷酸5.質(zhì)粒載體、柯斯質(zhì)粒載體、噬菌體載體和酵母人工染色體有何異同點(diǎn)？答：（1）質(zhì)粒是能自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子。（2）以噬菌體DNA為載體構(gòu)成的重組DNA分子必須包裝成完整病毒顆粒后才具有感染宿主的能力。經(jīng)包裝后重組DNA分子轉(zhuǎn)化率提高100-1000倍。這類載體可以有效克隆15kb大小的外源基因。（3）科斯質(zhì)粒是人工構(gòu)建的，含有DNA 的粘性(co

19、s)末端序列、質(zhì)粒復(fù)制起始區(qū)及質(zhì)粒一個(gè)抗藥性標(biāo)記的、兼具質(zhì)粒與噬菌體DNA載體雙重性質(zhì)的特殊載體。（4）YAC 載體主要是用來(lái)構(gòu)建大片段 DNA 文庫(kù)，特別用來(lái)構(gòu)建高等真核生物的基因組文庫(kù)，并不用作常規(guī)的基因克隆。 6.簡(jiǎn)述PCR技術(shù)的基本原理。答：根據(jù)已知的待擴(kuò)增的DNA片段序列，人工合成與該DNA兩條鏈末端互補(bǔ)的兩段寡核苷酸引物，在體外將DNA模板在酶促作用下進(jìn)行擴(kuò)增。PCR全過(guò)程可分為DNA模板變性、退火、延伸三個(gè)步驟，經(jīng)若干循環(huán)所組成。首先高溫作用使模板DNA變性解鏈，然后降低溫度使引物與模板DNA鏈退火，在TaqDNA 聚合酶作用及dNTP底物存在下，引物鏈將沿著5 3方向延伸與模板

20、互補(bǔ)的新鏈，新鏈則可作為下一次反應(yīng)的模板，因此擴(kuò)增產(chǎn)物的量以指數(shù)級(jí)方式增加。通常單一拷貝的基因經(jīng)2530循環(huán)可擴(kuò)增100萬(wàn)200萬(wàn)拷貝。7.核酸分離主要有哪些方法？答：DNA的分離：CTAB法，SDS法；RNA的分離：1）總RNA的提取 苯酚法，異硫氰酸胍法及氯化鋰沉淀法 2）mRNA的分離 親和層析的原理8.什么是分子雜交？分子雜交的主要技術(shù)有哪些？答：當(dāng)帶有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混合在一起時(shí)，其特定的同源區(qū)段將會(huì)退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)?？梢酝ㄟ^(guò)觀察雜種核酸分子的形成情況來(lái)判斷不同來(lái)源DNA的親緣關(guān)系。 Southern雜交：檢測(cè)經(jīng)限制性內(nèi)切核酸酶切割后的DNA片段中是否存在與探

21、針同源的序列。 Northern雜交：指將RNA變性及電泳分離后，并轉(zhuǎn)移到固相支持物上，用雜交反應(yīng)來(lái)鑒定其中特定mRNA分子的含量及其大小。 Western印跡：蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移到膜上再與抗體探針結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)的方法。 菌落原位雜交：將細(xì)菌從培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂解以釋放DNA，將DNA烘干固定于膜上與32P標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影檢測(cè)菌落雜交信號(hào)，并與平板上的菌落對(duì)位。第八章1.什么是基因組文庫(kù)？簡(jiǎn)述構(gòu)建大片段基因組文庫(kù)的主要步驟。答：園藝植物基因組文庫(kù)：指的是來(lái)自園藝植物基因組全部DNA片段組成的基因文庫(kù)?；蚪MDNA文庫(kù)反映基因組的全部遺傳

22、信息。 構(gòu)建大片段基因組文庫(kù)的主要步驟：1,載體的制備（包括載體DNA的分離，載體DNA的酶切，載體的脫磷酸化，載體DNA的純化等步驟）；2.大片段基因組DNA的制備；3，大片段DNA與克隆載體的連接；4，載體的遺傳轉(zhuǎn)化；5，克隆的挑取、驗(yàn)證；6，文庫(kù)的擴(kuò)增、分裝及保存。2.簡(jiǎn)述合成cDNA第二鏈的主要方法。答：自身引導(dǎo)合成法、置換合成法、同聚物引導(dǎo)法。3.簡(jiǎn)述圖位克隆技術(shù)的原理及其優(yōu)缺點(diǎn)。答：原理：首先找到一個(gè)與目標(biāo)基因相連的DNA分子標(biāo)記，然后通過(guò)染色體步移技術(shù)克隆分離出目標(biāo)基因。優(yōu)缺點(diǎn)：到目前為止,已有多個(gè)植物抗病基因通過(guò)該技術(shù)被分離，但是他們都具有較小的基因組、高密度的分子標(biāo)記連鎖圖和

23、較穩(wěn)定成熟的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。而對(duì)于基因組較大、重復(fù)序列較多的一些園藝植物，采用圖位克隆法分離基因要步移大量的DNA片段，投資大，效率低。而且由于基因組中往往存在大量的重復(fù)序列，以及被用來(lái)步移的DNA大片段插入文庫(kù)含有許多嵌套克隆或克隆后的重排現(xiàn)象等原因，染色體步移十分困難。4.簡(jiǎn)述轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法的基本步驟及其優(yōu)缺點(diǎn)。答:利用異源轉(zhuǎn)座子分離植物基因的一般操作步驟是：1，采取農(nóng)桿菌介導(dǎo)等適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化方法把轉(zhuǎn)座子導(dǎo)入目標(biāo)之五，設(shè)法將轉(zhuǎn)座子插入到目標(biāo)基因內(nèi)部或鄰近位點(diǎn)，引起表型突變。2，通過(guò)表型篩選獲得純合突變株。3，構(gòu)建純合突變株的基因組文庫(kù)。4，以轉(zhuǎn)座子片段作為探針，從該基因組文庫(kù)中篩選含轉(zhuǎn)座子片段的克隆。

24、5，以該克隆作為探針，篩選另一正常植株的核基因組文庫(kù)，獲得完整的正常目的基因。優(yōu)缺點(diǎn)：利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法可在不了解基因產(chǎn)物的生化性質(zhì)和表達(dá)模式的情況下分離植物基因，因此該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于植物功能基因的克隆研究，目前利用該法已經(jīng)從多種植物中克隆了上百個(gè)基因。但是該技術(shù)的前提條件是要篩選出轉(zhuǎn)座子插入的突變體。在實(shí)際操作中，由于轉(zhuǎn)座頻率往往很低，因此需要篩選的突變體群體較大。而且，對(duì)于那些需在特定環(huán)境或特定發(fā)育階段才有突變表型的基因，往往由于看不到明顯的突變表型而被忽略。另外，由于基因的功能補(bǔ)償?shù)葯C(jī)制的作用，即使有些基因產(chǎn)生了插入突變，也可能看不到突變表型，因而不能運(yùn)用該方法。5.差異表達(dá)基因分離法

25、主要包括哪幾種方法？各有何優(yōu)缺點(diǎn)？答：mRNA差異顯示(DDRT-PCR)、抑制性消減雜交（SSH）、代表性差異分析（RDA）、基因表達(dá)系列分析（SAGE）、cDNA-AFLP技術(shù)。mRNA差異顯示(DDRT-PCR)：優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快速、RNA有量少、效率高。主要用于比較兩種以上特定生理狀態(tài)或不同發(fā)育階段的mRNA樣品間基因表達(dá)的差異。缺點(diǎn)：1，假陽(yáng)性特別高，增加了后續(xù)工作難度。2，由于PCR自身反應(yīng)條件的敏感性，mRNA差異顯示技術(shù)重復(fù)性較差。3，擴(kuò)增片段較小，不能代表真正差異表達(dá)的基因，且上游的差異表達(dá)信息量的不到檢測(cè)。4，對(duì)高拷貝數(shù)mRNA有較強(qiáng)的傾向性，不能用于反映低拷貝數(shù)的mRNA。

26、抑制性消減雜交（SSH）:優(yōu)點(diǎn)：1，假陽(yáng)性率大大降低；2，目的序列富集程度較高，且豐度相對(duì)一致，確保了低豐度表達(dá)的cDNA有被檢測(cè)的可能性極大地提高了檢測(cè)效率；3,SSH靈敏度很高，重復(fù)性強(qiáng)。缺點(diǎn)：1，需要較多的其實(shí)材料的mRNA；2，更多地依賴于PCR技術(shù)，不能同時(shí)對(duì)數(shù)個(gè)材料進(jìn)行比較；3，材料之間存在的過(guò)多的差異及小片段缺失也不能有效地被檢測(cè)。代表性差異分析（RDA）：優(yōu)點(diǎn)：1，免去了物理方法分離單、雙鏈的繁瑣操作，通過(guò)接頭“修飾”設(shè)計(jì)，借助PCR技術(shù)即能使目的片段得到有效擴(kuò)增，減少假陽(yáng)性。2，差減雜交在擴(kuò)增后的cDNA群體之間進(jìn)行，不再受供試的mRNA量的限制，拓寬了差減雜交的應(yīng)用范圍。3

27、,一次實(shí)驗(yàn)課分離得到多個(gè)在T組和D組間差異表達(dá)基因的cDNA克隆，并能發(fā)現(xiàn)與表性相關(guān)的異?；颍瑱z測(cè)基因的上調(diào)和下調(diào)表達(dá)。缺點(diǎn)：1，目的基因間豐度的差異在數(shù)輪差減雜交后的群體中保留了下來(lái)，在后續(xù)的篩選中，高豐度的差異基因容易得到，低豐度的差異基因不易檢出，而低豐度的表達(dá)產(chǎn)物往往代表相對(duì)重要的基因。2，分離出來(lái)的差異基因也可能與其表型無(wú)關(guān)，增加了后續(xù)鑒定的工作量。3，對(duì)樣品T組和D組的純度要求很高，如果兩組材料間差別較大，則用此方法將達(dá)不到鑒定差別表達(dá)基因的目的?；虮磉_(dá)系列分析（SAGE）：優(yōu)點(diǎn)：成本低效率高，能很靈敏的檢測(cè)出那些低豐度表達(dá)的基因。缺點(diǎn)：1，只有那些基因庫(kù)中存儲(chǔ)標(biāo)簽所代表的基因

28、才能被鑒定，對(duì)未搜索到匹配序列的標(biāo)簽鑒定存在困難，而且其效率依賴于現(xiàn)有的序列數(shù)據(jù) 。2，如果堿基序列發(fā)生錯(cuò)誤，或者擴(kuò)增效率發(fā)生變化，也會(huì)導(dǎo)致結(jié)果失真。3，該法雖然不需分別測(cè)定各cDNA的序列，但工作量仍然很大，且操作較為繁瑣，需要使用測(cè)序儀，普通實(shí)驗(yàn)室無(wú)法做到。cDNA-AFLP技術(shù)：優(yōu)點(diǎn)：它可以對(duì)生物體全部的mRNA樣品進(jìn)行篩選，具有重復(fù)性高、假陽(yáng)性率低的特點(diǎn)，其可靠性強(qiáng)，重復(fù)性可達(dá)95%。而且，在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物高度表達(dá)時(shí)，擴(kuò)增條帶的強(qiáng)度能準(zhǔn)確反映基因間表達(dá)量的差別。缺點(diǎn)：操作過(guò)程繁瑣，假陽(yáng)性率有時(shí)也較高。6.簡(jiǎn)述基于同源序列的候選基因法分離目的基因的主要方法。答：1，根據(jù)已知基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物

29、，以待分離此基因的植物基因組DNA或cDNA為模板直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序并與已知基因進(jìn)行序列比較，從而確定該基因是否為待分離基因。2，用用已知序列的基因制備探針，篩選待分離基因的植物核DNA或cDNA文庫(kù)。再對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，并與已知基因序列進(jìn)行同源性比較，最后經(jīng)轉(zhuǎn)化鑒定是否為待分離的基因。7.簡(jiǎn)述RACE技術(shù)的基本原理及其優(yōu)缺點(diǎn)。答： 原理：RACE 是采用PCR 技術(shù)由已知的部分cDNA 順序來(lái)擴(kuò)增出完整cDNA5和3末端,是一種簡(jiǎn)便而有效的方法, 又被稱為錨定 PCR和單邊PCR。3RACE的原理一)加入oligo(dT)17和反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到(-)cDNA

30、；二)以oligo(dT)l7和一個(gè)35bp的接頭(dT17-adaptor)為引物，其中在引物的接頭中有一在基因組DNA中罕見(jiàn)的限制酶的酶切位點(diǎn)。這樣就在未知cDNA末端接上了一段特殊的接頭序列。再用一個(gè)基因特異性引物(3 amp)與少量第一鏈(-)cDNA退火并延伸，產(chǎn)生互補(bǔ)的第二鏈(+)cDNA。三)利用3amp和接頭引物進(jìn)行PCR循環(huán)即可擴(kuò)增得到cDNA雙鏈。擴(kuò)增的特異性取決于3amp的堿基只與目的cDNA分子互補(bǔ)而用接頭引物來(lái)取代dT17一adaptor則可阻止長(zhǎng)(dT)堿基引起的錯(cuò)配。5RACE的原理5RACE與3 RACE略有不同。首先，引物多設(shè)計(jì)了一個(gè)用于逆轉(zhuǎn)錄的基因特異引物G

31、SP-RT；其次，在酶促反應(yīng)中增加了逆轉(zhuǎn)錄和加尾步驟，即先用GSP-RT逆轉(zhuǎn)錄 mRNA獲得第一鏈(-)cDNA后， 用脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶和dATP在cDNA5 端加poly(A)尾，再用錨定引物合成第二鏈(+)cDNA,接下來(lái)與3 RACE過(guò)程相同。用接頭引物和位于延伸引物上游的基因特異性引物(5amp)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。全長(zhǎng)基因的獲得：1,對(duì)3RACE和5RACE的產(chǎn)物序列的重疊區(qū)域分析，經(jīng)過(guò)拼接獲得全長(zhǎng)cDNA2,通過(guò)分析RACE產(chǎn)物的3和5端序列，重新設(shè)計(jì)合成相應(yīng)引物，PCR擴(kuò)增出全長(zhǎng)cDNA優(yōu)缺點(diǎn)；優(yōu)點(diǎn)；操作速度快，節(jié)省時(shí)間，可在短期內(nèi)獲得全長(zhǎng)的cDNA。只需極少量的起始反應(yīng)物質(zhì)，

32、具有快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，還幾乎不存在產(chǎn)生非特異產(chǎn)物的可能。缺點(diǎn)：利用RACE技術(shù)來(lái)獲得全長(zhǎng)基因并不容易，甚至經(jīng)常會(huì)發(fā)生錯(cuò)誤的擴(kuò)增和克隆結(jié)果，尤其是對(duì)于豐度較低、長(zhǎng)度較長(zhǎng)的基因。8.簡(jiǎn)述基因芯片技術(shù)的原理及其優(yōu)缺點(diǎn)。答：原理：將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列固定于支持物上，然后使其與待測(cè)的標(biāo)記樣品基因按劍姬配對(duì)原理進(jìn)行雜交，再通過(guò)共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，并配以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一探針上的熒光信號(hào)做出比較和檢測(cè)，從而迅速得出所要的信息。優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：具有高度的敏感性和特異性，有高信息量、快速、樣品用量少、用途廣泛等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)：基因芯片需要大量已知的、準(zhǔn)

33、確的DNA和cDNA片段的序列信息，而且，需要高密度芯片制作的精密機(jī)械系統(tǒng)和操作工藝及微弱的雜交信號(hào)檢出裝置，芯片的制作和使用成本均較高，所以尚難在一般的實(shí)驗(yàn)室中普及使用。第九章 園藝植物遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建1.什么叫卸甲載體？常用的卸甲載體有幾種類型？卸甲載體是無(wú)毒的Ti質(zhì)粒載體，又稱onc-載體。是指為了使野生型的Ti質(zhì)粒成為基因轉(zhuǎn)化的載體，必須切除T-DNA中onc基因，即“解除”其“武裝”，構(gòu)建成“卸甲載體”。常用的卸甲載體類型：pGV3850載體、pGV2250載體和pTiB6S3-SE載體3種。2.Ti共整合轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)的特點(diǎn)及構(gòu)建策略是什么？特點(diǎn)：1.Ti共整合載體由兩個(gè)質(zhì)粒組成，

34、其中一個(gè)是E.coli質(zhì)粒中間載體，另一個(gè)是卸甲Ti質(zhì)粒組成；2.農(nóng)桿菌中兩個(gè)質(zhì)粒形成一個(gè)大的共整合載體，E.coli質(zhì)粒進(jìn)入到根癌農(nóng)桿菌后，以同源重組的方式與Ti質(zhì)粒整合在一起，形成共合體，相對(duì)分子質(zhì)量較大；3.共合體的形成頻率與兩個(gè)質(zhì)粒的重組頻率有關(guān)，相對(duì)較低；4.必須用Sounthern雜交或PCR對(duì)大的共整合體質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)；5.構(gòu)建是比較困難。Ti共整合轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建策略：基于中間載體與受體Ti質(zhì)粒重組序列的不同,共整合載體可分為以pBR322序列為同源序列的轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)和基于左邊界內(nèi)部同源區(qū)(LIH)的轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng),即SEV系統(tǒng)。1.基于pBR322同源序列的共整合載體的構(gòu)建策略： 中

35、間載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌；(2)中間載體與受體Ti質(zhì)粒的同源重組；(3) 共整合載體的選擇2.SEV系統(tǒng)的構(gòu)建：(1) pTiB63S3-SE質(zhì)粒作為卸甲載體；(2)pMON200作為SEV中間載體；(3)通過(guò)三親雜交將中間載體pMON200或pCIT30導(dǎo)入農(nóng)桿菌，形成SEV的共整合載體。3.Ti雙元表達(dá)載體系統(tǒng)有什么特點(diǎn)？它對(duì)于共整合系統(tǒng)具有哪些優(yōu)點(diǎn)？雙元載體系統(tǒng)特點(diǎn)：1.具有RK2質(zhì)粒的復(fù)制功能，可以在大腸桿菌和根癌農(nóng)桿菌中復(fù)制，并且與Ti質(zhì)粒是向容的；2.具有Ti質(zhì)粒的左右兩側(cè)或右側(cè)的邊緣區(qū)序列，使DNA可以轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞; 3.邊緣區(qū)序列內(nèi)包含植物選擇標(biāo)記嵌合基因，用于轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株的初步篩選

36、； 4.帶有抗生素基因，可以作為細(xì)菌轉(zhuǎn)化因子的選擇記號(hào)。與共整合系統(tǒng)比較的優(yōu)點(diǎn)：1.構(gòu)建簡(jiǎn)單2.具有雙復(fù)制位點(diǎn)3.接合頻率更高4.在鑒定上更為容易。4.發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒有什么特點(diǎn)？它可否與Ti質(zhì)粒在異源T-DNA與Vir區(qū)的情況下完成DNA的轉(zhuǎn)移？特點(diǎn)：1.可以不經(jīng)“解除武裝”進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并且轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的發(fā)根能夠再生植株；2.發(fā)狀根是一個(gè)單細(xì)胞克隆，可以避免嵌合體；3.Ri質(zhì)?？芍苯幼鳛橹虚g載體；4.Ri質(zhì)粒和Ti質(zhì)?？梢耘浜鲜褂媒㈦p元載體系統(tǒng)，拓展了兩類質(zhì)粒在植物基因工程中的應(yīng)用范圍；5.發(fā)根適合于進(jìn)行離體培養(yǎng)。Ri質(zhì)粒的T-DNA可以在Ti質(zhì)粒Vir基因的誘導(dǎo)下進(jìn)行T-DNA的轉(zhuǎn)化。5.選

37、擇標(biāo)記基因和報(bào)告基因的特點(diǎn)是什么？常用的選擇基因和報(bào)告基因各有哪幾種？選擇標(biāo)記基因特點(diǎn)：1.編碼一種不存在于正常植物細(xì)胞中的酶；2.基因較小，可構(gòu)成嵌合基因；3.能在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中得到充分表達(dá)；4.檢測(cè)容易，并能定量分析。列舉：新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（npt II）、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hpt）、二氫葉酸還原酶基因（dhfr）、草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（bar）報(bào)告基因特點(diǎn)：1.其產(chǎn)物在原植物中不存在或本底很低，并對(duì)宿主植物細(xì)胞無(wú)毒性；2.表達(dá)產(chǎn)物應(yīng)有適度的穩(wěn)定性以利于檢測(cè)；3.檢測(cè)手段高度敏感，檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、靈敏并可以定量；4.檢測(cè)過(guò)程應(yīng)不具有破壞性。列舉：冠癭堿合成酶基因、螢火蟲熒光素基因、綠色熒

38、光蛋白基因、花青素合成相關(guān)基因。6.園藝植物常用的遺傳轉(zhuǎn)化載體類型包括哪些？正以表達(dá)載體、反義表達(dá)載體、RNA干涉載體、基因打靶載體、啟動(dòng)子缺失載體和瞬時(shí)表達(dá)載體等。7.目的基因與載體的連接方法有哪些？1.插入滅活發(fā)；2.定向克隆法：（1）同聚物加尾法（2）銜接物連接法（3）DNA接頭連接法。第十章 園藝植物遺傳轉(zhuǎn)化1.園藝植物遺傳轉(zhuǎn)化方法有哪些？各有哪些優(yōu)缺點(diǎn)？一外援裸露DNA的轉(zhuǎn)化：（1）化學(xué)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化法（2）電穿孔轉(zhuǎn)化法 （3）基因槍轉(zhuǎn)化法（4）激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法（5）體內(nèi)注射轉(zhuǎn)化法（6）脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法二載體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)化：（1）根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化（2）發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化三

39、種質(zhì)轉(zhuǎn)化法：（1）植物原位真空滲入法（2）花粉管通道轉(zhuǎn)化法（3）種子浸泡轉(zhuǎn)化法2.什么叫選擇標(biāo)記基因和報(bào)告基因？試舉例說(shuō)明怎樣使用。選擇標(biāo)記基因：是指在選擇壓下，編碼產(chǎn)物能夠使轉(zhuǎn)化細(xì)胞、組織具有對(duì)抗生素或除草劑的抗性，而非轉(zhuǎn)化細(xì)胞則不能在使用選擇劑的條件下生長(zhǎng)、發(fā)育和分化的基因。舉例：在園藝植物遺傳轉(zhuǎn)化中，將npt II一同轉(zhuǎn)化植物受體細(xì)胞，使轉(zhuǎn)化體具有npt II表達(dá)產(chǎn)物而對(duì)卡那霉素具有抗性。報(bào)告基因：指其編碼產(chǎn)物在受體細(xì)胞、組織或器官中具有表達(dá)活性，能夠被快速地測(cè)定的一類特殊用途的基因。舉例：依據(jù)螢火蟲熒光素酶在鎂離子、三磷酸腺苷和氧的作用下，催化6-羥基喹啉物質(zhì)生成氧化熒光素，同時(shí)放出光

40、子，檢測(cè)簡(jiǎn)便、靈敏。3.比較Southern雜交、Northern雜交和Western雜交的原理及鑒定目的。Southern雜交原理：指模板DNA經(jīng)酶切、凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜等步驟后，再用標(biāo)記的單鏈DNA探針雜交探測(cè)的一種技術(shù)，其理論基礎(chǔ)是堿基互補(bǔ)配對(duì)原則。鑒定目的：進(jìn)行核酸序列分析、重組子鑒定和檢測(cè)外源基因整合及表達(dá)情況，還可清除操作過(guò)程中的DNA污染和轉(zhuǎn)化中的質(zhì)粒殘留所引起的假陽(yáng)性信號(hào)。Northern雜交原理：RNA樣品經(jīng)凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、預(yù)雜交后，再用標(biāo)記的探針與膜上的RNA雜交，以檢驗(yàn)RNA樣品中是否有與探針同源的序列，如果有雜交信號(hào)，表明整合到植物染色體上的外源基因能正常表達(dá)。鑒定目的

41、：研究轉(zhuǎn)基因植株外源基因表達(dá)及調(diào)控。Western雜交原理：從植物中提取總蛋白或目的蛋白，將蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE，使蛋白質(zhì)按大小分離，將分離的各種蛋白質(zhì)條帶原位印跡到固相膜上，然后加入特異抗體（一抗），印跡上的目的蛋白（抗原）與一抗結(jié)合后，再加入到能與一抗專一結(jié)合的被標(biāo)記的二抗，最后通過(guò)二抗上的標(biāo)記化合物進(jìn)行檢測(cè)。鑒定目的：鑒定轉(zhuǎn)基因植株是否能產(chǎn)生特異抗體。4.什么叫轉(zhuǎn)基因沉默？怎樣克服？轉(zhuǎn)基因沉默：導(dǎo)入并整合進(jìn)受體基因組中的外源基因在轉(zhuǎn)化體的當(dāng)代或其后代中出現(xiàn)表達(dá)受到抑制，甚至完全不表達(dá)的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)基因沉默。怎樣克服：1.采用合適的轉(zhuǎn)化方法2.使用信號(hào)肽3.使用強(qiáng)啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟

42、動(dòng)子4.使用強(qiáng)終止子5.使用增強(qiáng)子6.使用植物偏愛(ài)的密碼子7.使用基質(zhì)結(jié)合區(qū)序列8.防止甲基化9.改造外源基因。5.試述基因靶向技術(shù)的原理、步驟及當(dāng)前的應(yīng)用概況?；虬邢蚣夹g(shù)原理：利用同源重組、點(diǎn)突變或隨機(jī)突變、RNAi等途徑使機(jī)體已知結(jié)構(gòu)的特定基因失活或缺失。（一）同源重組進(jìn)行基因打靶原理：應(yīng)用同源重組原理，用設(shè)計(jì)的同源片段替代靶基因片段，從而達(dá)到基因剔除的目的。步驟：1.構(gòu)建含目的基因和標(biāo)記基因的重組載體；2.受體細(xì)胞的制備；3.用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)同源重組；4.用選擇培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞；5.轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)、篩選及利用表型變化研究目的基因功能。（二）隨機(jī)插入

43、突變進(jìn)行基因打靶原理：利用某些能隨機(jī)插入基因序列的病毒、細(xì)菌或其他基因載體，在目標(biāo)細(xì)胞基因組中進(jìn)行隨機(jī)插入突變，建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入突變的細(xì)胞庫(kù)，然后通過(guò)相應(yīng)的標(biāo)記進(jìn)行篩選獲得相應(yīng)的基因剔除細(xì)胞。步驟：1.構(gòu)建含目的基因的T-DNA載體；2.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化植株；3.轉(zhuǎn)基因植株的堅(jiān)定；4.插入失活突變植株篩選；5.T-DNA插入位點(diǎn)基因的克隆。第十一章1.與傳統(tǒng)育種技術(shù)相比較，應(yīng)用基因工程技術(shù)進(jìn)行園藝植物遺傳改良有哪些優(yōu)點(diǎn)？答：（1）可提高作物產(chǎn)量和改善作物的抗蟲、抗病、抗除草劑等抗逆能力； （2）改善園藝產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和食用風(fēng)味，如營(yíng)養(yǎng)成分含量、風(fēng)味品質(zhì)、延長(zhǎng)貨架壽命和保存時(shí)間，以及用食品工

44、程菌生產(chǎn)食品添加劑和功能因子等。2.舉例說(shuō)明利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以改良蔬菜作物的哪些性狀？答：（1）Li等在番茄中超量表達(dá)土豆多酚氧化酶基因（PPO）的cDNA，結(jié)果表明強(qiáng)烈抑制了細(xì)菌的生長(zhǎng)，使感染葉片中細(xì)菌密度減少到原來(lái)的10%，極大地提高了番茄植株對(duì)于細(xì)菌性病害的抗性。 （2）脯氨酶合成酶基因P5CS在胡蘿卜中表達(dá)使植物的耐鹽能力得到了明顯提高。 （3）Meyer等將玉米的DFR基因?qū)氚咨珷颗Ｖ仓曛?，是二氫黃酮醇還原為花葵素，轉(zhuǎn)化后的矮牽?；ㄉ邪咨兂纱u紅色。3.生物技術(shù)在園藝植物育種中的應(yīng)用有哪些方面？答：（1）創(chuàng)造雄性核不育系 途徑1.通過(guò)核酸酶基因的特異空間表達(dá)創(chuàng)造雄性不育系 2.

45、利用胼胝質(zhì)酶提前降解胼胝質(zhì)壁是雄性不育 3.利用反義基因獲得植物雄性不育 4.改變激素含量與比例獲得雄性不育植株 5.導(dǎo)入細(xì)胞質(zhì)雄性不育的有關(guān)基因?qū)е轮参镄孕圆挥?6.通過(guò)共抑制及RNAi轉(zhuǎn)基因沉默創(chuàng)造植物雄性不育 （2）基因工程雄性不育系的恢復(fù)與保持 途徑1.利用引起雄性不育基因的抑制基因來(lái)恢復(fù)育性 2.通過(guò)化學(xué)調(diào)控恢復(fù)育性 3.利用定位重組系統(tǒng)來(lái)恢復(fù)不育植株的育性4.如何應(yīng)用生物技術(shù)提高園藝植物的光合能力和固氮能力？答：（1）提高光合能力：A：C4光合途徑關(guān)鍵酶基因的克隆和轉(zhuǎn)化。將C4途徑涉及到的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）、磷酸丙酮酸二激情酶（PPDK）和蘋果酸酶的基因從C4植物中

46、克隆出來(lái)并導(dǎo)入C3植物。如把玉米的PPDK基因?qū)腭R鈴薯中，PPDK活性比對(duì)照高5.4倍。 B：果糖-1,6-二磷酸酶（FBPase）基因。將土豆葉綠體中的FBPase基因轉(zhuǎn)化到土豆塊莖的造粉體中，有著更高的活性，合成了更多的淀粉。 （2）提高固氮能力：向不能或固氮能力差的微生物中導(dǎo)入強(qiáng)的固氮基因。將克氏肺炎桿菌固氮基因（nif）導(dǎo)入不能固氮的植物或微生物中，以獲得固氮植物或固氮微生物。把帶有固氮基因的智力PRD1從大腸桿菌K12jc5564導(dǎo)入無(wú)固氮能力的水稻根系菌4502Y中，表現(xiàn)出較強(qiáng)的固氮能力。5.抗蟲轉(zhuǎn)基因園藝植物的獲得有哪些途徑？答：將抗蟲基因?qū)胫仓曛小?抗蟲基因來(lái)源有植物、動(dòng)物

47、、昆蟲、真菌、細(xì)菌和病毒。第十二章1.植物研究中常用的遺傳標(biāo)記有哪幾類？又有何優(yōu)缺點(diǎn)？?jī)?yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)形態(tài)標(biāo)記簡(jiǎn)單直觀，容易觀察可利用的形態(tài)標(biāo)記較少；許多標(biāo)記為隱性；生育后期磁能觀察到；受環(huán)境影響大；與不良現(xiàn)狀連鎖細(xì)胞學(xué)標(biāo)記克服了形態(tài)標(biāo)記易受環(huán)境影響的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)基因的染色體定位篩選和創(chuàng)造花費(fèi)大量人力物力；難以保存或遺傳穩(wěn)定；常伴隨有害效應(yīng)，難觀測(cè)鑒定；標(biāo)記數(shù)目有限生化標(biāo)記多態(tài)性高；受環(huán)境影響少；表現(xiàn)共顯性；可期鑒定；所需材料少標(biāo)記數(shù)目有限；蛋白質(zhì)電泳分辨率有限，不能檢測(cè)所有突變；每種同工酶標(biāo)記都要特定顯色方法；某些酶活性具有組織或發(fā)育特異性分子標(biāo)記多態(tài)性高；表現(xiàn)穩(wěn)定；許多分子標(biāo)記為共顯性；表現(xiàn)中性，不

48、影響表達(dá)，無(wú)必然連鎖；DNA變異廣泛存在2.分子標(biāo)記產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)是什么？答：（1）DNA序列酶切位點(diǎn)的堿基發(fā)生突變，導(dǎo)致酶切位點(diǎn)消失、酶切產(chǎn)物減少。 （2）DNA序列酶切位點(diǎn)之間缺失或插入一段核苷酸序列，或是酶切位點(diǎn)之間的串聯(lián)重復(fù)單元數(shù)目發(fā)生了改變，倒是酶切產(chǎn)物片段長(zhǎng)度改變。 （3）單核苷酸突變，即單堿基轉(zhuǎn)換或顛換。3.園藝植物常用的分子標(biāo)記有哪些？產(chǎn)生的原理是什么？答：（1） RFLP標(biāo)記：基于Southern雜交。RFLP標(biāo)記是用限制性內(nèi)切酶酶解具有相對(duì)性狀的兩個(gè)群體的DNA，然后通過(guò)電泳和Southern雜交技術(shù)在酶切后形成的DNA片段中發(fā)現(xiàn)這種不同。根據(jù)含有與雜交探針同原序列的酶切片

49、段的長(zhǎng)度來(lái)檢測(cè)DNA序列。（2） 小衛(wèi)星標(biāo)記：基于Southern雜交。與RFLP標(biāo)記原理大致相同，只對(duì)限制性內(nèi)切核酸酶和雜交探針有特殊要求。（3） RAPD標(biāo)記：基于PCR擴(kuò)增。RAPD標(biāo)記的操作步驟與常規(guī)PCR基本相似，只是引物不同。常規(guī)PCR使用雙引物，通常1830bp，RAPD標(biāo)記使用單引物，通常為10 bp的隨機(jī)序列。（4） SSR標(biāo)記：基于PCR擴(kuò)增。SSR標(biāo)記就是根據(jù)簡(jiǎn)單重復(fù)序列外兩翼的特定序列設(shè)計(jì)引物，用來(lái)擴(kuò)增重復(fù)序列本身，由于重復(fù)的長(zhǎng)度變化極大，所以會(huì)得到不同長(zhǎng)度的片段。如果擴(kuò)增出來(lái)的某個(gè)片段與某個(gè)特定性狀存在對(duì)應(yīng)關(guān)系，則該片段為該性狀的SSR標(biāo)記。（5） ISSR標(biāo)記：基于

50、PCR擴(kuò)增。設(shè)計(jì)出各種能與SSR序列結(jié)合的PCR引物，這些引物的3端或5端加上24個(gè)隨機(jī)核苷酸，通過(guò)PCR反應(yīng)，對(duì)兩個(gè)相距較近，方向相反的重復(fù)序列之間的DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。所擴(kuò)增的inter SSR區(qū)域的多個(gè)條帶通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳或者瓊脂糖凝膠電泳得以分辨，擴(kuò)增帶多為顯性表現(xiàn)。（6） AFLP標(biāo)記；基于PCR擴(kuò)增。原理是選擇性擴(kuò)增園藝植物基因組DNA的雙酶切片段，檢測(cè)的多態(tài)性是酶切位點(diǎn)的變化或酶切片段間DNA序列的插入和缺失。AFLP標(biāo)記是用DNA限制性內(nèi)切酶酶解具有相對(duì)性狀的兩個(gè)群體的DNA，然后對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，最后在形成的擴(kuò)增產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)不同。這種不同就是與目的性狀相連鎖的AF

51、LP標(biāo)記。（7） SRAP和TRAP標(biāo)記：基于PCR擴(kuò)增。SRAP標(biāo)記原理是利用外顯子G/C含量豐富而內(nèi)含子A/T含量豐富的特點(diǎn)，分別是即正向引物和反向引物，對(duì)可讀框的外顯子和內(nèi)含子、啟動(dòng)子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而產(chǎn)生基于外顯子和內(nèi)含子的多態(tài)性。TRAP差別僅在于引物不同。（8） STS、SCAR、CAPS標(biāo)記（9） SNP標(biāo)記：基于Southern雜交和PCR擴(kuò)增。園藝植物基因組由于單個(gè)核苷酸變異而引起DNA序列多態(tài)性，包括單堿基轉(zhuǎn)換、顛換以及單堿基的插入或缺失。4.園藝植物分子標(biāo)記數(shù)據(jù)收集過(guò)程中應(yīng)注意哪些問(wèn)題？答：多態(tài)性=（總條帶數(shù)-共有條帶數(shù)）/總條帶數(shù) 相關(guān)系數(shù)，距離系數(shù)，聯(lián)合系數(shù)。5.分

52、子標(biāo)記在園藝植物研究中的應(yīng)用主要體現(xiàn)在哪些方面？答：（1）分子遺傳圖譜構(gòu)建和基因定位分子遺傳圖譜構(gòu)建 園藝植物分子遺傳圖譜的構(gòu)建及基因定位 （2）分子標(biāo)記輔助選擇育種 與目標(biāo)基因連鎖分子標(biāo)記的獲得 園藝植物分子標(biāo)記輔助選擇 （3）遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析 （4）核心種質(zhì)構(gòu)建 核心種質(zhì)構(gòu)建的原理 園藝植物核心種質(zhì)的構(gòu)建 （5）園藝植物品種鑒定與純度分析6.構(gòu)建園藝植物分子遺傳圖譜時(shí)常用的分離群體有哪些？各有何優(yōu)缺點(diǎn)？方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)F2分離群體分離群體容易構(gòu)建存在雜合基因；不能長(zhǎng)久保存BC1分離群體直接放映F1配子分離比例不能長(zhǎng)久保存F1分離群體DH分離群體穩(wěn)定繁殖；直接放映F1配子分離比例花藥培養(yǎng)

53、破壞DH遺傳結(jié)構(gòu)，偏分離，影響作圖RIL分離群體純合永久分離群體構(gòu)建周期長(zhǎng)7.利用BSA法獲得與園藝植物目標(biāo)性狀緊密連鎖分子標(biāo)記的原理是什么？答：BSA法的原理是將分離群體中的個(gè)體依據(jù)研究的目標(biāo)性狀（如抗病和染?。┓殖蓛山M，在每組群體中把各個(gè)個(gè)體的DNA等量混合，形成兩個(gè)DNA混合池。因此又稱為近等基因池法。它克服了許多植物不易獲得近等基因系的缺點(diǎn)。8.構(gòu)建園藝植物核心種質(zhì)的基本步驟有哪些？（1）數(shù)據(jù)收集：收集所有種質(zhì)資源的現(xiàn)有數(shù)據(jù)資料。（2）數(shù)據(jù)分組：把具有相似數(shù)據(jù)的種質(zhì)資源分為一組。（3）樣品選擇：把所有種質(zhì)資料科學(xué)地分組后，以合理的取樣方法及取樣比例選取核心種質(zhì)。（4）核心種質(zhì)管理：建立

54、完善的核心種質(zhì)繁殖、供種及管理體制，以保證核心種質(zhì)的有效利用。第十三章1.生物信息學(xué)研究的任務(wù)及內(nèi)容： 任務(wù)：以計(jì)算機(jī)科學(xué)、工程和應(yīng)用數(shù)學(xué)為基礎(chǔ)，進(jìn)行相關(guān)的生物信息的獲取，加工、儲(chǔ)藏、分配、分析和解釋等，即依賴試驗(yàn)和衍生數(shù)據(jù)的大量存儲(chǔ)，將各種各樣的生物信息，如基因序列、染色體定位、基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能及個(gè)生物中間的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行搜集、分類和分析，并實(shí)現(xiàn)全世界生命科學(xué)界的信息資源共享。 內(nèi)容：1）生物信息的收集儲(chǔ)藏和管理。2）基因序列信息的分析，開發(fā)信息檢索工具及之后的信息自動(dòng)化處理3）基因功能分析，闡明基因功能 4）生物大分子結(jié)構(gòu)模擬（預(yù)測(cè)）5）生物信息分析的技術(shù)與方法（軟件、數(shù)據(jù)庫(kù)、數(shù)據(jù)庫(kù)的分

55、析工具、新方法、新技術(shù)）2.常用的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)有哪些 基本數(shù)據(jù)庫(kù)（DNA序列，蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)） 二級(jí)數(shù)據(jù)庫(kù)（對(duì)基本數(shù)據(jù)庫(kù)的分析、提煉、加工） 1）DNA數(shù)據(jù)庫(kù)：GenBank(美國(guó)) EMBL歐洲) DDBJ(日本) Biosino(中國(guó)) 2）基因組數(shù)據(jù)庫(kù) 人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(GDB)、酵母基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(SGD)、 擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(TAIR) 3）蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù) SWISS-PROT(瑞士)：序列、結(jié)構(gòu)域、功能、修飾、突變體 TrEMBL PIR數(shù)據(jù)庫(kù)（4部分）：PIR1序列清楚；PIR2序列被檢測(cè)分類，但冗 余；PIR3未被檢測(cè)；PIR4未被驗(yàn)證 NRL-3D 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)已知 OWL數(shù)據(jù)庫(kù) 4）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(由X射線晶體衍射和核磁