生物大分子相互作用分析新技術(shù)

1、 生物大分子相互作用分生物大分子相互作用分析新技術(shù)析新技術(shù) 1、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）能夠?qū)τ诩?xì)胞中的蛋白質(zhì)間相互作用或?qū)ψ饔眠M(jìn)行實(shí)時(shí)原位分析的檢測(cè)方法供體熒光素 受體熒光素FRET現(xiàn)象現(xiàn)象 Binding NO BindingFRET: The Size 當(dāng)一個(gè)熒光分子當(dāng)一個(gè)熒光分子(又稱為又稱為供體分子供體分子)的熒光光譜與另的熒光光譜與另一個(gè)熒光分子一個(gè)熒光分子(又稱為又稱為受體受體分子分子)的激發(fā)光譜相重疊時(shí)，的激發(fā)光譜相重疊時(shí)，供體熒光分子的激發(fā)能誘發(fā)供體熒光分子的激發(fā)能誘發(fā)

2、受體分子發(fā)出熒光，同時(shí)供受體分子發(fā)出熒光，同時(shí)供體熒光分子自身的熒光強(qiáng)度體熒光分子自身的熒光強(qiáng)度衰減。衰減。FRET 程度與供、受程度與供、受體分子的空間距離緊密相關(guān)，體分子的空間距離緊密相關(guān)，一般為一般為710 nm 時(shí)即可發(fā)時(shí)即可發(fā)生生FRET；隨著距離延長(zhǎng)，；隨著距離延長(zhǎng)，F(xiàn)RET呈顯著減弱呈顯著減弱.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)InteractionXCFPYYFPUV laserFRETYellow light emissionYYFPXCFPUV laserCyan light emissionDonorAcceptorFRET的能量供體和受體的能量供體和受體滿足條件：滿足條件： 供體受體的激

3、發(fā)光譜要分得足夠開；供體受體的激發(fā)光譜要分得足夠開； 供體的發(fā)射光譜與受體的激發(fā)光譜要重疊；供體的發(fā)射光譜與受體的激發(fā)光譜要重疊； 供受體的發(fā)射光譜要足夠分開。供受體的發(fā)射光譜要足夠分開。CFPYFPWavelength (nm)Normalized intensity (%)GFP 綠綠 色色 熒熒 光光 蛋蛋 白白CFP (青色熒光蛋白青色熒光蛋白)(第第66位位TyrTrp)(第第203位位ThrTyr)YFP (黃色熒光蛋白黃色熒光蛋白)CFP (433nm /476nm) YFP (513nm / 527nm)FRET的能量供體和受體的能量供體和受體 均相檢測(cè)（無分離和洗滌步驟）均相

4、檢測(cè)（無分離和洗滌步驟） 實(shí)時(shí)連續(xù)地觀察活細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化實(shí)時(shí)連續(xù)地觀察活細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化FRET技術(shù)的優(yōu)勢(shì)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)Fluorescence IntensityTime LigandCy3Cy5ABCIntermolecularDirectIndirectKinaseStep2Step1FRET應(yīng)用的類型應(yīng)用的類型FRET應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍 酵母雙雜交系統(tǒng)、噬菌體展示系統(tǒng)所篩選克隆的復(fù)證酵母雙雜交系統(tǒng)、噬菌體展示系統(tǒng)所篩選克隆的復(fù)證 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)核酸相互作用核酸相互作用 酶活性分析酶活性分析蛋白酶、磷酸激酶蛋白酶、磷酸激酶 鈣流檢測(cè)、離子通道研究鈣流檢測(cè)、離子通道研究 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)

5、研究FRET應(yīng)用的局限性應(yīng)用的局限性 信噪比經(jīng)常不佳，通常為信噪比經(jīng)常不佳，通常為1：1 -背景主要來自受體被直接激發(fā)的信號(hào)背景主要來自受體被直接激發(fā)的信號(hào) 檢測(cè)儀器的靈敏度、分辨率以及計(jì)算機(jī)影像采集和檢測(cè)儀器的靈敏度、分辨率以及計(jì)算機(jī)影像采集和分析軟件的能力分析軟件的能力2、表面等離子共振技術(shù)、表面等離子共振技術(shù)（surface plasmon resonance，SPR）適合于多種類型分子并且無需借助標(biāo)記物可以實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)合物直接實(shí)時(shí)測(cè)定的方法 SPRimagerII 基本原理：基本原理：基于表面等離子共振（基于表面等離子共振（SPR）技術(shù)）技術(shù)來實(shí)時(shí)跟蹤生物分子間的相互作用，而不用任何標(biāo)記來

6、實(shí)時(shí)跟蹤生物分子間的相互作用，而不用任何標(biāo)記物。實(shí)驗(yàn)時(shí)先將一種生物分子固定在傳感器芯片表面，物。實(shí)驗(yàn)時(shí)先將一種生物分子固定在傳感器芯片表面，將與之相互作用的分子溶于溶液流過芯片表面。檢測(cè)將與之相互作用的分子溶于溶液流過芯片表面。檢測(cè)器能跟蹤檢測(cè)溶液中的分子與芯片表面的分子結(jié)合、器能跟蹤檢測(cè)溶液中的分子與芯片表面的分子結(jié)合、解離整個(gè)過程的變化。解離整個(gè)過程的變化。SPR 現(xiàn)象現(xiàn)象SPR angle450 gold layerp-PolarizedLight 表面等離子共振（表面等離子共振（SPR）是一種物理現(xiàn)象，當(dāng)入射光以臨界角入射到兩種不同折是一種物理現(xiàn)象，當(dāng)入射光以臨界角入射到兩種不同折射率

7、的介質(zhì)界面（比如玻璃表面的金或銀鍍層）時(shí)，可引起金屬自由電子的共振，由于電射率的介質(zhì)界面（比如玻璃表面的金或銀鍍層）時(shí)，可引起金屬自由電子的共振，由于電子吸收了光能量，從而使反射光在一定角度內(nèi)大大減弱。其中，使反射光在一定角度內(nèi)完子吸收了光能量，從而使反射光在一定角度內(nèi)大大減弱。其中，使反射光在一定角度內(nèi)完全消失的入射角稱為全消失的入射角稱為SPR角。角。SPR隨表面折射率的變化而變化，而隨表面折射率的變化而變化，而折射率的變化又和結(jié)合折射率的變化又和結(jié)合在金屬表面的生物分子質(zhì)量成正比。在金屬表面的生物分子質(zhì)量成正比。因此可以通過獲取生物反應(yīng)過程中因此可以通過獲取生物反應(yīng)過程中SPR角的動(dòng)態(tài)變

8、化，角的動(dòng)態(tài)變化，得到生物分子之間相互作用的特異性信號(hào)。得到生物分子之間相互作用的特異性信號(hào)。 SPR 角度角度掃描曲線掃描曲線SPR angle傳統(tǒng)檢測(cè)原理傳統(tǒng)檢測(cè)原理SPR angle shift as basis of measurementSPR imaging 檢測(cè)原理檢測(cè)原理Fixed angle, fixed wavelengthD%RReflectivity change as basis of measurementSPRimager 系統(tǒng)系統(tǒng)Rotating Stage流動(dòng)相流動(dòng)相（含待分析物）（含待分析物）Gold-coated glassSPRchipp-pol lig

9、ht棱鏡棱鏡分子探針陣列分子探針陣列GWCs “SPR Imaging” 技術(shù)技術(shù)Bioarray TerminologySPRchipglassgoldattachment chemistryBiosensorAnalyteProbeMonitoring Changes: Difference Images=SA+Bim-PEGn-PEGSASAProbe ArrayProbe Array + BiotinT7Difference Image: signal due to binding of BiotinT7 to StreptavidinABAB-Monitoring Changes:

10、Image + ChartValue of Real-Time MonitoringProtein Array,End of ExperimentAg SA ConAdd Biotinylated AntibodyD D%RminEnd-point measurements miss all the action 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：分子無需標(biāo)記；分子無需標(biāo)記； 高通量（蛋白質(zhì)芯片）高通量（蛋白質(zhì)芯片） 檢測(cè)對(duì)象類型廣泛檢測(cè)對(duì)象類型廣泛 可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè) 可進(jìn)行相互作用動(dòng)力學(xué)分析可進(jìn)行相互作用動(dòng)力學(xué)分析SPRimager 系統(tǒng)系統(tǒng)靈活的陣列形式靈活的陣列形式 Rapid methods d

11、evelopment Manual spottingno spottingrobot needed Small probe volumes SpotReady, 16 or 25 spots SPRchip 1 - 400 spots Higher density arrays Higher throughput Spotting robot needed樣品無需標(biāo)記樣品無需標(biāo)記particularly valuable for protein biology Protein moleculeProtein molecule, labelled 避免引入標(biāo)簽帶來的人為干擾避免引入標(biāo)簽帶來的人為干擾 Detect in real time, measure molecular affinities Multiplex analysis from a