第九章表觀遺傳學研究實驗技術簡介

1、第九章 表觀遺傳學研究實驗技術 簡介染色體免疫共沉淀技術DNA甲基化分析技術染色體免疫共沉淀技術染色體免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation. ChIP)是基于體內(nèi)分析發(fā)展起來的方法，也稱結合位點分析法，可用于測定體內(nèi)結合在特定DNA序列上的蛋白質(zhì)。該方法主要應用于體內(nèi)核小體定位、DNA甲基化、組蛋白修飾等方面的研究。染色體免疫共沉淀技術染色質(zhì)免疫沉淀技術的原理是:在生理狀態(tài)下把細胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起，超聲破碎將染色質(zhì)隨機切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)片段，用所要研究的目的蛋白特異性抗體沉淀交聯(lián)復合體，再經(jīng)過蛋白質(zhì)與DNA解除偶聯(lián)，純化目的片段并檢測。C

2、hIP技術的步驟(1)細胞固定:在活細胞狀態(tài)下，用甲醒固定蛋白質(zhì) DNA復合物，甲醒能有效地使體內(nèi)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-RNA產(chǎn)生交聯(lián)。其中使用甲醛作為交聯(lián)劑的關鍵優(yōu)勢在于甲醒交聯(lián)反應是完全可逆的，便于在后續(xù)步驟中分別對DNA和蛋白質(zhì)進行分析。也可以使用紫外光作為交聯(lián)劑來固定細胞，它比化學交聯(lián)劑產(chǎn)生更少的干擾，但難以廣泛應用。(2)化學(微球菌酶)或者超聲破碎斷裂染色質(zhì):通常采用超聲波打斷染色質(zhì)，使其成一定大小的片段。目前一般認為500-1000bp的大小范圍是比較合適的。(3)染色質(zhì)的免疫沉淀z利用目的蛋白質(zhì)特異抗體通過抗原-抗體反應形成DNA蛋白質(zhì)抗體復合體，然后沉淀此

3、復合體，特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段;抗體的量要進行優(yōu)化，防止非特異的結合，同時要設立相應的陰性對照，以驗證抗體的有效性和抗原抗體反應的特異性。ChIP技術的步驟ChIP技術的步驟(4)解除交聯(lián)和純化DNA:在免疫沉淀復合體中加入不含DNase的RNase和蛋白酶K(也可以不加蛋白酶K.解除交聯(lián)后回收DNA.蛋白還可用于做進一步的分析). 65保溫6小時使交聯(lián)解除，得到DNA.并進行DNA的純化。(5) DNA的檢測:可以采用PCR、Southern雜交、ChIP克隆、DNA芯片等方法進行DNA的檢測。ChIP on chipChIP on chip將ChIP操作與基因芯片技術分析法(

4、chip)相結合，是研究目的蛋白質(zhì)與基因組中DNA相互作用位點的一種全基因組定位方法。實驗步驟為： 用甲醒固定細胞 超聲破碎細胞 特異抗體通過免疫沉淀富集與目的蛋白質(zhì)交聯(lián)的DNA片段 解交聯(lián)ChIP on chip 用LM-PCR擴增富集的DNA片段并用熒光染料(Cy5)進行標記;未經(jīng)免疫沉淀富集的DNA片段也用LM-PCR擴增，但是用另一種熒光染料(Cy3)標記擴增產(chǎn)物。 將這兩組標記的DNA與一張含有全基因序列的DNA芯片進行雜交。 從3次獨立的實驗獲得的免疫沉淀富集的熒光強度與未經(jīng)免疫沉淀富集的熒光強度的比值用加權平均分析法計算目的蛋白質(zhì)與芯片中的每一段序列的相對結合度。ChIP-Seq

5、ChIP-Seq技術將ChIP與第二代測序技術相結合，能夠高效地在全基因組范圍內(nèi)檢測與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段。其原理是:首先通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(ChIP)特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段，并對其進行純化與文庫構建;然后對富集得到的DNA片段進行高通量測序；最后將獲得的數(shù)百萬條序列標簽精確定位到基因組上，從而獲得全基因組范圍內(nèi)與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段信息。DNA甲基化分析技術 DNA甲基化是表現(xiàn)遺傳學的重要組成部分，在維持正常細胞功能、遺傳印記、胚胎發(fā)育以及人類腫瘤發(fā)生中起著重要作用。隨著對甲基化研究的不斷深入，其檢測方法也層出不窮。這些方法針對不同研究目的，運

6、用不同的處理方法，幾乎涵蓋了從基因到基因組各個層次水平的研究。DNA甲基化分析技術 研究方法：甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶法 重亞硫酸鹽的甲基化分析方法研究目的：基因組整體水平甲基化分析 特異性位點的DNA甲基化檢測 甲基化新位點的尋找DNA甲基化分析技術研究方法：甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶法一些限制性內(nèi)切酶的識別位點中含有CpG雙核苷酸序列，他們往往只能結合非甲基化的識別序列，而對發(fā)生甲基化的序列則沒有結合活性。這種方法不僅可以用來檢測某個基因或DNA序列的甲基化狀態(tài)，而且可以用作整個基因組甲基化狀態(tài)的篩查。在這個原理基礎上設計的研究方法有：RLGS (restriction landmark g

7、enome scanning，限制性標志物全基因組掃描)、DMH (differential methylation hybridization for methylation analysis.差異性甲基化雜交分析)、MCA Cmethylation CpG island amplification for methylation analysis，甲基化CpG島擴增子分析)DNA甲基化分析技術重亞硫酸鹽的甲基化分析方法其原理是：用重亞硫酸氫鈉在堿性條件和氫醌的催化下處理DNA可使非甲基化的胞嘧啶發(fā)生脫氨反應，從而轉(zhuǎn)變成尿嘧啶(U),而甲基化的胞嘧啶不能發(fā)生脫氨反應，因而仍保留為胞嘧啶。DN

8、A甲基化分析技術研究目的：基因組整體水平甲基化分析高效液相色譜柱（HPLC）及相關方法將DNA樣品先經(jīng)鹽酸或氫氟酸水解成堿基，水解產(chǎn)物通過色譜柱，結果與標準品比較，測量254nm處的吸收峰值，計算內(nèi)/ (5mC+5C)的積分面積就得到基因組整體的甲基化水平。這種方法的最明顯優(yōu)點是：可用于高通量混合樣本檢測，能夠明確顯示目的片段中CpG位點甲基化的情況。但存在的問題是不能對甲基化的CpG位點進行定位。免疫化學法此方法基于單克隆抗體能夠與5mC發(fā)生特異性反應的原理。應用熒光素 標記抗體使之與預先己固定在DEAE膜上的樣品DNA特異性結合，對DEAE膜上的熒光素進行掃描得到5mC的水平，其熒光素強度

9、與5mC水平成正比。這種方法較為靈敏但需要精密儀器。DNA甲基化分析技術Sssi甲基轉(zhuǎn)移酶法原理：S-腺昔甲硫氨酸(SAM)在Sssi甲基轉(zhuǎn)移 酶催化作用下使基因組DNA的CpG位點發(fā)生甲基化，在體系中加人一定量的3H-S-腺苦甲硫氨酸(3H-SAM)及Sssi甲基轉(zhuǎn)移酶反應后，測定剩余的放射性標記的S燦4即可得到原基因組整體甲基化水平，即測到的放射性強度與所測DNA甲基化水平成反比。這種方法的缺點是Sssi甲基轉(zhuǎn)移酶不穩(wěn)定，結果不夠精確，另外這種方法也是對DNA的整體CpG位點的甲基化情況檢測，不能精確定位。DNA甲基化分析技術氯乙醛法首先，將DNA經(jīng)重亞硫酸鹽處理使未甲基化的胞唔院全部轉(zhuǎn)變

10、為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變(Frommer et ai， 1992)，然后經(jīng)過銀或色譜柱去除DNA鏈上的嘌呤，再將樣品與氯乙醛共同孵育，這樣5mC就轉(zhuǎn)變?yōu)閹в袕姛晒獾囊蚁┌奏?，熒光的強度與原5mC的水平成正比。這種方法可以直接測定基因組整體5mC水平。其優(yōu)點是所用試劑價格低廉且穩(wěn)定性好，避免了放射性污染，但缺點是費時費力，而且氯乙醛是一種有毒的物質(zhì)。DNA甲基化分析技術特異性位點的DNA甲基化檢測甲基化敏感擴增多態(tài)性(methylation sensitive amplification polymorphism， MSAP)實驗原理:由于Hpall和MsI的識別序列相同(5-CCG

11、G-3)，但對甲基化的程度不同，即Hpall不能切割雙鏈甲基化的5mCCGG， C5mCGG和5mC5mCGG，但能切基化的序列，而MsI能切割C5mCGG但不能切害5mCCGG序列，因此CCGG發(fā)生甲EcoRI/Hall和EcoRI/MsI的酶切、擴增產(chǎn)物產(chǎn)生多態(tài)性。通過比較電泳譜帶的差異，可以推測CCGG的甲基化情況。DNA甲基化分析技術重亞硫酸鹽直接測序法原理：重亞硫酸鹽使DNA中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，之后進行PCR擴增所需片段，則尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶，最后，對PCR產(chǎn)物進行測序并且與未經(jīng)處理的序列比較，判斷是否CpG位點發(fā)生申基化。此方法

12、是一種可靠性及精確度很高的方法，能明確目的片段中每一個CpG位點的甲基化狀態(tài)，但需要大量的克隆測序，過程較為繁瑣、昂貴。DNA甲基化分析技術甲基化特異性的PCR(methylation-specific PCR)其基本原理是用重亞硫酸氫納處理基因組DNA，未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變，然后用3對特異性引物對所測基因的同一核昔酸序列進行擴增。此原理的關鍵在于3對特異引物的設計。DNA甲基化分析技術甲基化敏感性單核苷酸引物延伸(methylation-sensitive single nucleotide primer extension，Ms-SnuPE)原理是：先將研究序列

13、用重亞硫酸鹽處理，未甲基化的胞嘧啶全部轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。進行PCR擴增，然后取等量擴增產(chǎn)物置于2管中，分別作為Ms-SnuPE單核昔酸引物延伸的模板。設計用于Ms-SnuPE延伸的引物的3端緊鄰待測堿基。同時于2個反應體系中加人等量的Taq酶、引物、同位素標記的dCTP或dTTP。如果待測位點被甲基化，則同位素標記的dCTP會在反應延伸時連于引物末端；若是未被甲基化，則標記的dTTP參與反應。未端延伸產(chǎn)物經(jīng)電泳分離和放射活性測定后可得出C/T值，即為甲基化與非甲基化的比值，從而分析得到待測片段中CpG位點甲基化情況。DNA甲基化分析技術結合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法(comb

14、ined bisulfite restriction analysis，COBRA)DNA 樣本經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后，利用PCR擴增，擴增產(chǎn)物純化后用限制性內(nèi)切酶（BstUI)消化。若其識別序列中的C發(fā)生完全甲基化(5mCG5mCG)，則PCR擴增后保留為CGCG， BstUI能夠識別并進行切割;若待測序列中，C未發(fā)生甲基化，則PCR后轉(zhuǎn)變?yōu)門GTG， BstU I識別位點丟失，不能進行切割。這樣酶切產(chǎn)物再經(jīng)電泳分離、探針雜交、掃描定量后即可得出原樣本中甲基化的比例。DNA甲基化分析技術甲基化敏感性單鏈構象分析(methylation-specific single-strand conform

15、ation analysis， MS-SSCA)原理:先用重亞硫酸鹽處理待測片段，針對非CG二核昔酸區(qū)設計引物進行 PCR擴增，擴增產(chǎn)物變性后進行非變性的聚丙酷膠凝膠電泳，由于DNA電泳時的遷移率取決于其二級結構即DNA的空間構象，而后者又由DNA堿基的序列決定。因此，經(jīng)處理后變性的單鏈DNA將停留在聚丙酷膠膜的不同位置上，這樣甲基化與非甲基化的就被分離開，隨后進行單鏈構象多態(tài)性加以分析。DNA甲基化分析技術甲基化敏感性變性梯度凝膠電泳(methylation-specific denaturing gradient gel electrophoresis， M5-DGGE)原理：DGGE是利

16、用長度相同的雙鏈DNA片段解鏈溫度不同的原理，通過梯度變性膠將DNA片段分離開來的電泳技術。在由低到高的變性梯度膠中，雙鏈DNA片斷依據(jù)其序列的特異變性點溶化解鏈，單獨的序列將在各自具特征的變性點開始解鏈。當雙鏈DNA片段遷移到變性凝肢的一定位置，達到解鏈濃度時，開始部分解鏈，當遷移阻力與電場力平衡時， DNA片段在凝膠中基本上停止了遷移，這樣不同序列的DNA片段就被DGGE有效分離。DNA甲基化分析技術甲基化敏感性解鏈曲線分析( methylation-specific melting curve analysis， M5-MCA)將 DNA經(jīng)重亞硫酸鹽處理后用熒光素標記然后與Lightcy

17、cle聯(lián)用檢測DNA序列甲基化的方法，根據(jù)檢測到的熒光度對應的 解鏈溫度，判斷分析研究序列中甲基化的情況。在Lightcyc1e過程中，隨著溫度升高，逐漸達到DNA雙鏈各解鏈區(qū)域的解鏈溫度(T)， DNA呈區(qū)域性 逐漸解鏈，一般說來，序列中GC含量越高，對應的解鏈溫度越高。DNA甲基化分析技術熒光法（Methylight)原理: DNA樣本先用重亞硫酸鹽處理，設計一個能與待測位點互補的探針，探針的5端連接報告熒光， 3端連接猝滅熒光，隨后進行實時定量PCR。如果探針能夠與DNA雜交，則PCR過程中在引物延伸時， TaqDNA聚合酶5到3端 的外切酶活性會將探針序列上5端的報告熒光切下，猝滅熒光

18、不能再對報告熒光進行抑制，這樣報告熒光發(fā)光，測定每個循環(huán)報告熒光的強度即可得到該位點的甲基化情況及水平;同理，若標記的探針未能與DNA雜交，則引物延伸不能跳過未甲基化位點，報告熒光不被切下，不發(fā)光。DNA甲基化分析技術甲基化敏感性斑點分析(methylation sensitive dot blotassay， M5-DBA)過程:待測DNA樣本經(jīng)重亞硫酸鹽處理后，以非CG區(qū)的引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)變性后轉(zhuǎn)移到尼龍膜上平用3端DIG標記的含有2個CG(或TG)的政核昔酸探針與DNA雜交，隨后用帶有熒光標記的抗DIG抗體與之反應。與雙CG的探針獲得雜交的標本含有甲基化，而與TG探針雜交的

19、標本未被甲基化。通過比較斑點上熒光的強度測定甲基化水平。DNA甲基化分析技術 DNA甲基化微陣列法 差式甲基化雜交(differential methylation hybridization，DMH)技術 對整個基因組范圍內(nèi)高甲基化CpG島(CpG islands， CGIs)特異性篩選應用了基于甲基化敏感限制酶(methylation sensitive restriction enzymes， MERS)酶切和連接子PCR(linker-PCR)技術的差式甲基化雜交（DHM）技術。 DMH可選擇性擴增和雙色熒光標記腫瘤細胞和正常細胞的甲基化CpG島，根據(jù)其混合物與CGIs微陣列雜交熒光信

20、號的變化而獲得腫瘤細胞Is甲基化譜。DNA甲基化分析技術 甲基化特異性寡核昔酸(methylation specific oligonuleotide， MSO)微陣列 MSO對每一個被檢測基因，預先設計一對含有2個不相鄰的GC(或AC)的探針，分別用于識別甲基化和非甲基化的序列。其中含GC的探針(5-GC-GC-3)識別甲基化序列，含AC的探針(5-AC-AC-3)識別非甲基化序列，探針的5端通過linker固定于玻璃板上。首先DNA樣本經(jīng)重亞硫酸鹽處理，將非甲基化的胞喃睫變?yōu)槟蚵越蓿谆牟蛔?，再行PCR擴增，產(chǎn)物的3端用熒光素標記，移至連有探針的玻璃板上進行雜交，通過檢測雜交后產(chǎn)生的熒

21、光強度判斷待測序列中甲基化的水平。DNA甲基化分析技術 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(matrixassisted laser desorption/ionization-time of flightmass spectrometry， MALDi-TOF-MS) 其基本過程如下:基因組DNA經(jīng)重亞硫酸氫鹽修飾后用一條含T7啟動子的引物和一條C含量較高的引物進行PCR擴增，則擴增出的PCR產(chǎn)物帶有T7啟動子標簽和一段富含C的控制標簽，由于含有T7啟動子，隨后將上述PCR產(chǎn)物進行體外轉(zhuǎn)錄成RNA，RNA經(jīng)RNaseTl酶切后用MALDi-TOF檢測。DNA甲基化分析技術 甲基化新位點的尋找 限制性標記基因組掃描(restriction landmark genomic scanning， RLGS) RLGS的基本過程:先用甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶Not I消化基因組