細胞培養(yǎng)基本知識.

1、研究生實驗技能培訓講座研究生實驗技能培訓講座 細胞培養(yǎng)基本知識細胞培養(yǎng)基本知識 實驗教學中心實驗教學中心侯孟君侯孟君基本概念基本概念w細胞培養(yǎng)技術(shù)細胞培養(yǎng)技術(shù) w細胞系細胞系w細胞株細胞株w原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)w傳代傳代 細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)(cell culture)技術(shù)技術(shù) 即是選用各種細胞的即是選用各種細胞的最佳生存條件最佳生存條件對對活細胞進行培養(yǎng)和研究的技術(shù)，是廣活細胞進行培養(yǎng)和研究的技術(shù)，是廣泛應(yīng)用于醫(yī)學研究領(lǐng)域的重要技術(shù)。泛應(yīng)用于醫(yī)學研究領(lǐng)域的重要技術(shù)。細胞系細胞系w培養(yǎng)物開始培養(yǎng)物開始第一次第一次傳代培養(yǎng)后的細胞傳代培養(yǎng)后的細胞w有限細胞系（有限細胞系（Finite Cell Line

2、）w連續(xù)細胞系或無限細胞系（連續(xù)細胞系或無限細胞系（Infinite Cell Line）w腫瘤細胞系或株腫瘤細胞系或株我國已建細胞系主要為這類細胞。我國已建細胞系主要為這類細胞。 腫瘤細胞系多由癌瘤建成，多呈類上皮型細胞腫瘤細胞系多由癌瘤建成，多呈類上皮型細胞 具有不死性和異體接種致瘤性。具有不死性和異體接種致瘤性。 細胞株細胞株w用用單細胞單細胞分離培養(yǎng)增殖形成的具特定分離培養(yǎng)增殖形成的具特定生長特性的細胞群生長特性的細胞群w再由原細胞株進一步分離培養(yǎng)出與原再由原細胞株進一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細胞群，亦可稱之為亞株性狀不同的細胞群，亦可稱之為亞株。株。細胞系或細胞株的命名細胞系或細

3、胞株的命名 以供體患者的姓名命名：以供體患者的姓名命名： HeLa （來源于宮頸癌）（來源于宮頸癌）以時間地點來命名：以時間地點來命名： CHO 中國倉鼠卵巢細胞中國倉鼠卵巢細胞 （Chinese Hamster Ovary， ）宮宮-743： 宮頸癌上皮細胞，宮頸癌上皮細胞，1974年年3月建立月建立NIH3T3：美國國立衛(wèi)生研究院（：美國國立衛(wèi)生研究院（National Institute of Health）建立）建立 每每3天傳代，每次接種天傳代，每次接種3105細胞細胞ml以組織來源命名：以組織來源命名：如如BHK(幼地鼠腎細胞幼地鼠腎細胞) 以臨床疾病類型命名：以臨床疾病類型命名：

4、如如BALL-1細胞系細胞系(來自來自B淋巴細胞急性白血病人白細胞淋巴細胞急性白血病人白細胞)原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)w直接從體內(nèi)取出的細胞進行的第一次培直接從體內(nèi)取出的細胞進行的第一次培養(yǎng)物。養(yǎng)物。w優(yōu)點：優(yōu)點： 組織細胞剛脫離機體，生物性狀尚未發(fā)生組織細胞剛脫離機體，生物性狀尚未發(fā)生較大變化，在一定程度上能夠反映體內(nèi)較大變化，在一定程度上能夠反映體內(nèi)的狀態(tài)。的狀態(tài)。 大鼠肝細胞原代培養(yǎng)大鼠肝細胞原代培養(yǎng)1.細胞種類：大鼠原代肝細胞；細胞種類：大鼠原代肝細胞；2.培養(yǎng)的天數(shù)：剛分離，未經(jīng)培養(yǎng)；培養(yǎng)的天數(shù)：剛分離，未經(jīng)培養(yǎng)； 細胞狀態(tài)與特征簡述：剛分離時球形透亮，貼細胞狀態(tài)與特征簡述：剛分離時球形透亮

5、，貼壁壁 后呈不規(guī)則。后呈不規(guī)則。 傳代傳代w將細胞從一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另一個培養(yǎng)瓶即稱為傳代培養(yǎng)將細胞從一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另一個培養(yǎng)瓶即稱為傳代培養(yǎng)w原代培養(yǎng)的細胞在生長、繁殖一定時間后，由于原代培養(yǎng)的細胞在生長、繁殖一定時間后，由于空間不足空間不足或或細胞密度過大細胞密度過大導致營養(yǎng)枯竭，會影響細胞的生長，因此需要導致營養(yǎng)枯竭，會影響細胞的生長，因此需要進行擴大培養(yǎng)，即傳代或稱為傳代培養(yǎng)。進行擴大培養(yǎng)，即傳代或稱為傳代培養(yǎng)。 HepG2細胞細胞 細胞種類：人肝腫瘤細胞；細胞種類：人肝腫瘤細胞； 培養(yǎng)的天數(shù)：傳代培養(yǎng)培養(yǎng)的天數(shù)：傳代培養(yǎng)2天；天； 細胞狀態(tài)與特征簡述：呈多角型、不規(guī)則細胞狀態(tài)與特

6、征簡述：呈多角型、不規(guī)則 貼壁生長，成團聚集。貼壁生長，成團聚集。 傳代注意事項傳代注意事項w接種數(shù)量為接種數(shù)量為51048105個個/ml 傳代密度太低，細胞容易死亡，表現(xiàn)出細胞在達到傳代密度太低，細胞容易死亡，表現(xiàn)出細胞在達到增長前有增長前有較長的滯留期較長的滯留期。w培養(yǎng)液由于培養(yǎng)液由于pH下降而呈現(xiàn)下降而呈現(xiàn)黃色黃色，表明細胞已經(jīng)達到，表明細胞已經(jīng)達到最大密度需要換液或進行傳代培養(yǎng)。最大密度需要換液或進行傳代培養(yǎng)。w如果是單層貼壁的細胞，等長滿培養(yǎng)瓶表面，即可如果是單層貼壁的細胞，等長滿培養(yǎng)瓶表面，即可進行傳代。進行傳代。 細胞培養(yǎng)的基本條件細胞培養(yǎng)的基本條件w無菌條件無菌條件w細胞生

7、長條件細胞生長條件w細胞檢測條件細胞檢測條件w細胞保存條件細胞保存條件w實驗室安全實驗室安全細胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境細胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境 w無菌室的結(jié)構(gòu)：一般由更衣間、緩沖間、操無菌室的結(jié)構(gòu)：一般由更衣間、緩沖間、操作間三部分組成。作間三部分組成。 w（使用前）紫外照射（使用前）紫外照射（1小時）小時）w每周甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（每周甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（2小時）和小時）和每月新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進每月新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進行消毒行消毒 生物安全柜生物安全柜 w使用前開啟柜內(nèi)紫外燈照射使用前開啟柜內(nèi)紫外燈照射1030分鐘，分鐘，w預工作預工作1015分鐘，以除去臭氧分鐘

8、，以除去臭氧和使用工作臺面空間呈凈化狀態(tài)。和使用工作臺面空間呈凈化狀態(tài)。w使用完畢后，要用使用完畢后，要用70%酒精將臺酒精將臺面和臺內(nèi)四周擦拭干凈。面和臺內(nèi)四周擦拭干凈。w還要定期用福爾馬林熏蒸。還要定期用福爾馬林熏蒸。 常用培養(yǎng)器皿及清洗消毒常用培養(yǎng)器皿及清洗消毒 w玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗 一般經(jīng)過浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四個步驟一般經(jīng)過浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四個步驟 w新的橡膠制品洗滌方法新的橡膠制品洗滌方法 0.5M NaOH煮沸煮沸15分鐘，流水沖洗，分鐘，流水沖洗，0.5MHCl煮沸煮沸15分鐘，流水沖洗，自來水煮沸分鐘，流水沖洗，自來水煮沸2次，蒸餾水煮沸次，蒸餾水煮沸2

9、0分鐘，分鐘，50烤干備用?？靖蓚溆谩?消毒前包裝消毒前包裝w常用的包裝材料常用的包裝材料 牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、鋁箔牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、鋁箔火焰消毒火焰消毒w在無菌環(huán)境進行培養(yǎng)時，首先要點燃酒精燈。在無菌環(huán)境進行培養(yǎng)時，首先要點燃酒精燈。以后一切操作，如打開或封閉瓶口等，都需以后一切操作，如打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進行。在火焰近處并經(jīng)過燒灼進行。w培養(yǎng)瓶培養(yǎng)瓶w滴管、試管、吸管滴管、試管、吸管細胞培養(yǎng)的實驗用品細胞培養(yǎng)的實驗用品 w細胞培養(yǎng)瓶細胞培養(yǎng)瓶 w25平方厘米，正方斜頸平方厘米，正方斜頸w25平方厘米，三角斜頸平方厘米，三角斜頸w75平方厘米，正方

10、斜頸平方厘米，正方斜頸w75平方厘米，三角斜頸平方厘米，三角斜頸w150平方厘米，正方斜頸平方厘米，正方斜頸 w細胞培養(yǎng)板細胞培養(yǎng)板w 6孔，孔，w12孔，孔，w24孔，孔，w48孔孔w96孔孔w細胞培養(yǎng)皿細胞培養(yǎng)皿w 35mmw 60mm w100mm w凍存管w1.2ml w2ml，w5mlw離心管離心管w 15mlw 50mlw細胞刮細胞刮濾濾 器器大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌。酶液等均采用濾過法除菌。液氮罐何處購買細胞何處購買細胞wATCC 細胞庫細胞庫().w美國菌種保藏中心又稱美國模式

11、菌種收集中心美國菌種保藏中心又稱美國模式菌種收集中心(ATCC)是位于馬里蘭洲洛克菲勒的一家私營的，是位于馬里蘭洲洛克菲勒的一家私營的，非贏利性組織。非贏利性組織。w目前它可以提供以下物品目前它可以提供以下物品 細胞系細胞系3000種種 細菌和噬菌體細菌和噬菌體 15000種種 動植物病毒動植物病毒 2500種種 原生動物原生動物 1200種以及重組物品種以及重組物品 w歐洲動物細胞庫歐洲動物細胞庫(ECACC)和日本細胞庫和日本細胞庫(RCB) 國內(nèi)細胞庫中國科學院細胞庫中國科學院細胞庫中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心聯(lián)系方法：聯(lián)系方法：地址：

12、上海市岳陽路地址：上海市岳陽路320號，號，200031電話：電話 54920405Fax:系人：陳松華，徐惠均聯(lián)系人：陳松華，徐惠均e-mail: whttp:/ 也稱武漢大學保藏中心，是國家知識產(chǎn)權(quán)局指定的專利培也稱武漢大學保藏中心，是國家知識產(chǎn)權(quán)局指定的專利培養(yǎng)物養(yǎng)物/生物材料菌種保藏機構(gòu)生物材料菌種保藏機構(gòu)訂購程序訂購程序w向中心訂購培養(yǎng)物，可查閱向中心訂購培養(yǎng)物，可查閱CCTCC培養(yǎng)物目錄，并向培養(yǎng)物目錄，并向CCTCC提出訂購培養(yǎng)物的名稱、提出訂購培養(yǎng)物的名稱、CCTCC保藏號等內(nèi)容。保藏號等內(nèi)容。w聯(lián)系方式可通過電話、傳真，

13、信函，電子郵件等方式。聯(lián)系方式可通過電話、傳真，信函，電子郵件等方式。 電話：電話傳真：傳真E-mail:w細胞系：細胞系：300500元元/每株每株 w菌種準備時間菌種準備時間 一般情況一般情況CCTCC收到訂購人的匯款后的收到訂購人的匯款后的3-4天寄出，每周寄天寄出，每周寄送二次（周一，周五）。送二次（周一，周五）。細胞的營養(yǎng)細胞的營養(yǎng)w碳水化合物、氨基酸和脂類碳水化合物、氨基酸和脂類三大類三大類w也需要一定量的無機鹽、維也需要一定量的無機鹽、維生素和微量元素生素和微量元素細胞培養(yǎng)液細胞培養(yǎng)液 w水水w平衡鹽溶液平衡鹽溶液 wpH調(diào)

14、節(jié)液調(diào)節(jié)液w消化液消化液w抗生素溶液抗生素溶液w培養(yǎng)基培養(yǎng)基 水：新鮮配置的三蒸水或去離子水水：新鮮配置的三蒸水或去離子水桶裝水：怡寶桶裝水：怡寶細胞培養(yǎng)用液的配制細胞培養(yǎng)用液的配制平衡鹽溶液平衡鹽溶液w主要由無機鹽和葡萄糖配制而成主要由無機鹽和葡萄糖配制而成w作用作用 維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)酸堿度維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)酸堿度 w常用的緩沖液常用的緩沖液 生理鹽水生理鹽水 PBS Hanks液液 （D-Hanks常用于配制胰酶溶液）常用于配制胰酶溶液） pH調(diào)節(jié)液調(diào)節(jié)液(1) 碳酸氫鈉液碳酸氫鈉液 (2) Hepes緩沖液緩沖液 是一種可以保持細胞培養(yǎng)過程中是一種可以保持細胞培養(yǎng)過程中pH值較

15、長時值較長時間穩(wěn)定的氫離子緩沖劑間穩(wěn)定的氫離子緩沖劑通常使用濃度為通常使用濃度為1015mM 消化液消化液(1) 胰蛋白酶溶液胰蛋白酶溶液 主要作用是使細胞間的蛋白質(zhì)水解，從而使貼壁細胞從瓶壁上脫落并主要作用是使細胞間的蛋白質(zhì)水解，從而使貼壁細胞從瓶壁上脫落并使細胞游離分散開來使細胞游離分散開來 常用濃度為常用濃度為0.25%或或5%胰蛋白酶。胰蛋白酶。(2) EDTA溶液溶液 作用機制是破壞細胞間的連接。作用機制是破壞細胞間的連接。 對于一些貼壁特別牢固的細胞，可用對于一些貼壁特別牢固的細胞，可用EDTA和胰酶的混合液和胰酶的混合液 EDTA溶液的使用濃度為溶液的使用濃度為0.02%，配制時

16、應(yīng)加堿助溶，配制時應(yīng)加堿助溶 (3)膠原酶溶液膠原酶溶液 膠原酶在上皮類細胞原代培養(yǎng)時經(jīng)常使用，膠原酶作用的對象是膠原膠原酶在上皮類細胞原代培養(yǎng)時經(jīng)常使用，膠原酶作用的對象是膠原組織，因此不容易對細胞產(chǎn)生損傷。組織，因此不容易對細胞產(chǎn)生損傷。 抗生素溶液抗生素溶液w通常是通常是青霉素青霉素和和鏈霉素鏈霉素聯(lián)合使用，俗稱聯(lián)合使用，俗稱“雙抗雙抗溶液溶液”。w青霉素主要是對革蘭陽性菌有效，鏈霉素主要青霉素主要是對革蘭陽性菌有效，鏈霉素主要對革蘭陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預防絕對革蘭陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預防絕大多數(shù)細菌污染。大多數(shù)細菌污染。 培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升培

17、養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。單位。慶大霉素：每毫升慶大霉素：每毫升100單位單位 培養(yǎng)基培養(yǎng)基w分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基w天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基： 血清血清 血漿血漿 組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）組織提取液（如雞胚和牛胚浸液） 合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基 w根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。工方法模擬合成的。w包括四大類物質(zhì)：無機鹽、氨基酸、維生素、包括四大類物質(zhì)：無機鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物碳水化合物w目前常用培養(yǎng)基：目前常用培養(yǎng)基：RPMI-1640、DMEM、TC199、MEM、w

18、另有無血清培養(yǎng)基、無蛋白培養(yǎng)基另有無血清培養(yǎng)基、無蛋白培養(yǎng)基RPMI1640w最初是由最初是由G，E，Moore為培養(yǎng)小鼠白血病細為培養(yǎng)小鼠白血病細胞而設(shè)計的。胞而設(shè)計的。w開始的配方特別適合于懸浮細胞生長，主要是開始的配方特別適合于懸浮細胞生長，主要是針對淋巴細胞，后經(jīng)過改良，從針對淋巴細胞，后經(jīng)過改良，從RPMI1630、RPMI1634、直至、直至RPMI1640。w其組分較為簡單，適合許多種細胞生長，如腫其組分較為簡單，適合許多種細胞生長，如腫瘤細胞、正常細胞、原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)等。瘤細胞、正常細胞、原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)等。w尤其適合人白細胞，如尤其適合人白細胞，如H9、T-15、HL-

19、60、IM-9、Jurkat、 K-562 及及KATOIII等細胞系等細胞系的培養(yǎng)。的培養(yǎng)。RPMI1640種類種類wRPMI1640（A） （不含谷氨酰胺、可高壓滅菌）（不含谷氨酰胺、可高壓滅菌）wRPMI1640（A）無酚紅）無酚紅 （不含谷氨酰胺、高壓滅菌）（不含谷氨酰胺、高壓滅菌）wRPMI1640 （含谷氨酰胺、除菌過濾滅菌）（含谷氨酰胺、除菌過濾滅菌）DMEM細胞培養(yǎng)基細胞培養(yǎng)基w 是在是在MEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上研制的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上研制的w與與MEM比較增加了各種成分用量，同時又分為高糖型（低比較增加了各種成分用量，同時又分為高糖型（低于于4500g/L）和低糖型）和低糖型(低于低

20、于1000g/L)。w高糖型有利于細胞停泊于一個位置生長，適于生長較快、附高糖型有利于細胞停泊于一個位置生長，適于生長較快、附著較困難腫瘤細胞等。著較困難腫瘤細胞等。 w DMEM（A）【不含谷氨酰胺、可高壓滅菌】）【不含谷氨酰胺、可高壓滅菌】 DMEM（H）【含谷氨酰胺、高糖型、除菌過濾滅菌】）【含谷氨酰胺、高糖型、除菌過濾滅菌】 DMEM（L）【含谷氨酰胺、低糖型、除菌過濾滅菌】。）【含谷氨酰胺、低糖型、除菌過濾滅菌】。干粉培養(yǎng)基的配制干粉培養(yǎng)基的配制 w認真閱讀說明書。說明書都注明干粉不包含的成分，常見的認真閱讀說明書。說明書都注明干粉不包含的成分，常見的有有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮

21、酸鈉、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等。這些成分等。這些成分有些是必須添加的，如有些是必須添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根據(jù)實驗、谷氨酰胺，有些根據(jù)實驗需要決定。需要決定。w配制是要保證充分溶解，配制是要保證充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物質(zhì)都要等、谷氨酰胺等物質(zhì)都要等培養(yǎng)基完全溶解之后才能添加。培養(yǎng)基完全溶解之后才能添加。w配制所用的水應(yīng)是三蒸水，離子濃度很低。配制所用的水應(yīng)是三蒸水，離子濃度很低。w 所用器皿應(yīng)嚴格消毒。所用器皿應(yīng)嚴格消毒。 w配制好的培養(yǎng)基應(yīng)馬上過濾，無菌保存于配制好的培養(yǎng)基應(yīng)馬上過濾，無菌保存于4度。度。 血清的使用血清的使用w血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵血

22、清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵w常用血清常用血清 胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，胎牛血清是品質(zhì)最高的。清、馬血清等，胎牛血清是品質(zhì)最高的。w優(yōu)質(zhì)血清的標準優(yōu)質(zhì)血清的標準 透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、支原透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、支原體、病毒污染。體、病毒污染。w血清的滅活（消除補體活性）血清的滅活（消除補體活性） 56 ，30 分鐘。分鐘。w血清的消毒血清的消毒 過濾除菌。過濾除菌。牛血清牛血清w胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛w新牛血清取自出生新牛血清取自出生24小時之內(nèi)的新生牛小時之內(nèi)的新生牛w小牛血清取自出

23、生小牛血清取自出生1030天的小牛天的小牛w使用濃度：使用濃度： 一般為一般為520，最常用是，最常用是10 何謂何謂FBS、FCS、 CS、HS ?wFBS (fetal bovine serum) 和和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清，兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯誤的使用字眼，乃錯誤的使用字眼， 請不要再使用。請不要再使用。wCS (calf serum) 則是指小牛血清則是指小牛血清wHS (horse serum) 則是指馬血清則是指馬血清血清解凍步驟血清解凍步驟w逐步解凍法逐步解凍法 20 或或70 至至4 冰箱溶解

24、一天，至冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，一般以室溫下全溶后再分裝，一般以50 ml 無菌離無菌離心管可分裝心管可分裝4045 ml。w勿直接勿直接由由20 至至37 解凍，因溫度改變太解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。 無機鹽無機鹽wCaCl2 、KCl 、MgSO4、 NaCl 、NaHCO3 、NaH2PO4w對調(diào)節(jié)細胞滲透壓、某些酶的活性對調(diào)節(jié)細胞滲透壓、某些酶的活性及溶液的酸堿度都是必須的。及溶液的酸堿度都是必須的。 氨基酸氨基酸 w纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸

25、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸(L型型)w細胞用以合成蛋白質(zhì)的必需原料，不能由細胞用以合成蛋白質(zhì)的必需原料，不能由其他氨基酸或糖類轉(zhuǎn)化合成其他氨基酸或糖類轉(zhuǎn)化合成w谷氨酰胺谷氨酰胺具有特殊的作用，補加一定量的具有特殊的作用，補加一定量的谷氨酰胺谷氨酰胺 。wL-谷氨酰胺的降解導致氨的形成，而氨對谷氨酰胺的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性于一些細胞具有毒性 。 休息一會兒吧！休息一會兒吧！w伸伸腿，彎彎腰！體外培養(yǎng)細胞的分型體外培養(yǎng)細胞的分型 貼附型貼附型大多數(shù)培養(yǎng)細胞貼附生長，屬于貼壁依大多數(shù)培養(yǎng)細胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細胞，大致分成以下四型：賴性細胞，大致分成以下四型：w成纖維細胞

26、成纖維細胞w上皮型細胞上皮型細胞w游走細胞型游走細胞型w多型細胞型多型細胞型1、成纖維細胞型、成纖維細胞型名稱：名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細胞類似的凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細胞類似的來源：來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：真正的成纖維細胞，心肌，平滑肌，成骨細胞，真正的成纖維細胞，心肌，平滑肌，成骨細胞，血管內(nèi)皮血管內(nèi)皮形態(tài)：形態(tài)：胞體梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出胞體梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出2 23 3個長短不等個長短不等 的突起，中有卵圓形核的突起，中有卵圓形核生長特點：生長特點：排列成放射狀，漩渦狀排列成放射狀，漩渦狀 細胞細胞細胞接觸易斷開

27、而細胞接觸易斷開而單獨行動，單獨行動，游離的單獨的成纖維游離的單獨的成纖維 樣細胞，常有幾個伸長的樣細胞，常有幾個伸長的細胞突起細胞突起成纖維細胞成纖維細胞 HUVECs人臍靜脈內(nèi)皮細胞人臍靜脈內(nèi)皮細胞1.細胞種類：人臍靜脈內(nèi)皮細胞；細胞種類：人臍靜脈內(nèi)皮細胞；2.培養(yǎng)的天數(shù)：培養(yǎng)的天數(shù)：4d；原代培養(yǎng)；原代培養(yǎng)；3.放大倍速：倒置顯微鏡放大倍速：倒置顯微鏡 X20；4.培養(yǎng)基種類：培養(yǎng)基種類：DMEM+15胎牛胎牛 血清；血清；5.細胞狀態(tài)與特征簡述：細胞呈梭細胞狀態(tài)與特征簡述：細胞呈梭 形，扁平形或多角形，貼壁生長。形，扁平形或多角形，貼壁生長。 骨髓間充質(zhì)干細胞骨髓間充質(zhì)干細胞1.細胞種

28、類：人骨髓間充質(zhì)干細胞原代；細胞種類：人骨髓間充質(zhì)干細胞原代；2.培養(yǎng)天數(shù)：培養(yǎng)天數(shù)：7天；天；3.放大倍數(shù)：放大倍數(shù)：200倍，倒置顯微鏡；倍，倒置顯微鏡；4.培養(yǎng)基種類：培養(yǎng)基種類：DF12+10FBS；5.細胞狀態(tài)與特征簡述：使用細胞狀態(tài)與特征簡述：使用percoll密度密度梯度離心法分離人骨髓細胞。首次換液梯度離心法分離人骨髓細胞。首次換液48h，這是這是7天后的骨髓間充質(zhì)干細胞擴增情況。天后的骨髓間充質(zhì)干細胞擴增情況。 2、上皮型細胞、上皮型細胞名稱：名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實際上不完全相同僅形態(tài)上似體內(nèi)，實際上不完全相同來源：來源：來源于外胚層來源于外胚層、內(nèi)胚層細胞、內(nèi)胚層細胞,

29、如：如： 皮膚及其衍生物皮膚及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡消化道，乳腺，肺泡, 上皮性腫瘤上皮性腫瘤形態(tài)：形態(tài)：類似體內(nèi)的類似體內(nèi)的上皮細胞扁平上皮細胞扁平，不規(guī)則多角形不規(guī)則多角形，中有圓，中有圓形核形核 生長特點：生長特點：易相連易相連成片，成片，相靠相靠緊密相連緊密相連成薄層成薄層鋪石狀鋪石狀生長生長時呈時呈膜狀膜狀移動，移動，很少很少脫離細胞群而脫離細胞群而單個活動單個活動上皮型細胞上皮型細胞 SKOv3 （卵巢癌細胞）1.細胞種類：SKOv3（卵巢癌細胞）2.培養(yǎng)的天數(shù)：傳代后3d；3.放大倍速：倒置顯微鏡 X10；4.培養(yǎng)基種類：DMEM+5%胎牛血清；5.細胞狀態(tài)與特征簡述：細胞

30、貼壁生 長，生長速度較快。 CCL-1491.細胞種類：大鼠肺泡上皮細胞；2.培養(yǎng)的天數(shù)：1d（種在48孔板中）；3.放大倍速：倒置顯微鏡 X20；4.培養(yǎng)基種類：F12K+10%胎牛血清；5.細胞狀態(tài)與特征簡述：細胞呈梭形，透亮貼壁生長，34天傳代一次，Giemsa染色。3 3、游走細胞型：、游走細胞型：呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運動，方向不規(guī)則。此型細胞不穩(wěn)定，有時難以走或變形運動，方向不規(guī)則。此型細胞不穩(wěn)定，有時難以和其他細胞相區(qū)別。和其他細胞相區(qū)別。 CNE11.細胞種類：高分化鼻咽癌細胞系；細胞種類：高分化鼻咽

31、癌細胞系；2.培養(yǎng)的天數(shù)：培養(yǎng)的天數(shù)：3d；3.放大倍速：相差放大倍速：相差100；4.培養(yǎng)基種類：培養(yǎng)基種類：PMI1640+10%CS；5.細胞狀態(tài)與特征簡述：貼壁細胞，細胞狀態(tài)與特征簡述：貼壁細胞， 梭型成團生長。梭型成團生長。 4、多型細胞型、多型細胞型w有一些細胞，如神經(jīng)細胞難以確定其規(guī)律和有一些細胞，如神經(jīng)細胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。 SD大鼠神經(jīng)元大鼠神經(jīng)元 原代原代1.細胞種類：腦皮質(zhì)細胞；細胞種類：腦皮質(zhì)細胞；2.培養(yǎng)的天數(shù)：培養(yǎng)的天數(shù)：4-5天；天；3.放大倍速：電鏡放大倍速：電鏡20000；4.培養(yǎng)基種類：培養(yǎng)基種類：DMEM+

32、10%小牛血清小牛血清+10%馬馬 血清；血清；5.細胞狀態(tài)與特征簡述：貼壁細胞，有多量軸細胞狀態(tài)與特征簡述：貼壁細胞，有多量軸 突和樹突。突和樹突。懸浮型懸浮型概念：概念：培養(yǎng)時培養(yǎng)時不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長來源：來源：自血，脾或骨髓，尤以血中白細胞癌腫細胞自血，脾或骨髓，尤以血中白細胞癌腫細胞特點：特點：在在懸浮中生長良好懸浮中生長良好細胞細胞圓形圓形，單個或小細胞團，單個或小細胞團優(yōu)點：優(yōu)點：生存空間大，生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便提供數(shù)量大，傳代方便( (不需消化不需消化) )，易于收獲，易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài)可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺點：缺點：觀察不方便，

33、很多細胞不能懸浮生長觀察不方便，很多細胞不能懸浮生長( (尤以正常細尤以正常細胞胞) ) HL-60 分化細胞分化細胞Giemsa染色染色1. 細胞種類：細胞種類：HL-60； 2. 培養(yǎng)的天數(shù)：培養(yǎng)的天數(shù)：ATRA 1微摩爾作用微摩爾作用5天；天；3. 放大倍速：倒置顯微鏡放大倍速：倒置顯微鏡 X10；4. 培養(yǎng)基種類：培養(yǎng)基種類：1640+8胎牛血清；胎牛血清；5. 細胞狀態(tài)與特征簡述：細胞狀態(tài)與特征簡述：懸浮細胞懸浮細胞，分化的細胞核漿比例減小，核仁減少或，分化的細胞核漿比例減小，核仁減少或 消失，胞核呈桿狀或分葉狀。消失，胞核呈桿狀或分葉狀。 KU8121.細胞種類：人嗜堿細胞性白血病

34、細胞系；細胞種類：人嗜堿細胞性白血病細胞系；2.培養(yǎng)的天數(shù)：培養(yǎng)的天數(shù)：5d；3.放大倍速：倒置顯微鏡放大倍速：倒置顯微鏡 X20；4.培養(yǎng)基種類：培養(yǎng)基種類：RPMI1640+10%新生牛血清；新生牛血清；5.細胞狀態(tài)與特征簡述：細胞呈圓形，懸浮生長。細胞狀態(tài)與特征簡述：細胞呈圓形，懸浮生長。 HeLa細胞細胞1.細胞種類：人細胞種類：人HeLa細胞傳代培養(yǎng)；細胞傳代培養(yǎng)；2.培養(yǎng)的天數(shù)：培養(yǎng)的天數(shù)：7d；3.放大倍速：倒置顯微鏡放大倍速：倒置顯微鏡 X200；4.培養(yǎng)基種類：培養(yǎng)基種類：DMEM+10%小牛血清；小牛血清；5.細胞狀態(tài)與特征簡述：細胞呈多角形，貼壁生長。細胞狀態(tài)與特征簡述：

35、細胞呈多角形，貼壁生長。 K562細胞細胞1.細胞種類：細胞種類：K562（人慢性紅白血病細胞株）；（人慢性紅白血病細胞株）；2.培養(yǎng)的天數(shù)：傳代后培養(yǎng)的天數(shù)：傳代后2天；天；3.放大倍數(shù)：倒置顯微鏡放大倍數(shù)：倒置顯微鏡 X10；4.培養(yǎng)基種類：培養(yǎng)基種類：RPMI1640+10%胎牛血清，胎牛血清，4mM Glutamine；5.細胞狀態(tài)與特征簡介：懸浮生長，少數(shù)貼壁，喜愛成團懸浮。細胞狀態(tài)與特征簡介：懸浮生長，少數(shù)貼壁，喜愛成團懸浮。 每代貼壁細胞的生長過程每代貼壁細胞的生長過程w游離期游離期w貼壁期貼壁期w潛伏期潛伏期w對數(shù)生長期對數(shù)生長期w停止期（平臺期）停止期（平臺期）w游離期游離期

36、 懸浮，胞質(zhì)回縮，全部細胞變?yōu)閳A球形。懸浮，胞質(zhì)回縮，全部細胞變?yōu)閳A球形。w吸附期吸附期 貼附底物，一般貼附底物，一般24小時內(nèi)貼壁。小時內(nèi)貼壁。w潛伏期潛伏期 此時細胞有生長活動，基本無增殖。此時細胞有生長活動，基本無增殖。 細胞株潛伏期一般為細胞株潛伏期一般為624小時。小時。w對數(shù)生長期對數(shù)生長期 細胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進細胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進 行實驗研究。行實驗研究。w停止期（平臺期）停止期（平臺期） 細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂 機制：接觸抑制、密度依賴性機制：接觸抑制、密度依賴性根據(jù)細胞生長的

37、恃點，傳代方法有根據(jù)細胞生長的恃點，傳代方法有3 3種：種：1 1懸浮生長細胞傳代懸浮生長細胞傳代 離心法傳代：離心（離心法傳代：離心（10001000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/ /分分）去上清，沉淀物加新）去上清，沉淀物加新 培養(yǎng)液后再混勻傳代。培養(yǎng)液后再混勻傳代。 2 2半懸浮生長細胞傳代（半懸浮生長細胞傳代（HelaHela細胞）細胞） 此類細胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用此類細胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用 直接吹打法使細胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。直接吹打法使細胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。3 3貼壁生長細胞傳代貼壁生長細胞傳代 采用酶消化法傳代。采用酶消化法傳代。 常用的消化液有常用

38、的消化液有0.250.25的胰蛋白酶液。的胰蛋白酶液。細胞傳代方法細胞傳代方法首次傳代注意事項首次傳代注意事項w細胞生長密度不高時，不能急于傳代細胞生長密度不高時，不能急于傳代 w原代培養(yǎng)的貼壁細胞需控制消化時間原代培養(yǎng)的貼壁細胞需控制消化時間 w吹打已消化的細胞應(yīng)減少機械損傷吹打已消化的細胞應(yīng)減少機械損傷 w首次傳代時細胞接種數(shù)量要多一些首次傳代時細胞接種數(shù)量要多一些 w首次傳代培養(yǎng)的首次傳代培養(yǎng)的pH應(yīng)偏低些應(yīng)偏低些 w小牛血清濃度可加大至小牛血清濃度可加大至15%20%左右左右 細胞計數(shù)細胞計數(shù)w計數(shù)結(jié)果以每毫升細胞數(shù)表示w細胞計數(shù)的原理和方法與血細胞計數(shù)相同w血細胞計數(shù)器：手工計數(shù)細胞

39、wCoulter計數(shù)儀：人工計數(shù)細胞計數(shù)步驟細胞計數(shù)步驟w1、將血球計數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。、將血球計數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。w2、將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋、將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。片和計數(shù)板之間。w3、靜置、靜置3分鐘。分鐘。w4、鏡下觀察，計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù)。、鏡下觀察，計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù)。細胞數(shù)細胞數(shù)/ml4大格細胞總數(shù)大格細胞總數(shù)/ 4104注意注意：壓線細胞只計：壓線細胞只計左側(cè)左側(cè)和和上方上方的。的。 鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應(yīng)按單個細胞計算，鏡下偶見由兩個

40、以上細胞組成的細胞團，應(yīng)按單個細胞計算，若細胞團占若細胞團占10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。培養(yǎng)細胞活力測定培養(yǎng)細胞活力測定w細胞活力：細胞活力： 總細胞中活細胞所占的百分比總細胞中活細胞所占的百分比w由組織中分離細胞一般也要檢查活力，以了由組織中分離細胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細胞是否有損傷作用。解分離的過程對細胞是否有損傷作用。w復蘇后的細胞也要檢查活力，了解凍存和復復蘇后的細胞也要檢查活力，了解凍存和復蘇的效果。蘇的效果。測定方法測定方法w臺盼藍法 活細胞不被染色，死細胞染成藍色。w流式細胞儀 細胞活性指標通常包括細胞膜對

41、核酸染料的通透性，代謝活性，膜電位等。 3四唑鹽（MTT）比色法w四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍；wMTT比色法的原理： 活細胞中琥珀脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍紫色產(chǎn)物甲臢 （formazan)，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。 二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。 甲臢染料在A570nm處產(chǎn)生吸收值，用酶標儀測定OD值；細胞凍存和復蘇細胞凍存和復蘇w細胞深低溫保存的基本原理是：細胞深低溫保存的基本原理是： 在在70以下時，細胞內(nèi)的酶活性均己停止，以下時，細胞內(nèi)的酶活性均己停止，即代謝處于完全停止狀態(tài)，故可以長期保存。即代謝處于完全停止狀態(tài)，故