實(shí)驗(yàn)六：聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分析過(guò)氧化物酶同工酶實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、班級(jí)：植物142 姓名：劉國(guó)強(qiáng) 學(xué)號(hào)：1401080229實(shí)驗(yàn)六：聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分析過(guò)氧化物酶同工一、研究背景及目的同工酶是指能催化同一種化學(xué)反應(yīng)， 但其酶蛋白本身的分子結(jié)構(gòu)組成卻有所不同的一組酶。它們是DNA 編碼的遺傳信息表達(dá)的結(jié)果。研究表明，同工酶與生物的遺傳、生長(zhǎng)發(fā)、代謝調(diào)節(jié)及抗性等都有一定的關(guān)系。因此，測(cè)定同工酶在理論上和實(shí)踐上都有重要的意義。用聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定同工酶，方法簡(jiǎn)便、靈敏度高，重現(xiàn)性強(qiáng)，測(cè)定結(jié)果便于觀察、記錄和保存。過(guò)氧化物酶是植物體內(nèi)普遍存在的、活性較高的一種酶。它與呼吸作用、光合作用及生長(zhǎng)素的氧化等都有關(guān)系。在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中它的活性不斷發(fā)生變化。因

2、此，測(cè)定這種酶的活性或其同工酶的變化情況，可以反映某一時(shí)期植物體內(nèi)代謝的變化。本實(shí)驗(yàn)采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳技術(shù)，分離小麥幼葉葉片和根部的過(guò)氧化物酶同工酶，通過(guò)染色方法顯示出酶的不同區(qū)帶，以鑒定小麥幼苗過(guò)氧化物酶同工酶。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，主要要掌握電泳技術(shù)的原理、方法、設(shè)計(jì)、裝置、凝膠配制等問(wèn)題，熟悉所有的操作過(guò)程 二、實(shí)驗(yàn)原理本實(shí)驗(yàn)采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)，分離小麥幼葉葉片和根部的過(guò)氧化物酶同工酶。利用過(guò)氧化物酶在分解過(guò)氧化氫的過(guò)程中產(chǎn)生自由氧基，從而將聯(lián)大茴香胺連接到過(guò)氧化物酶分子上，使之呈現(xiàn)棕褐色，將電泳后的凝膠置于含有過(guò)氧化氫的聯(lián)大茴香胺染色液中浸泡，有過(guò)氧化酶同工酶蛋白的部位便可以

3、觀察到褐色的譜帶。通過(guò)這些譜帶的數(shù)量、位置等獲得相關(guān)信息。三、儀器試劑1 實(shí)驗(yàn)材料 小麥幼苗2儀器 :垂直板電泳槽(型號(hào)：DYY-III28A型電泳槽 廠家：北京市六一儀器廠) 電泳儀（型號(hào)：DYY-III2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 廠家：北京市六一儀器廠）主要器具：移液器、微量進(jìn)樣器、培養(yǎng)皿一套（直徑15cm）、小燒杯3.試劑（1）分離膠緩沖液(pH8.9 Tris-HCl緩沖液)：稱取48 mL 1mol/L HCl，Tris36.8g，用無(wú)離子水溶解后定容至100 mL。（2）分離膠貯存液(Acr-Bis貯液)：Acr 28.0g，Bis 0.735g，用無(wú)離子水溶解后定容至100 mL，過(guò)濾除去

4、不溶物，裝入棕色試劑瓶，4保存。（3）濃縮膠緩沖液，pH6.7(pH6.7 Tris-HCl緩沖液)：取48 mL 1 mol/L HCl，Tris 5.98g，用無(wú)離子水溶解后定容至100 mL。（4）濃縮膠貯存液(Acr-Bis貯液)：Acr 18.0g，Bis 0.8g，用無(wú)離子水溶解后定容至100 mL，過(guò)濾除去不溶物，裝入棕色試劑瓶，4保存。（5）TEMED：原液（6）過(guò)硫酸銨溶液：1g過(guò)硫酸銨溶于100 mL無(wú)離子水中(當(dāng)天配制)。（7）電極緩沖液，pH8.3(pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液)：Tris 6 g，甘氨酸28.8 g，溶于無(wú)離子水后定容至1 000 mL，用時(shí)稀釋

5、10倍。（8）2瓊脂：2g瓊脂，100mL pH8.9分離膠緩沖液浸泡，用前加熱溶化。（9）40%蔗糖溶液：稱取蔗糖40.0g，溶于100mL蒸餾水中。（10）pH4.7乙酸緩沖液：乙酸鈉70.52 g，溶于500 mL蒸餾水中再加36 mL冰乙酸，蒸餾水定容至1 000 mL。(11)樣品提取液（pH8.0 Tris-HCl緩沖液）：稱取Tris12.1g，加蒸餾水溶解，以HCl調(diào)節(jié)PH至8.0，定容至1000mL。（12）0.5%溴酚藍(lán)溶液：稱取0.5g溴酚藍(lán)，溶于100毫升蒸餾水中。（13）聯(lián)大茴香胺染色液：聯(lián)大茴香胺250 mg溶于140 mL 95乙醇中，加20 mL蒸餾水，使用前加

6、3過(guò)氧化氫 45 mL。此試劑有毒，用后收至黑板下方的棕色試劑瓶中。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、電泳槽的安裝（1）將貯液由冰箱取出，待與室溫平衡后再配制工作液（2）安裝電泳槽。安裝時(shí)，注意旋緊時(shí)，需均衡用力，以免夾破玻璃片。（3）用pH8.9緩沖液配制的2瓊脂溶液封底，待瓊脂凝固后即可灌制凝膠。（4）按下表所示配制分離膠貯液名稱分離膠緩沖液分離丙膠dH2OTEMED過(guò)硫酸銨用量（ml）1.32.76.00.0400.5在小燒杯中混勻后，立即灌膠，灌膠時(shí)，將電泳槽略微傾斜，用于扶穩(wěn)，將小燒杯尖端 抵在長(zhǎng)玻璃片頂端中央某點(diǎn)，小心估倒入兩玻璃片之間，灌至距短玻璃片頂端2厘米左右即可，放平電泳槽，立即用滴管在膠的

7、上層小心輕緩地覆蓋約23毫米厚的水層；灌注水層時(shí)要均勻輕緩，以防在膠頂部產(chǎn)生漏洞，影響結(jié)果，剛加水時(shí)，可看出界面，后逐漸消失，等到再出現(xiàn)界面時(shí)，表明分離膠已聚合，再靜置一會(huì)兒，便可將水倒出，可用濾紙條從一側(cè)略微吸浸，注意不要碰毀膠面，然后準(zhǔn)備灌注濃縮膠。（5）按下表所示配制濃縮膠 貯液名稱濃縮膠緩沖液濃縮丙膠H2OTEMED過(guò)硫酸銨用量（ml）0.51.02.20.0150.3配制均勻后，立即灌膠，操作同分離膠的灌注，當(dāng)膠面達(dá)到距短玻璃片?0.5?厘米左右即可，然后立即插入樣品槽模板（梳子）。聚合完成后，在電泳槽內(nèi)倒入電極緩沖液，然后小心撥出梳子，準(zhǔn)備點(diǎn)樣。2、樣品的制備稱取小麥幼苗葉片1 g

8、，放入研缽內(nèi)，加pH 8.0樣品提取液2 mL，于冰水浴中研成勻漿，然后以4 mL提取液分幾次洗入離心管，在高速離心機(jī)上以8 000r/min離心10min，倒出上清液，以等量40蔗糖及1/5體積溴酚藍(lán)指示劑混和，留作點(diǎn)樣用。同上操作，再備一份其根部的樣品液。3、點(diǎn)樣用微量進(jìn)樣品小心吸取樣品液加到樣品槽內(nèi)。上樣量：葉片樣液和根部樣液均以梯度上樣：分別為5ul、15ul、30ul4、電泳接好電源線(上槽接負(fù)極，下槽接正極)。打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電流，初始時(shí)控制在15mA左右（電壓低于600V），當(dāng)前沿進(jìn)入分離膠后，可調(diào)節(jié)電流到30mA 左右，待前沿指示染料下行至距膠板末端小于0.5厘米處，即可停止

9、電泳。整個(gè)電泳大約需時(shí)23小時(shí)。5、剝膠、染色及記錄結(jié)果垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)束之后，將垂直板從電泳槽上取下， 小心地將兩塊玻璃板分開，并小心地將凝膠置于大培養(yǎng)皿中，進(jìn)行染色反應(yīng)（樣品槽可以去掉）。過(guò)氧化物酶在分解過(guò)氧化氫的過(guò)程中產(chǎn)生自由氧基， 能使聯(lián)大茴香發(fā)生顏色反應(yīng)，產(chǎn)生褐色的化合物，所以用聯(lián)大茴香胺染色液浸泡過(guò)的凝膠板上，有過(guò)氧化物酶同工酶蛋白質(zhì)帶的部位可以看到褐色的譜帶。 染色過(guò)程如下： （1）向大培養(yǎng)皿中倒入約50mlpH4.7乙酸緩沖液，將膠板淹沒(méi)，室溫浸泡10分鐘。 （2）用漏斗回收乙酸緩沖液，加入聯(lián)大茴香胺染色液，將膠板淹沒(méi)，室溫下浸泡20分鐘，在此期間會(huì)出現(xiàn)過(guò)氧化物酶同工

10、酶的譜帶，觀察記錄酶譜。五、譜帶繪制及結(jié)果分析全模式根部電泳共出現(xiàn)了5條酶帶，由上向下可編號(hào)為1、2、3、4、5，葉部電泳共出現(xiàn)4條酶帶，與根部對(duì)比缺少4號(hào)酶帶。1、2、3號(hào)酶帶靠近負(fù)極，4、5號(hào)酶帶靠近正極。對(duì)比如下：酶帶編號(hào)根部葉部1顏色深，帶幅寬顏色淺，帶幅窄2顏色很淺，帶幅一致顏色較淺，帶幅一致3顏色很淺，帶幅窄顏色較深，帶幅寬4顏色較淺，帶幅窄無(wú)5顏色深，帶幅寬顏色很淺，帶幅窄總體：小麥幼苗根部同工酶總含量高于葉部，上方的同工酶含量根部少于葉部，下方根部多余葉部。分析：小麥根部的POD同工酶分子量小，形狀更接近球形，主要進(jìn)行脂肪的-氧化，產(chǎn)生乙酰輔酶A，經(jīng)乙醛酸循環(huán)，由異檸檬酸裂解為

11、乙醛酸和琥珀酸，加入三羧酸循環(huán)小麥葉部的POD同工酶分子量較大，主要參與光呼吸作用，將光合作用的副產(chǎn)物乙醇酸氧化為乙醛酸和過(guò)氧化氫。六、參考文獻(xiàn)1、2、七、思考題1、電泳凝膠系統(tǒng)的組成及特點(diǎn)和作用？答：組成：垂直板電泳槽、電源、電泳儀、制膠室、分離膠、濃縮膠、電極緩沖液、梳子。特點(diǎn)：聚丙烯酰胺凝膠電泳是多孔介質(zhì)，不僅可以防止對(duì)流，把擴(kuò)散降到最低，而且孔徑大小與生物分子具有相同的數(shù)量級(jí)，能主動(dòng)參與分子的分離。作用：大的DNA或者RNA分子分離。蛋白質(zhì)的凝膠電泳通常在加入十二烷基硫酸鈉的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行或者非變性凝膠電泳，或二維電泳毛細(xì)管電泳酶譜法變性梯度凝膠電泳。2、為什么電泳結(jié)果可以作為分

12、析鑒定的可信依據(jù)？答：電泳技術(shù)就是利用在電場(chǎng)的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，在不同的位置產(chǎn)生不同的譜帶，通過(guò)這些譜帶的數(shù)量、位置等可以獲得相關(guān)的信息，所以說(shuō)電泳結(jié)果可以作為分析鑒定的可信依據(jù)3、凝膠的化學(xué)聚合與光聚合有何不同？答：化學(xué)聚合的引發(fā)劑是過(guò)硫酸銨 (NH4)2S2O3（Ammonium persulfate，簡(jiǎn)寫為Ap），催化劑是N，N，N',N'-四甲基乙二胺（Tetramethylenediamine，簡(jiǎn)寫為TEMED）。在催化劑TEMED的作用下，由過(guò)硫酸銨（Ap）形成的自由基又使單體形

13、成自由基，從而引起聚合作用。TEMED在低pH時(shí)失效，會(huì)使聚合作用延遲；冷卻也可使聚合速度變慢；一些金屬抑制聚合；分子氧阻止鏈的延長(zhǎng)，防礙聚合作用。這些因素在實(shí)際操作時(shí)都應(yīng)予以控制。光聚合以光敏感物核黃素（即VB2）作為催化劑，在痕量氧存在下，核黃素經(jīng)光解形成無(wú)色基，無(wú)色基被氧再氧化成自由基，從而引起聚合作用。過(guò)量的氧會(huì)阻止鏈長(zhǎng)的增加，應(yīng)避免過(guò)量氧的存在。光聚合形成的凝膠孔徑較大，而且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸變小，不太穩(wěn)定，所以用它制備大孔徑的濃縮膠較為合適。采用化學(xué)聚合形成的凝膠孔徑較小，而且重復(fù)性好，常用來(lái)制備分離膠。4、兩個(gè)電泳槽中的電極緩沖液用過(guò)一次后，是否可以混合后再用？為什么？答：不能。因?yàn)殡姌O緩沖溶液的緩沖能力與組成緩沖溶液的組分濃度和pH值有關(guān)，在電泳過(guò)程中水會(huì)被電離生成氫氣和氧氣，兩個(gè)電泳槽的電極緩沖液用過(guò)一次后，緩沖液里離子的濃度會(huì)增大，造成緩沖液的緩沖能力發(fā)生變化，離子強(qiáng)度過(guò)大，會(huì)影響到蛋白質(zhì)的活性，使電泳速度減慢，條帶不清晰。所以不能混合后再使用。5、樣品中加入40%蔗糖溶液的作用是什么？答：增加樣品比重，使得樣品能夠沉到加樣孔底部，而不會(huì)漂出來(lái)，防止樣品擴(kuò)散，從而可以使樣品最大限度地跑到膠