熒光光度法測定維生素 B1 使用辣根過氧化物酶作為催化劑作用下的過氧化氫

1、熒光光度法測定維生素 B1 使用辣根過氧化物酶作為催化劑作用下的過氧化氫阿扎姆汗【摘要】 在這項工作中一種新的維生素 B1，基于辣根過氧化物酶 (HRP) 過氧化氫 (H2O2) 存在下的催化活性測定熒光法方法已經(jīng)完成。非熒光維生素 B1 是很容易轉(zhuǎn)化為通過在堿性介質(zhì)中催化氧化熒光化合物，即使沒有暴露在光線。觀察到的維生素 B1 的線性范圍是 0.02616.83 毫克/毫升 (RSD = 1.75%)。相關(guān)系數(shù)的校準(zhǔn)表頭偏差揚天曲線和極限的檢測發(fā)現(xiàn)，分別為 0.9964 和 0.015 毫克/毫升。發(fā)達(dá)的方法實用、 簡單、 敏感、 相對自由從共存物質(zhì)的干涉，并已成功應(yīng)用在藥物制劑中的維生素

2、B1 的測定?！娟P(guān)鍵字】 熒光法 維生素 B1 辣根過氧化物酶 過氧化氫1、引言 維生素B1 (硫胺素) 分子包括嘧啶-和噻唑份額、4-氨基-5-羥甲基-2-甲基 - 嘧啶和 5-(2-羥乙基)-4-甲基噻唑，分別由亞甲基橋（圖 1）的鏈接。人類和其他 mam 歷史學(xué)不能合成硫胺并因而依靠外源供應(yīng)的維生素 (1)。硫胺是親水的性質(zhì)，其活動二磷酸形式作為-輔酶的幾種酶 (2)。維生素 B1 在復(fù)雜酶達(dá) 3.16 億-定于線粒體能量解放中的中心作用和 NADPH 生產(chǎn)為維持細(xì)胞氧化還原、 谷胱甘肽(GSH)水平、蛋白巰組、核酸和脂肪酸合成(3)維生素B1 必要緊張(4)和人體心血管(5)系統(tǒng)的正常

3、運作。嚴(yán)重飲食不足的維生素B1會導(dǎo)致腳氣病或 韋尼克 - 科爾薩科夫綜合征(6)。 維生素B1的身體的正常功能，復(fù)雜劑量形式（7）和穩(wěn)定性因素(8，9)使維生素B1的檢定揚天重要臨床分析、食品加工、制藥工業(yè)和生物技術(shù)過程中的常見用途。許多方法已測定的維生素B1，包括古典重量 10-12)、滴定法 (15)、電化學(xué)分析 (16-23 ）、薄層法(24至第31)為調(diào)查、氣相色譜法(1000mg)毛細(xì)管電泳(3743)、高性能液相色譜 (4457)、(62) 熒光分光光度法(63-68）。在這些方法中，由于更高檢測限制或干擾的作用，重量，滴定法和許多電化學(xué)技術(shù)只適合宏觀層面測定的維生素B1。目前，使

4、用的最常見方法是高效液相色譜法、 熒光法和分光光度法。高性能液相色譜方法用于確定維生素 B1 ；雖然他們是森-本族語的說話，準(zhǔn)確的它們需要昂貴的儀器儀表和控制實驗條件。相比之下，熒光法是簡單、 敏感和選擇性。已有媒體報道了一些熒光的方法近年來，酶法測定方法已廣泛應(yīng)用于分析化學(xué)因為他們的速度和高選擇性。辣根過氧化物酶 (HRP) 是眾所周知的催化氧化 H2O2 存在基體（AH2）：AH2 +H2O2 A +2H2O (1)一般情況下，反應(yīng) (1) 適用于微量的化學(xué)的各個領(lǐng)域中的 H2O2 光度法或氟公制測定如臨床、環(huán)保和食品化學(xué)(7476)。 微量熒光法測定H2O2，有過量的非熒光 fluoro

5、chromogen，如氯氨酮 (75) 和高香草酸(77)作為AH2，數(shù)額已選定并通過反應(yīng)(1)生產(chǎn)的相應(yīng)熒光化合物的熒光強度衡量。相反，反應(yīng)(1) 進(jìn)行定量，即使存在過剩H2O2 AH2 微量。AH2 將通過測量反應(yīng)產(chǎn)物(A)可確定。他(51)確定維生素 B1 在發(fā)酵培養(yǎng)基和海水通過轉(zhuǎn)換成一種熒光化合物，以氫過氧化物辣根 過氧化物酶，治療和衍生品進(jìn)行了隨后分析法成像與熒光檢測的液體。安德森和瓊斯 (78).研究維生素 B1 可逆影響氧化 inhi-蝕性能的人類血液中性粒細(xì)胞后世博肯定到體外的辣根過氧化物酶 (HRP) H2O2鹵化物系統(tǒng)的遷移。因此，在發(fā)展的嘗試我們的知識的最佳，沒有使用面前

6、 H2O2 辣根過氧化物酶的催化活性的熒光分析法證明維生素B1的測定。開發(fā)的方法是選擇性、 簡單和敏感，并已成功應(yīng)用在藥物制劑中的維生素B1的測定。2、實驗2.1材料和試劑 硫胺素 (西格瑪、 USA) 使用了作為標(biāo)準(zhǔn)。所有試劑分析試劑級的都了。維生素 B1 (110-2 mol/L) 股票解準(zhǔn)備在 0.1mol / L 鹽酸酸。標(biāo)準(zhǔn)維生素 B1 的解決辦法被編寫的用 DI 水適當(dāng)稀釋。維生素 B1 的所有解決方案都保護(hù)免受光。辣根過氧化物酶 (HRP 類型 VI) 被購買從西格瑪 (美國)。HRP 解決方案 （1.0 U/mL） 編寫了解散解決 DI 水中的適當(dāng)數(shù)額。示例解決方案被編寫的溶解

7、與水片和稀釋至所需的濃度水平校準(zhǔn)范圍中。2.2儀器 利用 SPEX Fluorolog-2 熒光分光光度計(美國新澤西州愛迪生) 進(jìn)行了所有熒光法測量。氙弧燈 （450 W ；歐司朗、 德國) 使用了作為激發(fā)光源和光電倍增管 (R 928 濱松有限公司) 950V 作為探測器在提供動力。勵磁和排放 monochroma 器狹縫，波長遞增和積分時間被設(shè)定在 1 毫米，1 毫微米和 1s，分別。所有光譜數(shù)據(jù)和導(dǎo)數(shù)光譜獲得了使用 SPEX DM 3000F 光譜的計算機。PH 計 （模型獵戶座 520A、 美國） 用于 ph 值的調(diào)整。2.3基本過程 HRP 解決方案 （1 毫升，1.0U / mL

8、) 被添加到一個混合物 con 泰寧 1 毫升 (50mmol/L) H2O2 溶液和 3.0 毫升 （1mol/L） 氫氧化鈉?；旌衔锉环?35 C 40 分鐘沒有曝光要輕。分別在 368 nm 和 383nm，激發(fā)和發(fā)射波長測量了的混合物溶液的熒光強度。試劑空白溶液的熒光強度同樣被相同的條件下測量了。3、結(jié)果和討論3.1光譜特征 所得到從戰(zhàn)績-揚天的維生素 B1 和 H2O2 存在 HRP 下的熒光強度是產(chǎn)品的嫌疑人門控分別在激發(fā)和發(fā)射波長的 368nm 和 382nm，使用 熒光分光光度計。HRP，維生素 B1，用于優(yōu)化的絕緣紙 H2O2 和氫氧化鈉是 1.0U / mL，1 10-4

9、mol/L、 50mmol/L 和 1mol/L，分別。圖 2，從中很清楚 HRP 和 H2O2 表明強的熒光，維生素 B1 所示的 spec 掃雷具配置文件。山峰和 b 表示勵磁和排放強度、 陽自我效能感。解決方案的不辣根過氧化物酶或 H2O2 表明幾乎沒有-熒光。從圖 2 可以結(jié)束那維生素 B1 被改成了一種熒光化合物 (Ex = 368nm ；Em = 382nm 由 HRP 面前 H2O2，即使沒有暴露在光線的催化活性。這種反應(yīng)可被利用為熒光光度法測定維生素 B1。3.2 H2O2 濃度對熒光強度的影響 為了找到用于氧化的維生素 B1 下辣根過氧化物酶在堿性栽揚天 H2O2 的最佳濃度

10、，各種濃度的 H2O2 進(jìn)行了調(diào)查。圖 3 顯示了對 H2O2 濃度的熒光信號的影響在范圍 1080mmol/L 在解決方案中包含 3.5 u / mL HRP，1mol/L 氫氧化鈉和 1 10-4mol/L 維生素 B1。從圖 3 可以看出，熒光信號的增加而增加 H2O2 濃度達(dá) 50mmol/L，其次是減少了 50%至 80mmol/l。因此，50mmol/L 濃度的 H2O2 被選為進(jìn)一步的實驗。3.3 辣根過氧化物酶濃度對熒光強度的影響 為辣根過氧化物酶的最佳濃度測定的維生素 B1，辣根過氧化物酶濃度對從維生素 B1HRP氫氧化鈉H2O2 系統(tǒng)獲得的熒光強度的影響進(jìn)行了調(diào)查。H2O2

11、、氫氧化鈉和維生素 B1 的含量固定在 50mmol/L，1mol/L 和 1 10-4mol/L，分別。辣根過氧化物酶濃度超過范圍 0.53.5 U/mL 的熒光強度進(jìn)行了檢查。獲得的結(jié)果顯示在圖 4 中，從中可以看到系統(tǒng)的熒光反應(yīng)是強烈依賴于辣根過氧化物酶的濃度。強度增加達(dá) 1.0U / mL，然后逐漸減少達(dá) 3.5 u / mL。因此，辣根過氧化物酶的最佳濃度被選為 1.0U / mL。3.4氫氧化鈉濃度對熒光強度的影響 為了調(diào)查中最佳濃度的氫氧化鈉的維生素 B1 轉(zhuǎn)化為一種熒光化合物，排放強度錄維生素 B1HRPH2O2 系統(tǒng)在不同濃度的氫氧化鈉的解決方案。佛羅里達(dá)州強度超過濃度用于

12、HRP，維生素 B1 的氫氧化鈉濃度范圍 0.252.0mol/L 進(jìn)行了檢查和 H2O2 分別為 1.0 U/mL，1 10-4mmol/L 和 50mmol/L。在圖 5 中看到的結(jié)果顯示熒光信號增加達(dá) 1.0mol / L 氫氧化鈉溶液 ；這種集中后熒光強度顯著下降。因此，1.0mol / L 氫氧化鈉被選為維生素 B1 為熒光法遏制考試的最佳濃度3.5孵育時間和溫度的影響 維生素 B1 氧化的反應(yīng)是慢在房間浸蝕。為了加快反應(yīng)，維生素 B1HRPH2O2 系統(tǒng)被加熱，找到最佳的溫度和孵化時間。熒光強度達(dá)到最大值時在 35 、40 分鐘因庫屏息以待進(jìn)一步加熱和孵化有熒光反應(yīng)的恒定影響。3.

13、6維生素 B1 的校準(zhǔn)曲線 為了評估方法的分析性特征，為不同的維生素 B1 濃度，線性熒光反應(yīng)在最佳條件下進(jìn)行了調(diào)查。取得的結(jié)果，圖 6 所示。它被發(fā)現(xiàn)增加熒光強度是線性的維生素 B1.濃度對數(shù)。如圖 6 所示，熒光強度反應(yīng)是線性范圍 0.02616.83 ug 毫升含維生素 B1 濃度。回歸方程是 Y = 5.00203 E6 + 1.83987 E log C。相關(guān)系數(shù)的校準(zhǔn)曲線是 0.9964。檢測由 IUPAC 冷界定的極限 = 3 Sb/m。當(dāng)某人是空白信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差，m 是校準(zhǔn)圖形的邊坡，發(fā)現(xiàn)要 0.015 g/mL。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD) 為六個重復(fù)測量的 10 g/mL 維生

14、素 B1 是 1.75%。3.7干擾 為了調(diào)查維生素 B1 （10 g/mL），測定幾個潛在 干擾物造成的常見輔料用于平板電腦和其他的維生素，建議的方法，對作用的選擇性進(jìn)行了評估。干擾的標(biāo)準(zhǔn)定為 10%的為維生素 B1 的既定水平計算的平均熒光強度的變化。實驗結(jié)果如表 1 所示。被調(diào)查的輔料是蔗糖、 纖維素、 硬脂酸鎂、 乳糖、 淀粉、 核黃素、 鹽酸吡哆醇和 氰鈷胺。從表 1 可以看出大多數(shù)物質(zhì)的調(diào)查顯示，很少或沒有干擾。3.8分析應(yīng)用程序 所提出的方法被應(yīng)用到商業(yè)維生素 B1 片 (Biphane，興瑞和機電設(shè)備有限公司、 韓國) 和復(fù)合維生素 B 片 (椎體、 惠氏公司、 韓國) 維生素 B1 的測定。標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線用于測定的維生素 B1 ；結(jié)果在表 2 中。通過這種方法獲得的維生素 B1 的金額是在好的協(xié)議與聲稱由制造商。以研究的可靠性和此方法的適用性、 恢復(fù)進(jìn)行實驗。兩個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)維生素 B1 準(zhǔn)確地添加到示例解決方案中，其次是測量熒光反應(yīng)的增加。數(shù)據(jù)被用來評估百分比恢復(fù)。結(jié)果在表 2 中，并顯示恢復(fù)很好和可重復(fù)性的方法是可靠。4、結(jié)論 非熒光維生素 B1 容易被轉(zhuǎn)換成熒光的化合物在堿性介質(zhì)中，即使沒有暴露在光線下 H2O2 HRP 的催化活性。維生素 B1 的新熒光衍生物是有益的維生素 B1 的熒光法測定。這是測定的使用面前 H2O2 辣根過氧化物酶的催化活性的