人類染色體標本的制備及G顯帶核型分析 ppt課件

1、 人類染色體標本的制備及G顯帶核型分析安徽醫(yī)科大學根底醫(yī)學院生物學教研室安徽醫(yī)科大學根底醫(yī)學院生物學教研室 目的和要求目的和要求 1. 掌握染色體標本的制備方法和G顯帶技術。2. 熟習人類外周血淋巴細胞的培育方法及G顯帶 染色體的核型分析技術。 實驗原理實驗原理 染色體作為細胞遺傳信息的載體，出現于有絲分裂期。用于人類染色體標本制備的資料可為骨髓細胞、外周血淋巴細胞、絨毛細胞、羊水細胞等。其中最簡便的就是抽取少量外周靜脈血進展短期培育，經秋水仙素處置秋水仙素可阻斷有絲分裂期細胞中微管的聚集，使紡錘體不能構成，從而使有絲分裂停滯在中期時相，此時染色體具有最典型的外形，再經低滲、固定等處置，獲得更

2、多的中期分裂相以用于核型分析。n染色體的帶紋是染色體標本經過特殊處置后，每條染色體的帶紋是染色體標本經過特殊處置后，每條染色體上沿縱軸顯示出的一定數量、著色程度不同、染色體上沿縱軸顯示出的一定數量、著色程度不同、寬窄不等的橫紋。染色體帶是染色體固有的、穩(wěn)定寬窄不等的橫紋。染色體帶是染色體固有的、穩(wěn)定的特征。染色體的特征。染色體G G顯帶是多種顯帶技術中的一種，是顯帶是多種顯帶技術中的一種，是將染色體標本經胰蛋白酶處置后再用吉姆薩將染色體標本經胰蛋白酶處置后再用吉姆薩GiemsaGiemsa染液染色。染液染色。G G顯帶技術因其方法簡便，反顯帶技術因其方法簡便，反復性好，帶紋明晰且可長期保管而運

3、用最為廣泛。復性好，帶紋明晰且可長期保管而運用最為廣泛。n核型是指一個體細胞有絲分裂中期的一切染色體，核型是指一個體細胞有絲分裂中期的一切染色體，并按其大小、外形特征順序陳列所構成的圖像。每并按其大小、外形特征順序陳列所構成的圖像。每一個體細胞含有兩組同樣的染色體，用一個體細胞含有兩組同樣的染色體，用2n2n表示。表示。n染色體核型分析是細胞遺傳學的重要研討手段，在染色體核型分析是細胞遺傳學的重要研討手段，在臨床多種疾病如染色體病、白血病、腫瘤等的診斷臨床多種疾病如染色體病、白血病、腫瘤等的診斷及研討中具有重要意義。及研討中具有重要意義。組組 染色體號染色體號 主要特征主要特征A組組B組組 C

4、組組D組組E組組F組組G組組 123亞中著絲粒染色體亞中著絲粒染色體中央著絲粒染色體中央著絲粒染色體4 5亞中著絲粒染色體、無隨體亞中著絲粒染色體、無隨體6 12、X亞中著絲粒染色體亞中著絲粒染色體大大小小13 15近端著絲粒染色體、有隨體近端著絲粒染色體、有隨體161718亞中著絲粒染色體亞中著絲粒染色體中央著絲粒染色體中央著絲粒染色體19 20中央著絲粒染色體中央著絲粒染色體21 22、Y近端著絲粒染色體、有隨體近端著絲粒染色體、有隨體Y染色體略大、長臂平行伸展、無隨體染色體略大、長臂平行伸展、無隨體顯帶染色體：顯帶染色體：pq321123464321 52131212123 541213

5、24正常男性：正常男性：46，XY正常女性：正常女性：46，XX正常人體細胞染色體帶型方式圖正常人體細胞染色體帶型方式圖 實驗用品實驗用品 n1器具：采血器具、超凈義務臺、培育瓶、恒溫n 培育箱、恒溫水浴鍋、10 ml刻度離心管、低n 速離心機、量筒、載玻片、托盤天平、光學n 顯微鏡、染缸、電吹風、酒精燈、剪刀、膠水。n2資料：人外周靜脈血。n3試劑：RPMI-1640培育液、小牛血清、肝素、植n 物血凝素PHA、秋水仙素(20g/ml)、n 0.075 mol/L氯化鉀低滲液、0.85%生理鹽水、n 固定液甲醇:冰醋酸=3:1，現配現用、n Giemsa原液、0.25%胰蛋白酶溶液、磷酸鹽緩

6、沖n 液。 實驗步驟實驗步驟 n( (一一) )人類外周血染色體標本的制備人類外周血染色體標本的制備n1 1采集人外周靜脈血采集人外周靜脈血1ml1ml，迅速與適量肝素混勻抗凝。，迅速與適量肝素混勻抗凝。n2. 2. 超凈義務臺內將抗凝血參與超凈義務臺內將抗凝血參與RPMI-1640RPMI-1640培育液中，培育液中，每每n 瓶加瓶加0.30.30.5 ml0.5 ml全血。悄然混勻。全血。悄然混勻。n3. 373. 37恒溫培育箱靜置培育恒溫培育箱靜置培育72 h72 h左右培育左右培育24 h24 h后后程度程度n 輕搖培育瓶一次，以懸浮混勻血細胞。輕搖培育瓶一次，以懸浮混勻血細胞。n4

7、. 4. 培育至培育至686872 h72 h即終止培育前即終止培育前2 24 h4 h，每瓶，每瓶加秋加秋n 水仙素水仙素(20 g/ml)(20 g/ml)至終濃度至終濃度0.10.10.2 g/ml0.2 g/ml，輕搖輕搖n 培育瓶混勻，繼續(xù)培育培育瓶混勻，繼續(xù)培育2 24 h4 h。n5. 5. 終止培育，將培育物吹打混勻后轉移到終止培育，將培育物吹打混勻后轉移到10 ml10 ml玻璃玻璃離離n 心管，配平，心管，配平，1800 rpm 1800 rpm 離心離心6 min6 min。n6. 6. 低滲低滲 棄上清。參與棄上清。參與3737預溫的預溫的0.075 mol/L0.07

8、5 mol/L氯化鉀氯化鉀n 8 ml 8 ml，吸管悄然吹打混勻，吸管悄然吹打混勻，3737低滲處置低滲處置20 min20 min。n7. 7. 預固定預固定 參與參與1ml 1ml 新穎配制的固定液甲醇新穎配制的固定液甲醇: :冰醋酸冰醋酸n =3:1 =3:1，悄然混勻，悄然混勻，1800 rpm 1800 rpm 離心離心6 min6 min。n8. 8. 固定：棄上清，參與上述新穎固定液固定：棄上清，參與上述新穎固定液8 ml8 ml，悄然混，悄然混n 勻，室溫下靜置固定勻，室溫下靜置固定20 min20 min。n9. 9. 棄上清，反復固定棄上清，反復固定1 1次。次。n10.

9、10.棄上清，根據沉淀量多少參與適量滴數新穎固定棄上清，根據沉淀量多少參與適量滴數新穎固定n 液，悄然混勻，制成磨砂狀懸液。液，悄然混勻，制成磨砂狀懸液。n11.11.制片：取上述懸液制片：取上述懸液1 12 2滴，滴至沾有冰水或枯燥的滴，滴至沾有冰水或枯燥的n 干凈載玻片上，吹散，過火，空氣枯燥。干凈載玻片上，吹散，過火，空氣枯燥。n12.3712.37溫箱放置溫箱放置3 34 4天或天或7070烘烤烘烤2 h2 h進展老化處進展老化處n 理，以備顯帶分析用。理，以備顯帶分析用?！緦嶒灧椒ê筒襟E】1、預處置：實驗前3-4小時，取安康小鼠，每只腹腔注射001 秋水仙素03-04ml。留意不要傷

10、及內臟。2、取股骨：用一只手的拇指和食指按住小鼠的頭部，另一只手 拉住它的尾巴，用力向后拉斷其頸椎。處死后立刻用剪刀剪 開后腿上的皮毛，取出小鼠的股骨，剔除上面的肌肉，洗凈。( (二二) )人類染色體的人類染色體的G G顯帶顯帶1.1.胰蛋白酶預備：在盛有胰蛋白酶預備：在盛有45 ml 0.85%45 ml 0.85%生理鹽水的染生理鹽水的染缸缸 中加中加3 ml 0.25%3 ml 0.25%胰蛋白酶溶液，調理胰蛋白酶溶液，調理pHpH值至值至6.86.8 7.2 7.2，置，置3737恒溫水浴鍋中預溫。恒溫水浴鍋中預溫。2.2.胰蛋白酶消化處置：將經老化處置的標本片放入胰蛋白酶消化處置：將

11、經老化處置的標本片放入胰蛋胰蛋 白酶溶液中處置白酶溶液中處置2 23 min3 min，不斷輕搖載玻片以保，不斷輕搖載玻片以保證證 作用均勻充分。作用均勻充分。3.3.漂洗：迅速用漂洗：迅速用0.85%0.85%生理鹽水漂洗，以終止胰蛋白生理鹽水漂洗，以終止胰蛋白酶酶 的作用。的作用。4.4.染色：用吉姆薩義務液染色染色：用吉姆薩義務液染色101015 min15 min。5.5.沖洗枯燥：用緩流自來水沖洗載玻片，空氣枯燥沖洗枯燥：用緩流自來水沖洗載玻片，空氣枯燥或電或電 吹風吹干。吹風吹干。6.6.鏡檢：光學顯微鏡下察看分析核型。鏡檢：光學顯微鏡下察看分析核型。( (三三) G) G顯帶的核

12、型分析顯帶的核型分析1.1.選取染色體分散良好、長度適中染色體選取染色體分散良好、長度適中染色體G G顯帶核型顯帶核型 照片，首先進展計數，然后將每條染色體剪下。照片，首先進展計數，然后將每條染色體剪下。2.2.配對：同源染色體外形一樣，帶型一樣；非同源染配對：同源染色體外形一樣，帶型一樣；非同源染色體的大小，外形等帶型各異，根據這個原理，按色體的大小，外形等帶型各異，根據這個原理，按照染色體的大小、外形、著絲粒的位置，隨體的有照染色體的大小、外形、著絲粒的位置，隨體的有無和無和G G顯帶帶型等特征將顯帶帶型等特征將4646條染色體配成條染色體配成2323對。對。3.3.染色體陳列：將配成染色

13、體陳列：將配成2323對的染色體按大小次序陳列，對的染色體按大小次序陳列，一對性染色體排在最后，并把陳列好的一對性染色體排在最后，并把陳列好的2323對染色體對染色體分組貼附于實驗報告紙上。這樣，經過剪貼配對好分組貼附于實驗報告紙上。這樣，經過剪貼配對好的正常人體染色體圖即為正常人體核型圖，可寫成的正常人體染色體圖即為正常人體核型圖，可寫成 46,XX46,XX或或46,XY46,XY。正常男性染色體正常男性染色體G-顯帶核型顯帶核型人類染色體人類染色體G-G-顯帶特征口訣：顯帶特征口訣：n一禿二蛇三蝶飄 四鞭炮五黑腰n六號是個小白臉 七上八下九苗條n十號長臂近帶好 十一低來十二高n十三四十五

14、 下、中、上n十六q2縊痕大 十七長臂帶腳鐐n十八人小肚皮大 十九一點腰n二十頭重又腳輕 二十一象個葫蘆瓢n二十二頭帶小黑帽 X一擔挑，Y是黑腳 本卷須知本卷須知 n1. 1. 染色體標本制備中的關鍵要素包括秋水仙素的用量染色體標本制備中的關鍵要素包括秋水仙素的用量和作用時間、低滲和固定的處置。其中低滲時間很重要，和作用時間、低滲和固定的處置。其中低滲時間很重要，處置時間過長那么細胞膜過早破裂導致染色體喪失，處處置時間過長那么細胞膜過早破裂導致染色體喪失，處置時間缺乏那么致染色體分散不好，不利于計數分析。置時間缺乏那么致染色體分散不好，不利于計數分析。n2. G2. G顯帶過程中的關鍵要素包括胰蛋白酶的作用時間、顯帶過程中的關鍵要素包括胰蛋白酶的作用時間、溫度、溫度、pHpH等。其中胰蛋白酶溶液應等。其中胰蛋白酶溶液應373