第13章轉(zhuǎn)錄第二部分

1、二、真核生物的轉(zhuǎn)錄二、真核生物的轉(zhuǎn)錄l1.染色質(zhì)和核小體結(jié)構(gòu)對轉(zhuǎn)錄有深刻的影響染色質(zhì)和核小體結(jié)構(gòu)對轉(zhuǎn)錄有深刻的影響l2.真核細(xì)胞真核細(xì)胞RNA聚合酶高度分工聚合酶高度分工l3.啟動子以外的序列（啟動子以外的序列（順式作用元件順式作用元件）參與調(diào)節(jié)基）參與調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄因的轉(zhuǎn)錄l4.轉(zhuǎn)錄還需要許多被稱為轉(zhuǎn)錄還需要許多被稱為轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)的參與的蛋白質(zhì)的參與l5.轉(zhuǎn)錄與翻譯不存在偶聯(lián)關(guān)系轉(zhuǎn)錄與翻譯不存在偶聯(lián)關(guān)系l6.轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物多為單順反子，而原核基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物多為單順反子，而原核基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物多為多順反子物多為多順反子（一）真核生物的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的特點（一）真核生物的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的特點

2、TATA盒盒 CAAT盒盒 GC盒盒 增強(qiáng)子增強(qiáng)子 啟動子啟動子 結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因-GCGC-CAAT-TATA轉(zhuǎn)錄起始轉(zhuǎn)錄起始l順式作用元件：順式作用元件：同一同一DNA分子中具有轉(zhuǎn)錄分子中具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的特異調(diào)節(jié)功能的特異DNA序列。包括啟動子，序列。包括啟動子，增強(qiáng)子、沉默子和調(diào)增強(qiáng)子、沉默子和調(diào)控元件等?？卦取Ｕ婧思?xì)胞真核細(xì)胞RNA pol啟動子性質(zhì)啟動子性質(zhì)增強(qiáng)子和沉默子增強(qiáng)子和沉默子l增強(qiáng)子（增強(qiáng)子（enhancer）：是一種能夠大幅度增）：是一種能夠大幅度增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄效率的順式作用元件。強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄效率的順式作用元件。l沉默子（沉默子（silencer）：與增強(qiáng)子相反，是一種

3、）：與增強(qiáng)子相反，是一種阻止基因表達(dá)的順式作用元件。阻止基因表達(dá)的順式作用元件。l作用特性：作用特性：與啟動子不同，其作用與與啟動子不同，其作用與距離、方距離、方向和位置均無關(guān)向和位置均無關(guān)；對臨近的基因作用最強(qiáng)；某；對臨近的基因作用最強(qiáng)；某些增強(qiáng)子或沉默子具有組織特異性。些增強(qiáng)子或沉默子具有組織特異性。增強(qiáng)子和沉默子的作用特性增強(qiáng)子和沉默子的作用特性增強(qiáng)子作用的環(huán)出模型增強(qiáng)子作用的環(huán)出模型 （三）轉(zhuǎn)錄因子（三）轉(zhuǎn)錄因子（transcript factor,TF）l反式作用因子：反式作用因子：是能直接或間接地識別或結(jié)合各種順式是能直接或間接地識別或結(jié)合各種順式作用元件，參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)

4、。順式作用元件作用元件，參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。順式作用元件必須由反式作用因子與之結(jié)合后才能對轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用。必須由反式作用因子與之結(jié)合后才能對轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用。l轉(zhuǎn)錄因子：轉(zhuǎn)錄因子：真核真核RNA聚合酶不能識別聚合酶不能識別DNA上的啟動子，上的啟動子，識別這些啟動子序列的反式作用因子稱為識別這些啟動子序列的反式作用因子稱為轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子。l轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄中主要有兩大基本功能：一是作為裝配在轉(zhuǎn)錄中主要有兩大基本功能：一是作為裝配因子或定向因子識別和結(jié)合核心啟動子，招募因子或定向因子識別和結(jié)合核心啟動子，招募RNA聚聚合酶正確地與啟動子結(jié)合；其次是調(diào)節(jié)合酶正確地與啟動子結(jié)合；其次是

5、調(diào)節(jié)RNA聚合酶的聚合酶的活性活性參與參與RNA-pol轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄的TF TFH57（a a）（ ）TFE與與RNA-polRNA-pol結(jié)合，解螺旋酶結(jié)合，解螺旋酶30，74TFF促進(jìn)促進(jìn)RNA-pol結(jié)合及作結(jié)合及作為其他因子結(jié)合的橋梁為其他因子結(jié)合的橋梁33TFB穩(wěn)定穩(wěn)定TFD與啟動子的結(jié)合與啟動子的結(jié)合12，19，35TFA輔助輔助TBP-DNA結(jié)合結(jié)合TAF*結(jié)合結(jié)合TATA盒盒TBP* 38TFD功功能能亞基組成，分子量亞基組成，分子量(kD)轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子ATPaseATPase, ,解螺旋酶和解螺旋酶和CTDCTD激酶活性激酶活性促進(jìn)啟動子的解鏈和清空促進(jìn)啟動子的解鏈和清空T

6、FH與與RNA-pol結(jié)合，結(jié)合，協(xié)助招募協(xié)助招募TFH， 激活激活TFH，促進(jìn)啟動子解鏈，促進(jìn)啟動子解鏈57（a a）TFE30，74TFF促進(jìn)促進(jìn)RNA-pol結(jié)合及作結(jié)合及作為其他因子結(jié)合的橋梁為其他因子結(jié)合的橋梁33TFB12，19，35TFA輔助輔助-DNA結(jié)合結(jié)合TAF*結(jié)合結(jié)合TATA盒盒TBP* 38TFD功功能能亞基組成，分子量亞基組成，分子量(kD)轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子b b34（四）真核生物（四）真核生物 RNARNA聚合酶聚合酶IIII 所負(fù)責(zé)的基因轉(zhuǎn)錄過程所負(fù)責(zé)的基因轉(zhuǎn)錄過程1. 轉(zhuǎn)錄起始轉(zhuǎn)錄起始真核生物的轉(zhuǎn)錄起始上游區(qū)段比原核生物真核生物的轉(zhuǎn)錄起始上游區(qū)段比原核生物多樣

7、化，轉(zhuǎn)錄起始時，多樣化，轉(zhuǎn)錄起始時，RNA-pol不直接結(jié)合模不直接結(jié)合模板，其起始過程比原核生物復(fù)雜。板，其起始過程比原核生物復(fù)雜。轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物(pre-initiation complex, PIC)：真核生物真核生物RNA-polRNA-pol不與不與DNADNA分子直接結(jié)合，而需依靠眾多的轉(zhuǎn)錄因子分子直接結(jié)合，而需依靠眾多的轉(zhuǎn)錄因子。 POL-TFFAB由由RNA-Pol 催化轉(zhuǎn)錄的催化轉(zhuǎn)錄的PIC POL-TFFHETBPTAFTFD-A-B-DNA復(fù)合物復(fù)合物TATAABTBPTAFTATAHECTD-PPIC組裝完成，組裝完成，TFH使使CTD磷酸化磷酸化PO

8、L IIIIFCTD轉(zhuǎn)錄預(yù)起始復(fù)合物的形成INRTATAUPE-20+1IIDIIAIIBHJE轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成CTD的磷酸化INRTATAUPE-20+1IIDIIAIIBHJEPOL IIIIFCTDP P P PATP啟動子清空INRTATAUPE-20+1IIDIIAIIBHJEPOL IICTDP P P PNTPsmRNA前體轉(zhuǎn)錄延伸因子模板理論模板理論(piecing theory) 一個真核生物基因的轉(zhuǎn)錄需要一個真核生物基因的轉(zhuǎn)錄需要3至至5個轉(zhuǎn)個轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子之間互相結(jié)合，生成有活錄因子。轉(zhuǎn)錄因子之間互相結(jié)合，生成有活性，有專一性的復(fù)合物，再與性，有專一性的復(fù)合物，再

9、與RNA聚合酶搭聚合酶搭配而有針對性地結(jié)合、轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的基因。配而有針對性地結(jié)合、轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的基因。 （二）轉(zhuǎn)錄延長（二）轉(zhuǎn)錄延長轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子TFSTFS參與延伸參與延伸真核生物轉(zhuǎn)錄延長過程與原核生物大致相真核生物轉(zhuǎn)錄延長過程與原核生物大致相似，但因有核膜相隔，沒有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的似，但因有核膜相隔，沒有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的現(xiàn)象?，F(xiàn)象。 RNA-pol前移處處都遇上核小體。前移處處都遇上核小體。 轉(zhuǎn)錄延長過程中可以觀察到核小體移位和轉(zhuǎn)錄延長過程中可以觀察到核小體移位和解聚現(xiàn)象。解聚現(xiàn)象。 RNA-PolRNA-PolRNA-Pol核小體核小體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄延延長長中中的的核核小小體體移移位位轉(zhuǎn)錄方向轉(zhuǎn)錄

10、方向5 -AAUAAA-5 -AAUAAA-核酸酶核酸酶-GUGUGUGRNA-polAATAAA GTGTGTG轉(zhuǎn)錄終止的修飾點轉(zhuǎn)錄終止的修飾點5 5 3 3 3 3 加尾加尾AAAAAAA 3 mRNA 和轉(zhuǎn)錄后修飾密切相關(guān)。和轉(zhuǎn)錄后修飾密切相關(guān)。（三）轉(zhuǎn)錄終止（三）轉(zhuǎn)錄終止-3末端的產(chǎn)生和多聚腺苷酸化末端的產(chǎn)生和多聚腺苷酸化轉(zhuǎn)錄后加工轉(zhuǎn)錄后加工Post-transcriptional Processing第三節(jié)第三節(jié)一、真核生物一、真核生物mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工的轉(zhuǎn)錄后加工（一）首、尾的修飾（一）首、尾的修飾 5 端形成端形成 帽子結(jié)構(gòu)帽子結(jié)構(gòu)(m7GpppGp ) 3 端加上端加上多聚腺

11、苷酸尾巴多聚腺苷酸尾巴(poly A tail)5端加帽：端加帽：5 端端 帽子結(jié)構(gòu)的功能帽子結(jié)構(gòu)的功能C提高提高mRNA的穩(wěn)定性的穩(wěn)定性C參與識別起始密碼子的過程，提高參與識別起始密碼子的過程，提高mRNA的可翻的可翻譯性譯性C有助于有助于mRNA通過核孔從細(xì)胞核運輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)通過核孔從細(xì)胞核運輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)C提高剪接反應(yīng)的效率提高剪接反應(yīng)的效率。變性變性與成熟的與成熟的mRNA雜交；雜交；在電鏡下觀察在電鏡下觀察DNA 模板鏈模板鏈成熟的成熟的mRNA（二）（二）mRNA的剪接的剪接R-環(huán)技術(shù)環(huán)技術(shù)發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)基因斷裂基因斷裂現(xiàn)象現(xiàn)象雞卵清蛋白成熟雞卵清蛋白成熟mRNA與與DNA雜交電鏡圖雜交電鏡圖

12、DNAmRNA目目 錄錄R-環(huán)技術(shù)環(huán)技術(shù)發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)基因斷裂基因斷裂現(xiàn)象現(xiàn)象真核生物結(jié)構(gòu)基因，由若干個編碼區(qū)和非真核生物結(jié)構(gòu)基因，由若干個編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔開但又連續(xù)鑲嵌而成，去除非編碼區(qū)互相間隔開但又連續(xù)鑲嵌而成，去除非編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白質(zhì)，這些基因稱為斷裂基因。的完整蛋白質(zhì)，這些基因稱為斷裂基因。 1.斷裂基因斷裂基因(splite gene)CABD編碼區(qū)編碼區(qū) A、B、C、D非編碼區(qū)非編碼區(qū)2. 外顯子外顯子(exon)和內(nèi)含子和內(nèi)含子(intron) 外顯子外顯子在斷裂基因及其初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)，在斷裂基因及其

13、初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)，并表達(dá)為成熟并表達(dá)為成熟RNA的核酸序列，也就是基因的核酸序列，也就是基因中編碼氨基酸的序列。中編碼氨基酸的序列。 內(nèi)含子內(nèi)含子隔斷基因的線性表達(dá)而在剪接過程中被隔斷基因的線性表達(dá)而在剪接過程中被除去的核酸序列，也就是基因中不編碼氨基除去的核酸序列，也就是基因中不編碼氨基酸的序列。酸的序列。雞卵清蛋白雞卵清蛋白基因基因hnRNA首、尾修飾首、尾修飾hnRNA剪接剪接成熟的成熟的mRNA雞雞卵卵清清蛋蛋白白基基因因及及其其轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄、錄、轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄后后修修飾飾3. mRNA的剪接（的剪接（RNA splicing）mRNA的剪接：除去的剪接：除去hnRNA中的內(nèi)含子，并將中的內(nèi)含子

14、，并將相鄰的外顯子連接起來，形成成熟的相鄰的外顯子連接起來，形成成熟的m RNA。snRNP與與hnRNA結(jié)合成為結(jié)合成為剪接體（剪接體（splicesomesplicesome）核內(nèi)的蛋白質(zhì)核內(nèi)的蛋白質(zhì)小分子核糖核酸蛋白體小分子核糖核酸蛋白體（snRNPsnRNP發(fā)音為發(fā)音為 snurpssnurps ）snRNA參與剪接的主要有：參與剪接的主要有：U1-snRNP、 U2-snRNP、 U4-snRNP、 U5-snRNP和和U6-snRNP。剪接體組裝過程剪接體組裝過程剪接供體位點剪接供體位點剪接受體位點剪接受體位點分支點分支點UACUACA - AGUGU4U5U6E1E2U1U2UA

15、CUACA - AGUGU6E1E2U1、U4無活性的剪接體無活性的剪接體U5激活的剪接體激活的剪接體剪接過程中的剪接過程中的兩次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)兩次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)二、真核細(xì)胞二、真核細(xì)胞tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工的轉(zhuǎn)錄后加工tRNA前體前體RNA pol TGGCNNAGTGCGGTTCGANNCCDNA目目 錄錄RNAaseP（外切（外切酶）、內(nèi)切酶酶）、內(nèi)切酶目目 錄錄1.剪切和修剪：核糖剪切和修剪：核糖核酸酶催化核酸酶催化tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶、核苷酸轉(zhuǎn)移酶、連接酶連接酶ATPADP目目 錄錄2. 添加添加CCA3.堿基修飾堿基修飾（2）還原反應(yīng)）還原反應(yīng) 如：如：U DHU （3）核苷內(nèi)的轉(zhuǎn)位反應(yīng)）核苷內(nèi)

16、的轉(zhuǎn)位反應(yīng) 如：如：U （4）脫氨反應(yīng)）脫氨反應(yīng) 如：如：A I 如：如：A Am（1）甲基化）甲基化（1 1）（1 1）（3 3）（2 2）（4 4）目目 錄錄4.酵母酵母Pre-tRNA的剪接的剪接真核細(xì)胞真核細(xì)胞Pre-RNA具有小的內(nèi)含子具有小的內(nèi)含子三、真核細(xì)胞三、真核細(xì)胞rRNA前體的后加工前體的后加工 1)剪切、修剪和修飾剪切、修剪和修飾 2)剪接剪接 （某些真核生物，如（某些真核生物，如四膜蟲）四膜蟲）四膜蟲四膜蟲rRNA內(nèi)含子的二級結(jié)構(gòu)內(nèi)含子的二級結(jié)構(gòu)1.四膜蟲四膜蟲rRNA的剪接采用的剪接采用自我剪接自我剪接方式方式5 -端核苷酸序列端核苷酸序列四、核四、核 酶酶最簡單的核

17、酶二級結(jié)構(gòu)最簡單的核酶二級結(jié)構(gòu)錘頭狀結(jié)構(gòu)錘頭狀結(jié)構(gòu)(hammerhead structure) 通常為通常為60個核苷酸個核苷酸左右左右 同一分子上包括有同一分子上包括有催化部份和底物部催化部份和底物部份份 催化部份和底物部催化部份和底物部份組成錘頭結(jié)構(gòu)份組成錘頭結(jié)構(gòu) 除除rRNA外，外，tRNA、mRNA的加工也可采用的加工也可采用自我剪接方式。自我剪接方式。 2. 2.核酶：核酶：具有催化性質(zhì)的具有催化性質(zhì)的RNA底物部分底物部分3.核酶研究的意義核酶研究的意義 反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄Reverse Transcription反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase） ： 以以R

18、NA為模板，四種為模板，四種dNTP為底物，依據(jù)堿基互為底物，依據(jù)堿基互補(bǔ)原則指導(dǎo)合成補(bǔ)原則指導(dǎo)合成DNA鏈的酶，又稱逆轉(zhuǎn)錄酶、反鏈的酶，又稱逆轉(zhuǎn)錄酶、反向轉(zhuǎn)錄酶。含有此種酶的病毒稱為向轉(zhuǎn)錄酶。含有此種酶的病毒稱為反轉(zhuǎn)錄病毒反轉(zhuǎn)錄病毒。l反轉(zhuǎn)錄酶含有兩個亞基，小亞基是大亞基的特異性水反轉(zhuǎn)錄酶含有兩個亞基，小亞基是大亞基的特異性水解產(chǎn)物，它的作用是保護(hù)大亞基免受水解。解產(chǎn)物，它的作用是保護(hù)大亞基免受水解。l大亞基具有三個酶活性：（大亞基具有三個酶活性：（1）53的依賴于的依賴于RNA的的DNA聚合酶活性，該活性用來催化負(fù)鏈聚合酶活性，該活性用來催化負(fù)鏈DNA的合的合成；（成；（2）核糖核酸酶）核

19、糖核酸酶H活性，該活性用來水解活性，該活性用來水解RNA引物和基因組引物和基因組RNA；（；（3）53的依賴于的依賴于DNA的的DNA聚合酶活性，該活性用來合成正鏈聚合酶活性，該活性用來合成正鏈DNA。HIV-1反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶p51p66指形區(qū)指形區(qū)掌狀區(qū)掌狀區(qū)拇指區(qū)拇指區(qū)RNase HDNA連接區(qū)連接區(qū)RNA模模板板一、反轉(zhuǎn)錄過程 RNA指導(dǎo)指導(dǎo)的的DNA合成合成反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶 RNA水解水解RNase H DNA指導(dǎo)指導(dǎo)的的DNA合成合成DNA 聚合酶聚合酶二、轉(zhuǎn)錄與癌變癌基因癌基因(oncogene，onc)：病毒基因組中的一些特殊序病毒基因組中的一些特殊序列，進(jìn)入宿主細(xì)胞后，可誘發(fā)癌癥，又稱病毒癌列，進(jìn)入宿主細(xì)胞后，可誘發(fā)癌癥，又稱病毒癌基因基因(virus oncogene，v-onc)。原癌基因原癌基因(proto-oncogenes , pro-onc)：存在于宿