二張基因工程制藥目的基因的分離PPT教案

1、會計學(xué)1二張基因工程制藥目的基因的分離二張基因工程制藥目的基因的分離2第1頁/共57頁3第一節(jié)第一節(jié) 分離目的基因的方法及原理分離目的基因的方法及原理1第2頁/共57頁4第3頁/共57頁5 第4頁/共57頁第5頁/共57頁7第6頁/共57頁8第7頁/共57頁9區(qū)段的雜交細(xì)區(qū)段的雜交細(xì)胞株分離胞株分離RNA,RNA,反轉(zhuǎn)錄合成反轉(zhuǎn)錄合成cDNAcDNA第8頁/共57頁10細(xì)胞為材料，細(xì)胞為材料，提取提取RNARNA，構(gòu)，構(gòu)成成cDNAcDNA文庫。文庫。第9頁/共57頁11第10頁/共57頁12第11頁/共57頁13第12頁/共57頁第13頁/共57頁15第14頁/共57頁方法：合成cDNA第一

2、鏈 5AAAAAA 3 mRNA TTTTTTT 5 cDNA 1 Oligo(dT)，反轉(zhuǎn)錄酶 d NTP, 合成cDNA第二鏈 AAAAAA 3 cDNA 2 TTTTTTT 5 RNase H，DNA聚合酶, dNTP 5 AAAAAA 3 雙鏈 cDNA 3 TTTTTTT 5第15頁/共57頁第16頁/共57頁第17頁/共57頁19第18頁/共57頁20第19頁/共57頁21第20頁/共57頁22第21頁/共57頁23第22頁/共57頁24第23頁/共57頁25第24頁/共57頁2623第25頁/共57頁27第26頁/共57頁28第27頁/共57頁29第28頁/共57頁30第29頁/

3、共57頁314第30頁/共57頁32第31頁/共57頁F細(xì)胞mRNA。 F細(xì)胞中特異表達(dá)的cDNA文庫（即差示文庫）（F細(xì)胞cDNA第一鏈）代表F細(xì)胞特異表達(dá)的基因（H細(xì)胞mRNA） 。 。 。第32頁/共57頁34第33頁/共57頁35第34頁/共57頁36第35頁/共57頁37第36頁/共57頁38第37頁/共57頁39第38頁/共57頁40 第39頁/共57頁41第40頁/共57頁42第41頁/共57頁5GAGTCACACTTGAC 3待測單鏈DNA 3CTG 5引物、Klenow酶、d AT P 、 d G T P 、dCTP、dTTP和少量-32P-dATP 加ddATP反應(yīng)3ACT

4、G 53AACTG 53AGTGTGAACTG 5加ddCTP反應(yīng)3CAGTGTGAACTG 53CTCAGTGTGAACTG5加ddTTP反應(yīng)3TGAACTG 53TGTGAACTG 53TCAGTGTGAACTG5加ddGTP反應(yīng)3GAACTG 53GTGAACTG 53GTGTGAACTG5GAGTCACACTT變性凝膠電泳、放射自顯影 A C T G 5第42頁/共57頁44第43頁/共57頁45第44頁/共57頁46第45頁/共57頁47與靶與靶DNADNA鏈序列互補(bǔ)的寡核苷鏈序列互補(bǔ)的寡核苷酸酸第46頁/共57頁48第47頁/共57頁49第48頁/共57頁50 原理原理 使特定的堿

5、基首先被化學(xué)修飾，然后再經(jīng)化學(xué)使特定的堿基首先被化學(xué)修飾，然后再經(jīng)化學(xué)處理。如：用硫酸二甲酯使鳥嘌呤甲基化，然處理。如：用硫酸二甲酯使鳥嘌呤甲基化，然后再加哌啶，使甲基化的鳥嘌呤丟失，后再加哌啶，使甲基化的鳥嘌呤丟失，DNADNA鏈鏈從鳥嘌呤修飾處后的從鳥嘌呤修飾處后的3 3，5 5- -磷酸二酯鍵斷裂。磷酸二酯鍵斷裂。第49頁/共57頁51 自動測序儀基于自動測序儀基于2 2，3-3-雙脫氧末端終止法的原雙脫氧末端終止法的原理，標(biāo)記系統(tǒng)由放射性核素改為發(fā)特定熒光信號理，標(biāo)記系統(tǒng)由放射性核素改為發(fā)特定熒光信號的熒光染料，預(yù)先將四種熒光染料與四種雙脫氧的熒光染料，預(yù)先將四種熒光染料與四種雙脫氧核苷三磷酸共價相連，使其帶有不同的熒光標(biāo)記核苷三磷酸共價相連，使其帶有不同的熒光標(biāo)記。當(dāng)某一種。當(dāng)某一種ddNTPddNTP摻入到正在合成的摻入到正在合成的DNADNA單鏈分單鏈分子中時，該鏈的延伸便終止并帶有相應(yīng)的熒光染子中時，該鏈的延伸便終止并帶有相應(yīng)的熒光染料。料。 自動測序系統(tǒng)包括電泳分離系統(tǒng)、熒光檢測裝自動測序系統(tǒng)包括電泳分離系統(tǒng)、熒光檢測裝置、計算機(jī)成像系統(tǒng)及分析軟件組合。置、計算機(jī)成像系統(tǒng)及分析軟件組合。6第50頁/共57頁52序序 列列 圖圖 譜譜(ABI PRISM 37