CML的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

1、We Prompt the Applications & Innovations of Laboratory HematologyCMLCML的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)概述的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)概述道道培血液培血液 腫瘤中心腫瘤中心 劉紅星劉紅星2014-09-212014-09-21北京北京We Prompt the Applications & Innovations of Laboratory HematologyCMLCML的病因和治療的病因和治療BCR-ABL1 DNABCR-ABL1 mRNA 0.1-1KBCR-ABL1 Protein n*0.1M主要代謝酶：主要代謝酶：CYP3A4抑

2、制：抑制：CYP2C9；CYP2C19TKIs血漿藥物濃度血漿藥物濃度TKIs持續(xù)增殖持續(xù)增殖凋亡凋亡抑制抑制We Prompt the Applications & Innovations of Laboratory HematologyCMLCML的主要實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)項(xiàng)目的主要實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)項(xiàng)目項(xiàng)目項(xiàng)目檢測(cè)靈敏度檢測(cè)靈敏度優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)缺點(diǎn)其它其它血常規(guī)血常規(guī)初診時(shí)常可目測(cè)到初診時(shí)?？赡繙y(cè)到白細(xì)胞數(shù)目的增加白細(xì)胞數(shù)目的增加費(fèi)用費(fèi)用低低特異性差特異性差血細(xì)胞形態(tài)血細(xì)胞形態(tài)可反映可反映CP、AP、BC直觀直觀的骨髓和外周血的骨髓和外周血細(xì)胞細(xì)胞檢查檢查非特異，檢測(cè)靈敏度有限非特異，檢測(cè)靈敏度有限

3、染色體核型染色體核型10-1可反映附加的染色體可反映附加的染色體異常異常；可反映；可反映AP、BC靈敏度有限，報(bào)告周期長(zhǎng)，靈敏度有限，報(bào)告周期長(zhǎng)，有一定的培養(yǎng)失敗率有一定的培養(yǎng)失敗率FISH10-3特異、可特異、可反映細(xì)胞內(nèi)反映細(xì)胞內(nèi)BCR-ABL1擴(kuò)增擴(kuò)增費(fèi)用較高，檢測(cè)靈敏度有費(fèi)用較高，檢測(cè)靈敏度有限限多用作驗(yàn)證檢多用作驗(yàn)證檢測(cè)測(cè)RQ-PCRBCR-ABL1 mRNA10-4.5-10-5.5靈敏度高，特異性好，靈敏度高，特異性好，報(bào)告快報(bào)告快對(duì)質(zhì)控要求嚴(yán)格；定量值對(duì)質(zhì)控要求嚴(yán)格；定量值不直接反映細(xì)胞數(shù)的比例不直接反映細(xì)胞數(shù)的比例TKIs耐藥突變耐藥突變15-20%；2-5%檢測(cè)主要的耐藥檢

4、測(cè)主要的耐藥原因；原因；指導(dǎo)換藥指導(dǎo)換藥耐藥耐藥因素之一因素之一TKIs血藥濃度血藥濃度10ng/ml-輔助個(gè)體化用輔助個(gè)體化用藥藥CYP3A4基因遺傳多樣性基因遺傳多樣性綜合的影響因素綜合的影響因素輔助個(gè)體化用輔助個(gè)體化用藥藥CP:慢性期；慢性期；AP:加速期；加速期；BC:急變期；急變期；FISH:熒光原位雜交熒光原位雜交RQ-PCRRQ-PCR定量檢測(cè)定量檢測(cè)BCR-ABL1 mRNABCR-ABL1 mRNAWe Prompt the Applications & Innovations of Laboratory Hematology為什么為什么RQ-PCRRQ-PCR檢測(cè)靈

5、敏度檢測(cè)靈敏度更更高？高？BCR-ABL1 mRNAABL1 mRNA各約各約n*1KBCR-ABL1 DNA常規(guī)取2-5106細(xì)胞起始約2-5108-9個(gè)目標(biāo)分子混勻在一起供下游檢測(cè)裂解細(xì)胞抽提mRNA染色體核型：染色體核型：需要對(duì)每個(gè)細(xì)胞的所有染色體進(jìn)行人工分析，常規(guī)分析20個(gè)細(xì)胞的核型RQ-PCRFISH：需要人工每個(gè)細(xì)胞的雜交信號(hào)，常規(guī)瀏覽數(shù)千個(gè)細(xì)胞，分析300-500個(gè)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化為熒光信號(hào)進(jìn)行定量和比例分析We Prompt the Applications & Innovations of Laboratory HematologyRQ-PCRRQ-PCR的影響因素的影響因

6、素細(xì)胞裂解提取RNA有核細(xì)胞懸液制備反轉(zhuǎn)錄（R）Q-PCR和定量信號(hào)分析起始標(biāo)本量；起始標(biāo)本量；疾病狀況；疾病狀況；標(biāo)本保存、運(yùn)輸；標(biāo)本保存、運(yùn)輸；制備制備的的細(xì)胞質(zhì)量細(xì)胞質(zhì)量RNA提取效率，提取效率，完整程度（不完整程度（不易保證和評(píng)估）易保證和評(píng)估）反轉(zhuǎn)錄效率反轉(zhuǎn)錄效率（不易評(píng)估）（不易評(píng)估）RNA極易降解，對(duì)操作人員和實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控要求高極易降解，對(duì)操作人員和實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控要求高目的基因和內(nèi)參基目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率差異；因的擴(kuò)增效率差異；分析參數(shù)的設(shè)置；分析參數(shù)的設(shè)置；標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的準(zhǔn)確性確性反轉(zhuǎn)錄酶、擴(kuò)增酶、引物、探針等各種生化試劑的質(zhì)控保證，每一環(huán)節(jié)出錯(cuò)都可導(dǎo)致假陰性

7、反轉(zhuǎn)錄酶、擴(kuò)增酶、引物、探針等各種生化試劑的質(zhì)控保證，每一環(huán)節(jié)出錯(cuò)都可導(dǎo)致假陰性PCR的獨(dú)特特點(diǎn)：對(duì)目標(biāo)分子擴(kuò)增百萬(wàn)倍，容易造成小分子的擴(kuò)增產(chǎn)物污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性的獨(dú)特特點(diǎn)：對(duì)目標(biāo)分子擴(kuò)增百萬(wàn)倍，容易造成小分子的擴(kuò)增產(chǎn)物污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性We Prompt the Applications & Innovations of Laboratory HematologyRQ-PCRRQ-PCR的影響因素的影響因素定量結(jié)果不直接反映腫瘤細(xì)胞定量結(jié)果不直接反映腫瘤細(xì)胞比例：比例：l 細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破碎，單個(gè)細(xì)胞的目的基因和內(nèi)參基因表達(dá)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破碎，單個(gè)細(xì)胞的目的基因和內(nèi)參基因表達(dá)的mRNA分子數(shù)存

8、在變數(shù)。分子數(shù)存在變數(shù)。l 定量過(guò)程中的指數(shù)換算，導(dǎo)致內(nèi)參基因和目的基因擴(kuò)增效率的微小差異會(huì)對(duì)結(jié)果有顯著定量過(guò)程中的指數(shù)換算，導(dǎo)致內(nèi)參基因和目的基因擴(kuò)增效率的微小差異會(huì)對(duì)結(jié)果有顯著影響。影響。l 標(biāo)本處理和反轉(zhuǎn)錄步驟主要影響檢測(cè)靈敏度；定量值準(zhǔn)確性主要受標(biāo)本處理和反轉(zhuǎn)錄步驟主要影響檢測(cè)靈敏度；定量值準(zhǔn)確性主要受Q-PCR時(shí)擴(kuò)增效率的差異影響。時(shí)擴(kuò)增效率的差異影響。雖然影響因素復(fù)雜多樣，但如果熟知各環(huán)節(jié)的影響因素，做好質(zhì)控，需要雖然影響因素復(fù)雜多樣，但如果熟知各環(huán)節(jié)的影響因素，做好質(zhì)控，需要時(shí)有能力根據(jù)標(biāo)本情況調(diào)整實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)，生物實(shí)驗(yàn)仍可有非常好的重復(fù)性。時(shí)有能力根據(jù)標(biāo)本情況調(diào)整實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)，生物實(shí)驗(yàn)

9、仍可有非常好的重復(fù)性。Konstantin B. Ignatov, et al. BioTechniques 2014:57:81-87Minami F. Yamada, et al. /10.1620/tjem.214.97We Prompt the Applications & Innovations of Laboratory HematologyRQ-PCRRQ-PCR定定量值的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化（量值的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化（ISIS）主要是為了不同實(shí)驗(yàn)室間的檢測(cè)結(jié)果可主要是為了不同實(shí)驗(yàn)室間的檢測(cè)結(jié)果可比比l CF:CF:各實(shí)驗(yàn)室的轉(zhuǎn)換系數(shù)；各實(shí)驗(yàn)室的轉(zhuǎn)換系數(shù)；IS:IS:國(guó)

10、際標(biāo)準(zhǔn)化國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化值值l 主要是報(bào)告檢測(cè)值的可比性，和檢測(cè)靈敏度主要是報(bào)告檢測(cè)值的可比性，和檢測(cè)靈敏度無(wú)關(guān)無(wú)關(guān)l 尤其各實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)方案不同時(shí)尤其各實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)方案不同時(shí)需要需要前提是各實(shí)驗(yàn)室各自的檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性前提是各實(shí)驗(yàn)室各自的檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好好目前國(guó)內(nèi)絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都采用目前國(guó)內(nèi)絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都采用EAC-2003EAC-2003方案方案l 理論上采用同一定量方案的實(shí)驗(yàn)室間應(yīng)該具有比較天然的可比理論上采用同一定量方案的實(shí)驗(yàn)室間應(yīng)該具有比較天然的可比性性Europe Against Cancer ProgramLeukemia (2003) 17, 23182357Richar

11、d D. Press, et al. J Mol Diagn 2013, 15: 565-76Minami F. Yamada, et al. /10.1620/tjem.214.97We Prompt the Applications & Innovations of Laboratory Hematology標(biāo)本送檢：骨髓還是外周血？標(biāo)本送檢：骨髓還是外周血？S Branford, et al. Leukemia (2006) 20, 19251930Adelaide 實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的一項(xiàng)24例例CML患者的患者的PB/BM對(duì)照檢測(cè)：對(duì)照檢測(cè)：3例患

12、者檢測(cè)結(jié)果有持續(xù)的差異；例患者檢測(cè)結(jié)果有持續(xù)的差異；其它其它11例患者有至少例患者有至少1次出現(xiàn)檢測(cè)值差異。認(rèn)為由于取材方便，次出現(xiàn)檢測(cè)值差異。認(rèn)為由于取材方便，PB仍可作為常規(guī)檢測(cè)的標(biāo)本。仍可作為常規(guī)檢測(cè)的標(biāo)本。We Prompt the Applications & Innovations of Laboratory HematologyBCR-ABL1BCR-ABL1定量報(bào)告定量報(bào)告OHare T, et al. Nat Rev Cancer. 2012;12(8):513-26. 反映本次檢測(cè)的靈敏度反映本次檢測(cè)的靈敏度ABL1內(nèi)參內(nèi)參數(shù)數(shù)31250We Prompt the

13、Applications & Innovations of Laboratory HematologyBCR-ABL1BCR-ABL1定量值定量值: :降的越快越安全降的越快越安全腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一般腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一般規(guī)律，治療規(guī)律，治療反應(yīng)反應(yīng)快快的患者的患者：l 可能可能除除BCR-ABL1外的其它伴隨突變相對(duì)外的其它伴隨突變相對(duì)較少、基因組較少、基因組不穩(wěn)定因素較少。不穩(wěn)定因素較少。l 殘存殘存的腫瘤細(xì)胞少，出現(xiàn)繼發(fā)突變的概率減低。的腫瘤細(xì)胞少，出現(xiàn)繼發(fā)突變的概率減低。Baccarani M, Soverini S. Blood. 2014;124(4):469-71TKIsT

14、KIs耐藥突變耐藥突變We Prompt the Applications & Innovations of Laboratory HematologyTKIsTKIs耐藥突變和檢測(cè)方法學(xué)耐藥突變和檢測(cè)方法學(xué)Cowan-Jacob et al. Mini Rev Med Chem 2004;4:285-99l大多數(shù)用大多數(shù)用基因測(cè)序法，激酶區(qū)全長(zhǎng)的突變均可分析基因測(cè)序法，激酶區(qū)全長(zhǎng)的突變均可分析適用于目前所有的適用于目前所有的ABL1-TKIsl特異性檢測(cè)特異性檢測(cè)BCR-ABL1的激酶區(qū)：有融合基因即可測(cè)序的激酶區(qū)：有融合基因即可測(cè)序BCR-ABL1定量為定量為陰性時(shí)，也有可能可完成

15、檢測(cè)陰性時(shí)，也有可能可完成檢測(cè)l基因突變的檢測(cè)靈敏度基因突變的檢測(cè)靈敏度（占所有（占所有BCR-ABL1的比例的比例）1代測(cè)序的突變檢測(cè)靈敏度約代測(cè)序的突變檢測(cè)靈敏度約15%2代測(cè)序可達(dá)代測(cè)序可達(dá)2-5%；更高度靈敏度意義不大；更高度靈敏度意義不大We Prompt the Applications & Innovations of Laboratory Hematology耐耐藥突變產(chǎn)生的內(nèi)在原因藥突變產(chǎn)生的內(nèi)在原因CMLCML腫瘤干細(xì)胞的基因組不穩(wěn)定性是腫瘤干細(xì)胞的基因組不穩(wěn)定性是TKITKI耐藥突變、耐藥突變、IKZF1IKZF1缺失、缺失、TP53TP53突變的內(nèi)在原因。突變的

16、內(nèi)在原因。ImatinibImatinib可以抑制可以抑制BCR-ABL1BCR-ABL1，但并不能抑制，但并不能抑制CMLCML腫瘤干細(xì)胞中的氧自由基和腫瘤干細(xì)胞中的氧自由基和DNADNA的氧化損傷。的氧化損傷。激酶活性1mM imatinib28h后氧自由基DNA氧化損傷Elisabeth Bolton-Gillespie, et al. Blood. 2013;121(20):4175-83*P.01 in comparison with untreated normal cells, *P .05 in comparison with untreated CML-CP cellsand

17、 normal cells, and *P 1000ng/ml1000ng/ml是是較為理想的濃度。較為理想的濃度。We Prompt the Applications & Innovations of Laboratory Hematology本實(shí)驗(yàn)室ALL患者Imatinib（格列衛(wèi)）血漿濃度檢測(cè)結(jié)果01000200030004000500060007000200mg/d300mg/d400mg/dN= 8 7 10Imatinib 血漿谷濃度 (ng/ml)We Prompt the Applications & Innovations of Laboratory Hem

18、atologyImatinibImatinib血藥濃度檢測(cè)血藥濃度檢測(cè)治療反應(yīng)不理想，懷疑血藥濃度不理想時(shí)治療反應(yīng)不理想，懷疑血藥濃度不理想時(shí)有較顯著、甚至嚴(yán)重的副作用時(shí)有較顯著、甚至嚴(yán)重的副作用時(shí)懷疑服藥依從性時(shí)懷疑服藥依從性時(shí)有其它合并用藥的影響時(shí)有其它合并用藥的影響時(shí)更換不同廠家藥物，擔(dān)心藥物吸收等有差異時(shí)更換不同廠家藥物，擔(dān)心藥物吸收等有差異時(shí)測(cè)血漿谷濃度，即下次服藥前采集外周血標(biāo)本。測(cè)血漿谷濃度，即下次服藥前采集外周血標(biāo)本。穩(wěn)定劑量服藥穩(wěn)定劑量服藥1 1周后檢測(cè)周后檢測(cè)We Prompt the Applications & Innovations of Laboratory Hematology遺傳多態(tài)性影響遺傳多態(tài)性影響TKIsTKIs療效？療效？We Prompt the Applications & Innovations of Laboratory HematologyAnnette S. Gillings, et al. F