習(xí)題2核酸分子雜交技術(shù)

1、第二章核酸雜交技術(shù)E原位雜交（一）名詞解釋1 .原位雜交2 .核酸分子雜交技術(shù)3 .探針4 .反向點(diǎn)雜交5 .缺口平移標(biāo)記法6 .隨機(jī)引物標(biāo)記法7 .末端標(biāo)記法8 .Southernblot雜交9 .熒光原位雜交10 .菌落雜交（二）選擇題A型題】1 .DNA鏈的Tm值主要取決于核酸分子的（）AG-C含量BA-T含量CA-G含量DA-C含量ETG含量2 .液相雜交是下列哪一種（）ASouthem印跡雜交BNorthem印跡雜交CDot印跡雜交DSlot印跡雜交ERPA實(shí)驗(yàn)3 .研究得最早的核酸分子雜交種類是（）A菌落雜交BSouthern雜交CNorthern雜交D液相雜交4 .Souther

2、n雜交通常是指（）ADNA和RNA雜交BDNA和DNA雜交CRNA和RNA雜交D蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)雜交EDNA和蛋白質(zhì)雜交5 .最容易降解的核酸探針是（）AcDNA探針BdsDNA探針CssDNA探針DgDNA探針E:RNA6 .探針基因芯片技術(shù)的本質(zhì)就是（）A核酸分子雜交技術(shù)B蛋白質(zhì)分子雜交技術(shù)C聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)D基因重組技術(shù)E酶切技術(shù)7 .DN碾針的長(zhǎng)度通常為（）A10002000個(gè)堿基B5001000個(gè)堿基C400500個(gè)堿基D100400個(gè)堿基E.SSCD5燈BECE50燈AE40 .隨機(jī)引物法標(biāo)記探針常用的AGC、T聚合體的數(shù)目是（）A4個(gè)B6個(gè)C8個(gè)D10個(gè)E12個(gè)【X型題】41 .下

3、列哪些是影響DNA復(fù)性的因素（）ADNA濃度BDNA的分子量C溫度D堿基組成EDNA的來(lái)源42 .DNA探針的優(yōu)點(diǎn)有（）A制備方法簡(jiǎn)單BDNA探針易降解CDNA探針的標(biāo)記方法成熟，有多種方法可以選擇D克隆在質(zhì)粒載體中，可以無(wú)限繁殖，取之不盡E單鏈，不存在競(jìng)爭(zhēng)性的自身復(fù)性43 .以下哪些方法可以用于探針的全程標(biāo)記（）ADNA加尾法BDNA切口平移標(biāo)記法C隨機(jī)引物標(biāo)記法E尾端標(biāo)記44 .關(guān)于DNA變性的描述正確的是（）A二級(jí)結(jié)構(gòu)破B一級(jí)結(jié)構(gòu)破壞C黏度降低D生物活性喪失E浮力密度增加45 .以下哪些因素可以使DNA變性（）A增加溶液的濃度B加熱C改變?nèi)芤旱膒H值D有機(jī)溶劑E冷藏46 .預(yù)雜交中，下列

4、能起封閉作用的是（）AssDNABBSAC小牛胸腺DNAD脫脂奶粉EDTT47 .變性的DNA會(huì)發(fā)生哪些理化性質(zhì)的變化（）A粘度下降B沉降速度增加C浮力下降D紫外光吸收增加E紫外光吸收減少48 .下列物質(zhì)適于非放射性探針標(biāo)記的是（）AAKPBACPC生物素D地高辛E熒光素49 .關(guān)于人工合成的寡核昔酸探針，下列描述正確的是（）D末端標(biāo)記B可依賴氨基酸序列推測(cè)其序列A特異性高C分子量小D可用于相似基因順序差異性分析E可用末端轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行5端標(biāo)記50 .通過(guò)哪些措施可以提高雜交反應(yīng)的速度（）A采用大片段探針B少量的反應(yīng)體積C高反應(yīng)溫度D不斷的振搖E大量的反應(yīng)體積51 .關(guān)于切口平移法下述正確的是（）

5、A可標(biāo)記線性DNAB可標(biāo)記松散螺旋DNAC可標(biāo)記超螺旋DNAD可標(biāo)記存在缺口的雙鏈DNAE可標(biāo)記隨機(jī)引物52 .以下哪些方法可以用于從凝膠上轉(zhuǎn)移DNA（）A毛細(xì)轉(zhuǎn)移B真空轉(zhuǎn)移C負(fù)壓轉(zhuǎn)移D電泳轉(zhuǎn)移E冷凍轉(zhuǎn)移53 .關(guān)于隨機(jī)引物法標(biāo)記探針下述正確的是（）A可標(biāo)記單鏈DNAB可標(biāo)記雙鏈RNAC可標(biāo)記單鏈RNAD比活性高達(dá)108cpm/聞DNA以上E常經(jīng)過(guò)SephadexG-50純化才可使用54 .可以采用哪些方法來(lái)標(biāo)記探針（）A雜交標(biāo)記法B切口平移標(biāo)記法C5-末端的標(biāo)記D3-末端的標(biāo)記E化學(xué)法延長(zhǎng)標(biāo)記55 .整個(gè)雜交反應(yīng)主要以下哪些步驟組成（）A預(yù)雜交B雜交C洗脫D固定E轉(zhuǎn)移56 .放射自顯影可以被

6、分為（）A直接放射自顯影B氧化顯影C封閉顯影D間接放射自顯影E固定顯影57 .關(guān)于電轉(zhuǎn)移下列描述正確的是（）A快速、高效B需要特殊設(shè)備C緩沖?用TA豉TBED可產(chǎn)生高溫E常用NC膜作為支持介質(zhì)58 .預(yù)雜交的主要目的是（）A平衡濾膜B封閉非特異性雜交的位置C提高雜交信號(hào)的檢測(cè)效率D便于從濾膜上除去探針E清除用于雜交反應(yīng)檢測(cè)的顯色物質(zhì)59 .關(guān)于非放射性探針標(biāo)記，下列描述正確的是（）A對(duì)人體危害小B需要特殊設(shè)備C可長(zhǎng)時(shí)間使用D靈敏度不如放射性探針E重新雜交新探比較容易失或插入產(chǎn)生，或由于限制性酶切位點(diǎn)改變而導(dǎo)致60 .對(duì)于改變DNA片段長(zhǎng)度的突變，可以由于缺限制性片段長(zhǎng)度改變?？梢酝ㄟ^(guò)哪些方法檢

7、測(cè)（）1.根據(jù)哪三種不同的分類標(biāo)準(zhǔn)可以將雜交分為哪APCR擴(kuò)增BRAPDCSoutherm印跡雜交DNorthern印跡雜交E以上都不是61 .重組DNA的篩選可用核酸分子雜交的方法,常用于檢測(cè)DNA的雜交方法有哪些（）A菌落印跡雜交BNorthern印跡雜交CWestern印跡雜交D原位雜交E斑點(diǎn)雜交62 .關(guān)于RNA探針的描述下列正確的是（）A可用于隨機(jī)引物標(biāo)記B特異性高C靈敏度高D可用非同位素標(biāo)記法標(biāo)記E不易降解63 .下列哪些可以作為核酸探針使用（）AmicroRNAB單鏈DNAC寡核昔酸DmRNAE雙鏈RNA64 .關(guān)于核酸探針的描述下列正確的是（）A可以是DNAB可以是RNAC可用

8、放射性標(biāo)記D可用非放射性標(biāo)記E必須是單鏈核酸（三）問(wèn)答題幾類？2 .簡(jiǎn)述反義核酸技術(shù)的基本原理及其應(yīng)用范圍3 .試述Northernblot雜交的操作步驟？4 .什么是肽核酸？并簡(jiǎn)述其應(yīng)用？5 .請(qǐng)舉例說(shuō)明雜交技術(shù)在臨床檢驗(yàn)科基因診斷方面的應(yīng)用。6 .請(qǐng)敘述雜交探針標(biāo)記方法的種類。7 .簡(jiǎn)述直接放射自顯影的原理。參考答案退火溫度下，能與各種單鏈DNA模板結(jié)合。首先（一）名詞解釋1 .原位雜交：是首先應(yīng)用核酸探針與組織或細(xì)胞中的核酸按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行特異性結(jié)合形成雜交體，然后應(yīng)用組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)方法在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)基因定位或基因表達(dá)的檢測(cè)技術(shù)。2 .核酸分子雜交技術(shù)：?jiǎn)捂湹暮怂岱肿?/p>

9、在合適的條件下，與具有堿基互補(bǔ)序列的異源核酸形成雙鏈雜交體的過(guò)程稱作核酸分子雜交。利用核酸分子雜交檢測(cè)靶序列的一類技術(shù)稱核酸分子雜交技術(shù)。3 .探針：是一段單鏈或雙鏈核甘酸，用放射性核素或非放射性物質(zhì)標(biāo)記其末端或全鏈，可依堿基配對(duì)規(guī)律與具有互補(bǔ)序列的待測(cè)核酸進(jìn)行雜交，以探測(cè)它們的同源程度。這一段標(biāo)記的核甘酸被稱為探針。4 .反向點(diǎn)雜交：是將多種探針固定在同一膜上，同時(shí)參與檢測(cè)的樣品DNA又互不干擾，故能一次性篩查出多種不同的序列，而不是像傳統(tǒng)的雜交法，一次僅能檢測(cè)一個(gè)未知序列。5 .缺口平移標(biāo)記法：該法是利用低濃度DNaseI在DNA雙鏈上隨機(jī)切開(kāi)若干個(gè)切口，然后利用E.coliDNA聚合酶I

10、的5T3外切酶活性和5T3聚合酶活性，使DNA鏈上的核昔酸不斷被切除，而帶放射性核素標(biāo)記的dNTP不斷地被填入缺口位置，從而形成兩條鏈被均勻標(biāo)記的高放射活性的探針。6 .隨機(jī)引物標(biāo)記法：隨機(jī)引物是各種可能序列的寡核昔酸混合物，可以人工合成，也可以使用小牛胸腺DNA的DNaseI降解物。隨機(jī)引物在較低的使雙鏈DNA分子變性成為單鏈，然后退火使隨機(jī)引物結(jié)合于兩條單鏈模板上，當(dāng)反應(yīng)液中存在的4種dNTP中有一種帶放射性核素標(biāo)記時(shí)，在DNA聚合酶催化下合成新的帶標(biāo)記的DNA鏈。反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)純化即可得到標(biāo)記的DNA探針。7 .末端標(biāo)記法：寡核甘酸探針由于較其他類型的探針短，需要采用末端標(biāo)記法。該法需要D

11、NA分子的末端帶有羥基，而人工合成寡核甘酸的5端本身即為羥基。其原理是利用多核昔酸激酶將32PATP分子上7位磷酸基轉(zhuǎn)移至寡核甘酸鏈的5末端，末端標(biāo)記也可在3端進(jìn)行。8 .Southernblot雜交：是研究DNA圖譜的基本技術(shù)，在遺彳診斷、DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價(jià)值。Southern印跡雜交的方法是將標(biāo)本DNA用限制性內(nèi)切酶消化后，經(jīng)瓊脂糖電泳分離各酶切片段，接著，使酶切片段DNA發(fā)生變性并轉(zhuǎn)印到一固相支持物（通常是硝酸纖維素薄膜或尼龍膜）上，經(jīng)固定后和標(biāo)記探針進(jìn)行雜交。這種方法不僅可以檢測(cè)DNA樣品中是否存在某一特定的基因，而且還可以獲得基因片段的大小及酶切位點(diǎn)分布的信

12、息。9 .熒光原位雜交：是一種利用非放射性的熒光信號(hào)對(duì)原位雜交樣本進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)。它將熒光信號(hào)的高靈敏度、安全性，熒光信號(hào)的直觀性和原位雜交的高準(zhǔn)確性結(jié)合起來(lái)，通過(guò)熒光標(biāo)記的DNA探針與待測(cè)樣本的DNA進(jìn)行原位雜交，在熒光顯微鏡下對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行辨別和計(jì)數(shù)，從而對(duì)染色體或基因異常的細(xì)胞、組織樣本進(jìn)行檢測(cè)和診斷，為各種基因相關(guān)疾病的分型、預(yù)前和預(yù)后提供準(zhǔn)確的依據(jù)。根據(jù)雜交核酸分子的種類，可以分為DNA10 .菌落雜交：用于重組細(xì)菌克隆篩選的固相雜交,與DNA雜交，DNA與RNA雜交，RNA與RNA稱菌落雜交，主要步驟包括：菌落平板培養(yǎng)；雜交；根據(jù)雜交探針標(biāo)記的不同，可以分為同位濾膜滅菌后放到細(xì)菌平

13、板上，是菌落粘附到經(jīng)適當(dāng)素雜交和非同位素雜交；根據(jù)雜交介質(zhì)的不同,飽和的吸水紙上；菌斑溶解產(chǎn)生單練的DNA固可以分為液相雜交、固相雜交和原位雜交；其中固定DNA用32P標(biāo)記的探針與菌落進(jìn)行雜交；雜相雜交又可以分為菌落雜交、Southern雜交、交后，洗脫未結(jié)合的探針，將濾膜暴露于X線膠片Northern雜交、點(diǎn)雜交和狹縫雜交。進(jìn)行放射自顯影；將自顯影膠片、濾膜、培養(yǎng)平2.簡(jiǎn)述反義核酸技術(shù)的基本原理及其應(yīng)用范圍板相比較，就可以確反義核酸技術(shù)是近幾年發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的定陽(yáng)性菌落。生物技術(shù)。它是根據(jù)堿基互補(bǔ)的原理，設(shè)計(jì)出能特（二）選擇題【A型題】異地同相應(yīng)靶基因結(jié)合的RNA或DNA,從而影響靶基因的

14、轉(zhuǎn)錄和翻譯，以達(dá)到調(diào)控靶基因表達(dá)的目2.E3.D4.B5.E6.A的。反義核酸技術(shù)包括反義RNA技術(shù)，反義DNA7.C8.B9.C10B11A12技術(shù)及核酶技術(shù)。13A1415A16C17A183.試述Northernblot雜交的操作步驟?19B2021A2223A24RNA的變性瓊脂糖電泳；將硝酸纖維薄25C26C27D28D29B30膜放在含有RNA電泳條帶的凝膠上；轉(zhuǎn)印盤(pán)中31E32A33E34D35的轉(zhuǎn)移緩沖液將逐漸為膠和膜上覆蓋的吸水紙吸36B3738B39A40.B收，從而利用毛細(xì)作用將膠中的變性RNA分子轉(zhuǎn)移到硝酸纖維薄膜上；轉(zhuǎn)印完成后，使RNA41.ABCD42ACD43BC

15、4447ABD48ACDE49ABCD5053ABCD54BCD55ABC5659ABCD60AC61ADE62AD.分CD靛到膜J45.（BCD：的RNA盼不BCD針雜交;經(jīng)放射自顯影或其他檢測(cè)技術(shù)顯示出雜交區(qū)帶。BCD51ABCD52ABD4.什么是肽核酸？并簡(jiǎn)述其應(yīng)用？57ABCD58AB肽核酸是一種全新的DNA類似物，在20世紀(jì)酰月受2-氨基乙基昔氨酸鍵取代了DNA中的戊糖磷（三）問(wèn)答題酸二酯鍵，其余結(jié)構(gòu)與DNA相似。PNA可以通過(guò)1.根據(jù)哪三種不同的分類標(biāo)準(zhǔn)可以將雜交分為哪堿基互補(bǔ)配對(duì)的形式識(shí)別并結(jié)合DNA或RNA序幾類?列，形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)。由于PNA不帶電荷,與DNA和RNA

16、之間不存在靜電斥力，因而結(jié)合的穩(wěn)定性和特異性都大為提高；PNA與DNA或RNA的雜交能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于DNA、DNA或DNA、RNA雜交，表現(xiàn)在很高的雜交穩(wěn)定性、優(yōu)良的特異性，而且不被蛋白酶和核酸酶水解等方面。鑒于上述諸多優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)，PNA被廣泛應(yīng)用在許多高科技領(lǐng)域。如：病原體、遺傳病的檢測(cè)，抗癌、抗病毒反義核酸的研究和應(yīng)用。特別是PNA可取代核酸用于基因芯片的制備，被認(rèn)為是基因芯片的升級(jí)產(chǎn)品。PNA還可用于定量PCR分析。隨著對(duì)PNA研究的不斷深入，PNA將顯示出更大的優(yōu)越性和更為廣闊的應(yīng)用前景。5 .請(qǐng)舉例說(shuō)明雜交技術(shù)在臨床檢驗(yàn)科基因診斷方面的應(yīng)用在臨床檢驗(yàn)科，雜交技術(shù)最常用于基因診斷的例子是

17、鐮狀細(xì)胞貧血病的基因診斷。鐮狀細(xì)胞貧血是一種單基因遺傳性疾病，病因是編碼血紅蛋白的基因發(fā)生點(diǎn)突變導(dǎo)致編碼作連第6位的谷氨酸被繳氨酸取代，表示為?6(A3)谷-繳。在血紅蛋白基因的堿基序列上表現(xiàn)為第6位密碼子GAA突變?yōu)镚TA,也就是在這一位點(diǎn)發(fā)生了A到T的點(diǎn)突變。由于這一突變導(dǎo)致基因內(nèi)部一個(gè)MstII限制性酶切位點(diǎn)丟失，因而針對(duì)這一情況，可以設(shè)計(jì)與B珠蛋白基因雜交的核酸探針。先擴(kuò)增靶片斷，并用MstII消化擴(kuò)增的DNA片斷，電泳分離消化的DNA片斷。將DNA片斷轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素薄膜上，采用Southern雜交技術(shù)檢測(cè)DNA片斷。以此將正常人、攜帶者和患者區(qū)分開(kāi)來(lái)。止匕外，還可以用凝血因子IX基

18、因探針檢測(cè)B型血友病，凝血因子X(jué)W基因探針檢測(cè)A型血友病，用胰島素基因探針檢測(cè)糖尿病，用苯丙氨酸羥化酶基因探針檢測(cè)苯丙酮尿癥。以上都是雜交技術(shù)在臨床檢驗(yàn)科進(jìn)行基因診斷的例子。6 .請(qǐng)敘述雜交探針標(biāo)記方法的種類探針的標(biāo)記方法可分為放射性核素標(biāo)記法和非放射性核素標(biāo)記法兩大類。(1)放射性核素標(biāo)記的探針，靈敏度高、特異性強(qiáng)，主要缺點(diǎn)是容易造成放射性污染，而且放射性核素的半衰期較短，必須隨用隨標(biāo)。標(biāo)記手段主要有：缺口平移法、隨機(jī)引物合成法和末端標(biāo)記法。(2)非放射性核素標(biāo)記法：非放射性核素標(biāo)記法無(wú)放射性污染，探針標(biāo)記后可保存較長(zhǎng)時(shí)間(2年以上),但靈敏度和特異性尚不如核素標(biāo)記。常用的標(biāo)記物有生物素、地高辛配基和辣根過(guò)氧化物酶。標(biāo)記手段類似于放射性核素標(biāo)記。生物素標(biāo)記探針：生物素(biotin)是一種水溶性維生素，可與dUTP的C5位共價(jià)結(jié)合，用其標(biāo)記的dUTP可代替dTTP摻入DNA探針。這種標(biāo)記探針能與抗生物素蛋白(