微生物菌種復壯與保藏

1、微生物發(fā)酵工程微生物發(fā)酵工程2 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏22 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏 復習復習 現(xiàn)代微生物發(fā)酵工程研究的內(nèi)容現(xiàn)代微生物發(fā)酵工程研究的內(nèi)容1菌種的選育和擴大菌種的選育和擴大2最經(jīng)濟地利用營養(yǎng)物最經(jīng)濟地利用營養(yǎng)物，按需確定培養(yǎng)基按需確定培養(yǎng)基3滅菌滅菌4微生物在最優(yōu)條件下產(chǎn)物的大規(guī)模生產(chǎn)微生物在最優(yōu)條件下產(chǎn)物的大規(guī)模生產(chǎn)5發(fā)酵產(chǎn)物的提取純化發(fā)酵產(chǎn)物的提取純化6廢物的處理、再生和生產(chǎn)環(huán)境的凈化廢物的處理、再生和生產(chǎn)環(huán)境的凈化32 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏 2 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏工業(yè)

2、生產(chǎn)常用的微生物及工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物及要求要求菌種的退化與復壯菌種的退化與復壯菌種的保藏菌種的保藏42 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏2.1工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物及要求工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物及要求v 1. 細菌細菌: 分布最廣分布最廣,數(shù)量最多數(shù)量最多,單細胞原核單細胞原核, v 二分裂殖二分裂殖.v 枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌- 淀粉酶、蛋白酶淀粉酶、蛋白酶v 嗜熱乳桿菌嗜熱乳桿菌-乳酸乳酸v 醋酸桿菌醋酸桿菌-醋酸醋酸v 棒狀桿菌棒狀桿菌-氨基酸氨基酸v 短桿菌短桿菌-肌苷酸肌苷酸52 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏v2.酵母菌酵母菌: 單細胞真核單細胞真核

3、, 含糖含糖,偏酸偏酸,腐生腐生,出芽出芽繁殖繁殖, 假絲假絲.v啤酒酵母啤酒酵母-釀酒、細胞色素釀酒、細胞色素C、單細胞蛋、單細胞蛋 v 白、白、 甘油、琥珀酸甘油、琥珀酸v假絲酵母假絲酵母-面包、石油脫蠟、飼料面包、石油脫蠟、飼料v類酵母類酵母-脂肪酶脂肪酶62 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏v3.霉菌霉菌:絲狀真菌絲狀真菌v生產(chǎn)菌種生產(chǎn)菌種:根霉根霉,毛霉毛霉,犁頭霉犁頭霉,紅曲霉紅曲霉,青霉等青霉等v產(chǎn)品產(chǎn)品:酶制劑酶制劑; 抗生素抗生素;有機酸有機酸;甾體激甾體激素素72 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏v4.放線菌放線菌: 原核生物原核生物, 有機

4、質(zhì)豐富的有機質(zhì)豐富的,微堿性微堿性土壤中土壤中, 無形包子或菌絲片斷繁殖無形包子或菌絲片斷繁殖.v生產(chǎn)菌種生產(chǎn)菌種:鏈霉菌屬鏈霉菌屬;小單孢菌屬小單孢菌屬; 諾卡菌屬諾卡菌屬等等v產(chǎn)品產(chǎn)品:鏈霉素鏈霉素; 紅霉素紅霉素; 金霉素金霉素;慶大霉素等慶大霉素等82 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏純凈純凈健壯健壯產(chǎn)量產(chǎn)量質(zhì)量質(zhì)量穩(wěn)定穩(wěn)定2易于控易于控制培養(yǎng)制培養(yǎng)條件條件,周期短周期短3對誘變對誘變劑敏劑敏感感4抗污抗污染力染力強強5原料廉原料廉價價,生長生長迅速迅速,目目的產(chǎn)物的產(chǎn)物產(chǎn)量高產(chǎn)量高6不是不是病原病原菌菌17產(chǎn)物產(chǎn)物分泌分泌型型92 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及

5、其復壯與保藏v菌種退化菌種退化：生產(chǎn)菌種或選育過程中篩選出來的較優(yōu)生產(chǎn)菌種或選育過程中篩選出來的較優(yōu)良的菌株，由于進行一種傳代或保藏之后，群體中良的菌株，由于進行一種傳代或保藏之后，群體中某些生理特征和形態(tài)特征逐漸減退或完全喪失的現(xiàn)某些生理特征和形態(tài)特征逐漸減退或完全喪失的現(xiàn)象。象。102 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏退化的表現(xiàn)產(chǎn)物合成能力下降產(chǎn)量下降發(fā)酵力或糖化力降低孢子數(shù)量變化菌落大小變化生長能力和生長速度變化112 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏v 1.菌種退化的原因菌種退化的原因退化原因基因突變質(zhì)粒的脫落培養(yǎng)和保藏條件的影響連續(xù)移代122 微生物菌

6、種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏v 基因突變導致菌種退化：基因突變導致菌種退化：v v 自發(fā)突變與回復突變自發(fā)突變與回復突變 10-7-10-9低產(chǎn)株低產(chǎn)株低產(chǎn)株低產(chǎn)株高產(chǎn)株高產(chǎn)株132 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏v 質(zhì)粒脫落導致菌種退化：質(zhì)粒脫落導致菌種退化：v控制產(chǎn)量的質(zhì)粒脫落或核內(nèi)控制產(chǎn)量的質(zhì)粒脫落或核內(nèi)DNA和質(zhì)粒復制不一和質(zhì)粒復制不一致。致。v連續(xù)傳代加速退化的發(fā)生：連續(xù)傳代加速退化的發(fā)生：大量低產(chǎn)突變株 傳代傳代個別低產(chǎn)突變株個別低產(chǎn)突變株142 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏v不良的培養(yǎng)條件不良的培養(yǎng)條件如營養(yǎng)成分、溫度濕度、如營養(yǎng)

7、成分、溫度濕度、pH值、值、通氣量等和通氣量等和保藏條件保藏條件如營養(yǎng)、含水量、溫度、如營養(yǎng)、含水量、溫度、氧氣等不僅會誘發(fā)低產(chǎn)基因型出現(xiàn)，而且會造氧氣等不僅會誘發(fā)低產(chǎn)基因型出現(xiàn)，而且會造成低產(chǎn)基因和高產(chǎn)基因細胞的數(shù)量比發(fā)生變化。成低產(chǎn)基因和高產(chǎn)基因細胞的數(shù)量比發(fā)生變化。152 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏延緩退化了解退化的原因分離純化科學保藏減少傳代162 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏v 2.菌種退化的防止菌種退化的防止盡量減少傳代盡量減少傳代172 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏2菌種經(jīng)常純化菌種經(jīng)常純化3創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件創(chuàng)造良好

8、的培養(yǎng)條件4用單核細胞移植傳代用單核細胞移植傳代5采用有效的菌種保藏方法采用有效的菌種保藏方法182 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏v 3.菌種的復壯及其方法菌種的復壯及其方法v復壯原理復壯原理v狹義復壯狹義復壯：從大量退化的菌株中分離篩選到那些仍：從大量退化的菌株中分離篩選到那些仍保持優(yōu)良性狀的個體保持優(yōu)良性狀的個體v廣義復壯廣義復壯：在菌種的生產(chǎn)性能尚未退化前就經(jīng)常有：在菌種的生產(chǎn)性能尚未退化前就經(jīng)常有意識地進行純種分離與生產(chǎn)性能的測試工作意識地進行純種分離與生產(chǎn)性能的測試工作192 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏復壯方法復壯方法v平板劃線平板劃線v稀釋

9、分離稀釋分離v涂布分離涂布分離v毛細管分離毛細管分離 純種分離純種分離v淘汰法淘汰法宿主體宿主體內(nèi)復壯法內(nèi)復壯法低溫等條低溫等條件處理件處理,使部分退使部分退化菌株死亡化菌株死亡對于寄生性對于寄生性微生物的退微生物的退化菌株化菌株,可通可通過接種到的過接種到的昆蟲或動物昆蟲或動物寄主體內(nèi)以寄主體內(nèi)以提高菌株毒提高菌株毒性性202 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏v 2.3菌種的保藏菌種的保藏 一一.菌種保藏菌種保藏v廣義：廣義：在廣泛收集實驗室和生產(chǎn)菌種、菌株的基在廣泛收集實驗室和生產(chǎn)菌種、菌株的基礎(chǔ)上，將它們妥善保管，是指達到不死、不衰、礎(chǔ)上，將它們妥善保管，是指達到不死、不

10、衰、不污染以便于研究、交換和使用的目的。不污染以便于研究、交換和使用的目的。v狹義狹義：防止菌種退化、保持菌種的生活能力和優(yōu)防止菌種退化、保持菌種的生活能力和優(yōu)良的生產(chǎn)性能，盡量減少、推遲負突變、防止死良的生產(chǎn)性能，盡量減少、推遲負突變、防止死亡，并確保不污染雜菌。亡，并確保不污染雜菌。212 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏原理干燥低營養(yǎng)低溫222 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏由于各種微生物的生理，遺傳特性不同，由于各種微生物的生理，遺傳特性不同，適合采用的方法不同適合采用的方法不同方 法有效性有效性通用性通用性簡便性簡便性232 微生物菌種及其復壯與保藏

11、微生物菌種及其復壯與保藏干干燥燥3液體石蠟2凍凍干干4真真空空5液液氮氮6斜面1242 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏 (一).斜面保藏法v特點特點：簡便有效，易變異，退化甚至死：簡便有效，易變異，退化甚至死v 亡。亡。v適合適合：不要求長期保藏的及不適合冷凍干：不要求長期保藏的及不適合冷凍干v 燥的。燥的。v保存期保存期: 3個月個月252 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏影響保藏效果因素營養(yǎng)略貧乏氮源略多糖類少培養(yǎng)基培養(yǎng)基124培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件262 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏v （二）（二） .液體石蠟油保藏法液體石蠟油保藏法v保存

12、期保存期: 2-3年，甚至年，甚至5年傳代一次年傳代一次.v特別適合特別適合:在固體培養(yǎng)基上不能形成孢子的絲狀擔在固體培養(yǎng)基上不能形成孢子的絲狀擔子菌，如大型食用真菌和藥用真菌以及鐮刀菌、子菌，如大型食用真菌和藥用真菌以及鐮刀菌、紅曲霉等紅曲霉等.v注意：保藏溫度，液體石蠟需滅菌和除水注意：保藏溫度，液體石蠟需滅菌和除水272 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏（三）（三）.干燥保藏法干燥保藏法適于適于:能產(chǎn)生孢能產(chǎn)生孢子或芽孢的微子或芽孢的微生物生物 沙土沙土v麥麩麥麩硅膠硅膠適合產(chǎn)孢子適合產(chǎn)孢子的霉菌和放的霉菌和放線菌線菌適合絲狀適合絲狀真菌和酵真菌和酵母菌母菌282 微生物

13、菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏砂土沙土管菌種粒度，除鈣，除鐵及pH 。砂和土混合比例：1：1或3：2。121 間歇滅菌3次，每次1-1.5小時埋沙土干法濕法細胞濃度 108-109 /ml, 0.2-0.3ml/支。抽真空干燥 4小時砂土保藏法砂土保藏法特點特點:經(jīng)濟簡便，保存時間長，不易經(jīng)濟簡便，保存時間長，不易變異。一般變異。一般2-3年年.292 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏:用保護劑制備菌懸液，用保護劑制備菌懸液， 然后將含菌樣然后將含菌樣快速降至冰凍狀態(tài)，減壓抽真空，使冰升華成水蒸快速降至冰凍狀態(tài)，減壓抽真空，使冰升華成水蒸汽排出，從而使含菌樣脫水干燥

14、，汽排出，從而使含菌樣脫水干燥， 并在真空狀態(tài)立并在真空狀態(tài)立即密封瓶口隔絕空氣，造成無氧的真空環(huán)境，即密封瓶口隔絕空氣，造成無氧的真空環(huán)境， 然后然后置于低溫下保存。置于低溫下保存。v特點特點：不易發(fā)生變異，不易發(fā)生變異，5-10年。需要凍干機。年。需要凍干機。v適用適用：除了一些不產(chǎn)孢子的絲狀真菌外。除了一些不產(chǎn)孢子的絲狀真菌外。v（四）（四）. 冷凍干燥保藏法冷凍干燥保藏法302 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏312 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏322 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏v1.安剖瓶安剖瓶：2% 鹽酸浸泡鹽酸浸泡7-10

15、h。 裝入標簽，裝入標簽，塞上棉花，滅菌備用。塞上棉花，滅菌備用。v2保護劑保護劑：選擇適合的種類選擇適合的種類。 332 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏保護劑減少細胞的損傷和死亡維持細胞的構(gòu)型重新培養(yǎng)適宜溶解342 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏成長良好，健壯無污染穩(wěn)定期高濃度菌種3.菌種制備菌種制備352 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏v預凍：預凍：防止泡沫溢出，凍結(jié)，升華。防止泡沫溢出，凍結(jié)，升華。v 不低于不低于-20， 30min ， 疏松狀態(tài)疏松狀態(tài) v 時，轉(zhuǎn)入室溫抽時，轉(zhuǎn)入室溫抽1h， 融封，融封， 檢測真檢測真v 空度，空

16、度，4，避光。避光。4.預凍和真空干燥預凍和真空干燥362 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏v v v 凍干物呈酥塊狀或松散片狀凍干物呈酥塊狀或松散片狀v v 真空度接近空載時的最高值真空度接近空載時的最高值v v 以等量水作對照以等量水作對照v 干燥終止：干燥終止：372 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏v恢復培養(yǎng)恢復培養(yǎng)：室溫下平衡后，加入最適培養(yǎng)基，室溫下平衡后，加入最適培養(yǎng)基，控制溶化速度，操作靠近火焰?？刂迫芑俣?，操作靠近火焰。v避免：避免：樣品逸散，污染樣品逸散，污染。382 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏v常溫下直接真空干燥。設

17、備簡單，操作方常溫下直接真空干燥。設備簡單，操作方v 便。便。v適于適于: 預凍后易受凍傷的菌株預凍后易受凍傷的菌株（五）真空干燥法 392 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏v以甘油、二甲基亞砜等作保護劑，在液氮超低溫下以甘油、二甲基亞砜等作保護劑，在液氮超低溫下保藏的方法。保藏的方法。v是防止退化的最有效的方法是防止退化的最有效的方法。v適合于各種微生物的保藏適合于各種微生物的保藏。v原理原理：菌種細胞從常溫過渡到低溫，并在降到低溫菌種細胞從常溫過渡到低溫，并在降到低溫之前，使細胞內(nèi)的自由水通過細胞膜外滲出來之前，使細胞內(nèi)的自由水通過細胞膜外滲出來。v（六）（六）.液氮超低溫

18、法液氮超低溫法402 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏v保護劑：甘油，二甲基亞砜，糊精，血清蛋保護劑：甘油，二甲基亞砜，糊精，血清蛋白等。白等。v v不同微生物的保護劑不同，需實驗確定。不同微生物的保護劑不同，需實驗確定。v甘油甘油10-20%，二甲基亞砜，二甲基亞砜5-10%v安剖瓶的選擇：安剖瓶的選擇：95料或料或GG17的玻璃管制的玻璃管制成。成。液氮超低溫法液氮超低溫法412 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏v菌種制備和凍結(jié)保藏菌種制備和凍結(jié)保藏：孢子或菌絲體。：孢子或菌絲體。-35 以前以前控制降溫速度?？刂平禍厮俣?。v恢復培養(yǎng)恢復培養(yǎng):38-40 水中水中v注意防護注意防護：防凍，防爆。：防凍，防爆。422 微生物菌種及其復壯與保藏微生物菌種及其復壯與保藏v良好的培養(yǎng)基，新鮮培養(yǎng)的菌種，健良好的培養(yǎng)基，新鮮培養(yǎng)的菌種，健壯的菌體，豐滿的孢子，適宜的菌齡壯的菌體，豐滿的孢