聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

1、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction ,PCR) 目的目的 了解DNA特異性片段體外擴(kuò)增的基本原理，掌握聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的基本操作方法?；驹砘驹韑在模板、引物、在模板、引物、4種種dNTP和耐熱和耐熱DNA聚合酶聚合酶存在的條件下，特異擴(kuò)增位于兩段已知序列之存在的條件下，特異擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的間的DNA區(qū)段的酶促合成反應(yīng)。區(qū)段的酶促合成反應(yīng)?；静襟E基本步驟 1. 變性：加熱使雙鏈變性：加熱使雙鏈DNA變?yōu)閱捂溩優(yōu)閱捂?2. 退火：降溫使引物和互補(bǔ)模板在局部退火：降溫使引物和互補(bǔ)模板在局部 形成雜交鏈形成雜交鏈 3. 延伸：耐熱延伸：耐熱DNA聚合酶

2、按聚合酶按53方向催化方向催化以引物為起始點(diǎn)的延伸反應(yīng)以引物為起始點(diǎn)的延伸反應(yīng)l加熱或在堿性條件下可以使加熱或在堿性條件下可以使DNA雙螺旋的氫鍵雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈斷裂，形成單鏈DNA，稱(chēng)之為，稱(chēng)之為DNA變性變性。l去掉變性條件后，單鏈去掉變性條件后，單鏈DNA可以重新結(jié)合，再可以重新結(jié)合，再形成雙鏈，稱(chēng)之為形成雙鏈，稱(chēng)之為DNA復(fù)性復(fù)性，又叫，又叫退火退火。lPCR反應(yīng)中退火指引物與模板的結(jié)合。反應(yīng)中退火指引物與模板的結(jié)合。l退火溫度太高退火溫度太高, 不能很好地復(fù)性不能很好地復(fù)性 太低太低, 產(chǎn)生非特異性復(fù)性產(chǎn)生非特異性復(fù)性l退火溫度通常比理論熔解溫度低退火溫度通常比理論熔解溫度

3、低 3-5lDNA雙鏈解離一半時(shí)的溫度稱(chēng)為熔解溫度雙鏈解離一半時(shí)的溫度稱(chēng)為熔解溫度(Tm)。PCR引物的設(shè)計(jì)引物的設(shè)計(jì) 1. 1. 引物設(shè)計(jì)的原則引物設(shè)計(jì)的原則 2. 2. 引物設(shè)計(jì)的方法引物設(shè)計(jì)的方法 （一）PCR引物設(shè)計(jì)原則1、引物長(zhǎng)度一般為1530個(gè)核苷酸。引物過(guò)短會(huì)使PCR的特異性降低，過(guò)長(zhǎng)會(huì)提高相應(yīng)的退火溫度，并使延伸溫度超過(guò)Taq DNA聚合酶的最適溫度74,亦會(huì)影響產(chǎn)物的生成，且合成引物的成本增加。2、引物中的堿基盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤，嘧啶的堆積現(xiàn)象。尤其是引物的3端不應(yīng)有連續(xù)3個(gè)G和C。否則會(huì)使 引物在模板的G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤配對(duì)。引物中G+C的含量 在4555%左右

4、。設(shè)計(jì)引物時(shí)要考慮3端和5端 引物具有相似的Tm值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。3、引物自身內(nèi)部不應(yīng)存在互補(bǔ)序列以避免折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。按經(jīng)驗(yàn)，引物自身存在的連續(xù)互補(bǔ)序列，一般不超過(guò)3bp。4、兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其應(yīng)避免3端的互補(bǔ)重疊。5、引物的堿基序列不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域有同源性。引物的堿基序列不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域有同源性。尤其是尤其是引物引物3末端連續(xù)末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。6、引物引物3端堿基是引發(fā)延伸的起點(diǎn)，因此一定要與模板端堿基是引發(fā)延伸的起點(diǎn)，因此一定要與模板

5、DNA配對(duì)配對(duì)。引物引物3端的最佳堿基選擇是端的最佳堿基選擇是G和和C。因?yàn)?。因?yàn)樗鼈冃纬傻膲A基配對(duì)比較穩(wěn)定。它們形成的堿基配對(duì)比較穩(wěn)定。7、引物的引物的5端可以修飾，端可以修飾，如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變?nèi)绺郊酉拗泼肝稽c(diǎn)，引入突變位點(diǎn)。位點(diǎn)。lPrimer5lOligo 6（二）引物設(shè)計(jì)的方法PCR反應(yīng)五要素反應(yīng)五要素1 模板2 引物3 酶4 dNTP5 bufferPCR反應(yīng)成分1.PCR反應(yīng)的緩沖液：反應(yīng)的緩沖液：1050mmol/L Tris-Cl 緩沖液，緩沖液，72 時(shí)時(shí)pH7.2,調(diào)節(jié)反調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的應(yīng)體系的pH值，使值，使Taq DNA聚合酶的作用環(huán)境維持聚合酶的作用環(huán)境維持偏

6、堿性。偏堿性。50mmol/L的的KCl可促進(jìn)引物退火，大于此濃度將會(huì)抑可促進(jìn)引物退火，大于此濃度將會(huì)抑制制TaqDNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。鎂離子濃度：鎂離子濃度：1.5mmol/L Taq DNA聚合酶活性需要聚合酶活性需要Mg2+。Mg2+ 濃度過(guò)低，會(huì)濃度過(guò)低，會(huì)顯著降低酶活性。顯著降低酶活性。Mg2+濃度過(guò)高又使酶催化非特異性濃度過(guò)高又使酶催化非特異性擴(kuò)增增強(qiáng)。擴(kuò)增增強(qiáng)。l2. dNTPs 濃度：濃度：20200mol/L dNTP濃度高可加快反應(yīng)速度，同時(shí)還可增加濃度高可加快反應(yīng)速度，同時(shí)還可增加堿基的錯(cuò)誤摻入率和實(shí)驗(yàn)成本。反之，低濃度堿基的錯(cuò)誤摻入率和實(shí)驗(yàn)成本。反之，低濃度

7、的的dNTP會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)速度的下降，但可提高反會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)速度的下降，但可提高反應(yīng)的特異性及實(shí)驗(yàn)的精確性。應(yīng)的特異性及實(shí)驗(yàn)的精確性。3.耐熱耐熱DNA聚合酶：聚合酶：0.55 u 在在PCR反應(yīng)中，反應(yīng)中，DNA聚合酶是最關(guān)鍵的因素之一。聚合酶是最關(guān)鍵的因素之一。PCR發(fā)明的初期使用的發(fā)明的初期使用的DNA聚合酶是聚合酶是Klenow片段、片段、T4DNA聚合酶和聚合酶和T7DNA聚合酶，它們因?qū)岬姆€(wěn)定聚合酶，它們因?qū)岬姆€(wěn)定性差而未得到廣泛應(yīng)用。直到耐熱的性差而未得到廣泛應(yīng)用。直到耐熱的DNA聚合酶聚合酶(Taq DNA polymerase) 應(yīng)用于應(yīng)用于PCR反應(yīng)，才使這一技術(shù)反應(yīng)，才使這

8、一技術(shù)得到迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用。得到迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用。4.引物：引物：0.10.5 mol/L PCR 反應(yīng)引物濃度為反應(yīng)引物濃度為0.10.5mol/L。如此如此過(guò)量的引物才能確保模板過(guò)量的引物才能確保模板DNA一旦變性就與一旦變性就與引物退火，而不能與其自身退火。但引物濃度引物退火，而不能與其自身退火。但引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，且可增偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的幾率，降低擴(kuò)增效率。加引物之間形成二聚體的幾率，降低擴(kuò)增效率。但如果該比例太低，但如果該比例太低，PCR效率也會(huì)降低。效率也會(huì)降低。 5. 模板模板在一定范圍內(nèi)在一定范圍內(nèi)PCR產(chǎn)量隨模板濃度的升高而顯產(chǎn)量隨模板濃度的升高而顯著升高，但模板濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異著升高，但模板濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。為保證